ШТАММ БАКТЕРИЙ BACILLUS LICHENIFORMIS - ПРОДУЦЕНТ КОМПЛЕКСА ТЕРМОСТАБИЛЬНЫХ АМИЛОЛИТИЧЕСКИХ И ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ Российский патент 2002 года по МПК C12N1/20 C12N9/28 C12N9/44 C12N9/56 C12N1/20 C12R1/10 

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к получению комплекса амилолитических и протеолитических ферментов, и может быть использовано в микробиологической промышленности.

Амилолитические ферменты широко используются для разжижения или превращения крахмала и крахмалосодержащего растительного сырья в такие продукты, как мальтодекстрины, сахарные сиропы, декстроза, мальтоза, глюкоза и др.

При промышленном использовании амилолитических ферментов необходимы термостабильные ферменты, что обусловлено их способностью вести гидролиз сырья при высоких температурах - 80-100^oС, что очень важно с точки зрения ведения процесса клейстеризации крахмала. При этом совмещаются два процесса: клейстеризация крахмала и его ферментативный гидролиз. Значительно снижается стоимость ферментативного процесса за счет сокращения дозировки фермента и продолжительности гидролиза крахмала, более качественно ведется подготовка сырья к развариванию - обеспечивается высокая степень гидролиза крахмала и, как следствие этого, увеличивается выход целевого продукта.

Глубокий гидролиз крахмала необходим в спиртовой, крахмало-паточной, текстильной и других отраслях биотехнологии. Обычно гидролиз осуществляют в две стадии: на первой стадии проводят обработку альфа-амилазой при температуре 65-70^oС и рН 6,0-6,5, затем раствор охлаждают до 58^oС, подкисляют до рН 4,7 и добавляют глюкоамилазу или бета-амилазу. В результате совместного действия ферментов альфа-амилазы и глюкоамилазы степень гидролиза крахмала достигает 97-98%. Однако, несмотря на высокую степень деструкции крахмала, процесс ферментативной обработки все же нуждается в совершенствовании.

Недостатком описанного процесса амилолиза является неполнота конверсии сырья, т. к. в молекуле крахмала часть гликозидных связей, а именно альфа-1,6-связи, остается не доступной действию указанных ферментов. Кроме того, снижение температуры гидролизуемого материала и увеличение концентрации ионов при изменении рН, необходимые перед второй стадией ферментативной обработки, приводят соответственно к непродуктивным энергетическим затратам и затруднениям при очистке продукта гидролиза.

Для устранения указанных недостатков необходимо использование препаратов, содержащих комплекс гидролитических ферментов различной специфичности (естественных или созданных искусственно), работающих при одинаковых параметрах, при этом в комплексе должен присутствовать один из деветвящих ферментов (пуллуланаза или бета-амилаза), способных гидролизовать альфа-1,6-гликозидные связи в молекуле крахмала и мальтоолигодекстринов.

Эффективность процесса биоконверсии: растительного сырья значительно возрастает при использовании ферментативного комплекса, содержащего, кроме амилолитических ферментов, активные целлюлазы и протеазы. Так, при переработке крахмалистого сырья целесообразно гидролизовать не только крахмал, но и клеточные стенки растительного сырья, а также оболочки и пленки, что обеспечит лучший контакт крахмала с амилолитическими ферментами, повысит степень использования сухих веществ сырья и тем самым увеличит выход конечного продукта. Наличие же в комплексе ферментов протеолитического действия позволяет гидролизовать белки, пептоны и полипептиды сырья до аминокислот, являющихся ценным азотистым питанием для