Штамм бактерий BacILLUS Sp.-продуцент @ -циклодекстринтрансферазы Советский патент 1992 года по МПК C12N9/10 C12N1/20 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к новому штамму - продуценту циклодекстринглюканотрансферазы (а-1,4-глюкан-4-гликозилтрансфераза цик- лизующая, КФ 2.4.1.19; ЦГТ-аза), фермента, который катализирует образование цикло- декстринов из глюканов, перенося часть цепи 1,4-глюкана на нередуцирующий конец собственной молекулы и удаляя таким образом часть молекулы глюкана в форме кольца.

Известен штамм Bacillus clrculans, селектирующий ЦГТ-азу, которая преимущественно образует / -циклодекстрин.

Существенный недостаток этого штамма в том. что он, кроме ЦГТ-азы, продуцирует протеолитические ферменты, которые значительно снижают активность ЦГТ-азы, гидролизуя ее. При использовании ЦГТ-азы, продуцируемой В. clrculans, необходимо избавляться от протеаз, что является дорогим и трудоемким процессом.

Известны пятьалкалофильных штаммов Bacillus sp. 38-2. Bacillus sp. 135, Bacillus sp. 169, Bacillus sp. 13. Bacillus sp. 17-1, a также штамм В. megaterium T5. продуцирующие ЦГТ-азы, образующие преимущественно р-циклодекстрин.

Недостатком известных штаммов является то, что они обладают невысокой продуктивностью по ЦГТ-азе. При этом они способны к секреции ЦГТ-азы только на сложных питательных средах, содержащих большое количество белковых компонентов, таких как пептон, дрожжевой экстракт (автолизат), концентрированный настой зерен кукурузы и т. д., что повышает стоимость процесса ферментации.

Целью изобретения является получение нового алкалофильного штамма, обладающего высокой продуктивностью по ЦГТ-азе, преимущественно образующей /3-циклодекстрин.

(Л

С

XI

со оо

00

ел

ND

Предлагаемый штамм-Bacillus sp. 6.6.3 депонирован во Всесоюзной коллекции микроорганизмов под номером ВКМ Б- 1793Д, продуцирует ЦГТ-азу, преимущественно образующую ft -циклодекстрин, на минеральной среде с небольшим количеством белковых добавок в качестве источников витаминов, с высокой активностью.

Штамм выделен из почвы Дуванского района Башкирии.

Культурально-морфологические признаки. Единичные, иногда в парах, палочки шириной 0,5-0,7 мкм, длиной 2-5 мкм. Окраска по Граму - вариабельна, клетки обра- зуют споры в спорангии - центральная или терминальная, клетки подвижны. Штамм при росте на мясопентонном агаре через 48 ч при 37°С образует единичные колонии с четким, ровным краем, размером в диамет- ре 3-6 мм, поверхность колонии гладкая, колония полупрозрачная, белесая. При росте на картофельно-глюкозном агаре (рН 9,0) штамм образует через 48 ч при 37°С единичные колонии с ровным краем, размером 4-9 мм, поверхность колонии гладкая консистенция вязкая (на МПА маслоподобная), профиль колонии выпуклый (на МПА плоский), колония полупрозрачная, матово-белесая.

Биохимические признаки.

Реакция Фогес-Проскауэра отрицательная; каталазная активность положительная; анаэробный рост слабый; штамм образует кислоту при росте на углеводах - глюкозе, ксилозе, рибозе, мальтозе, лактозе, арабинозе, раффинозе, мелицитозе, рамнозе, галактозе, сахарозе и спирте-инозите; газ из выше приведенных углеводов и спирта не образует; гидролизует крахмал; очень слабо гидролизует казеин и желатину; цитрат и пропионат не утилизирует; тирозин и фенилаланин не разлагает; восстанавливает нитраты; реакция на лецитиназу отсутствует; индол не образует; дегидрокси- ацетон не образует; рост в питательном бульоне с 5 и 7% NaCt отсутствует; условия роста: рН среды 7,0-10,0, температура 20- 46°С. Штамм 6.6.3(ВКМ В-1793Д) продуци- рует на жидких средах ЦГТ-азу, образующую преимущественно / -циклодекстрин. Условия хранения: периодически выращиваемая культура инкубируется на картофельно-глюкозном агаре рН 9,0, при температуре 37-40°С в течение 4 сут, хранится на этой же среде при 4°С в течение 6 мес.. ,,

Штамм Bacillus Sp. 6.6.3 {ВКМ В - 1793Д) был испытан в лабораторных условиях.

П р и м е р 1, Инокулят штамма Bacillus sp. 6.6.3 (ВКМ В-1793Д), выращенный на чашках Петри с картофельно-глюкозным агаром (рН 9,0) в течение 7 сут при 37°С, смывают стерильной водой из расчета 10 мл воды на одну чашку и вносят в колбы объемом 500 мл, содержащие по 100 мл стерильных сред.

Состав сред приведен в табл. 1 (соотношение инокулята и питательной среды 1:10, культивирование осуществляют на качалках со скоростью встряхивания 180 мин , температура выращивания 37°С).

Через каждые 12 ч культивирования отбирают пробу культуральной жидкости в которой определяют ЦГТ-азу известным методом.

Динамика накопления ЦГТ -азы в культуральной жидкости приведена в табл. 2, В пробах, отобранных через 48 и 96 ч культивирования, измеряют протеазную активность известным методом. Штамм Bacillus sp. 6.6.3 на средах А, В и С не продуцирует протеазы.

Пример 2. Специфичность ЦГТ-азы определяют по продуктам реакции этого фермента с крахмалом. Анализ продуктов ферментативной конверсии крахмала проводят методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Условия реакции: 2 мл 3%-ного раствора крахмала в 0,05 М трис-НС буфере, рН 8,0 смешивают с 1 мл раствора фермента, смесь помещают в термостат на 30 мин при температуре 40°С. Реакцию останавливают изгревом смеси до 100°С в течение 3 мин. Условия хроматогра- фирования: элюент- 65%-ный водный аце- тонитрил, колонка для разделения продуктов реакции SEPARON NH2, детектор -дифференциальный рефрактометр, скорость подачи элюента 0,5 мл/мин, хроматог- рамма продуктов реакции представлена на чертеже. Соотношение продуктов конверсии крахмала ЦГТ-азой штамма Bacillus sp. 6.6.3 (В КМ Б-1793Д) составляет, %: а -циклодекстрин 6,0;/ -циклодекстрин 83,0; у-цик- лодекстрин 11,0. В реакцию вступило 92% крахмала. В качестве раствора фермента используется культуральная жидкость выращенного на среде С штамма 6.6.3, разведенная в 5 раз буфером 0,05 М трис- HCt, рН 8,0.

Таким образом, штамм Bacillus sp. 6.6.3 (ВКМ В-1793) обладает более высокой продуктивностью по ЦГТ-азе на сложных питательных средах, чем известные алкалофильные штаммы, а также, продуцирует ЦГТ-азу в значительных количествах

(80% от максимальной продуктивности) на среде с небольшим количеством белковых добавок в качестве источников витаминов, что позволяет экономить дорогие компоненты питательной среды: пептон и дрожжевой автолизат экстракт в 80 раз и концентрированный настой зерна кукурузы в 800 раз с учетом снижения активности культуры при выращивании на этой среде. Кроме того, штамм 6.6.3 не обладает проте- азнрй активностью, культура продуцирует

0

ЦГТ-азу, образующую преимущественно циклодекстрин, который имеет наибольшее применение в фармакологии, медицине, пищевой промышленности и других областях индустрии.

Формула изобретения Штамм бактерий Bacillus sp. В KM B1793Д - продуцент /J-циклодекстринтранс

феразы.

Использование: биотехнология. Сущность изобретения: штамм Bacillus sp. BKM В-1973Д выделен из почвы Дуванского района Башкирии. Продуцирует / -циклодекст- ринглюканотрансферазу (ЦГТ-азу) на минеральных средах с небольшим количеством белковых добавок, используемых в качестве источников витаминов. Активность ЦГТ-азы в культуральной жидкости 30,5- 38,0 ед./л после 60-72 ч культивирования. 2 табл., 1 ил.

Примечание. Вода дистиллированная до 1 л доводится во всех средах после навески

компонентов.

Таблица 1

Таблица 2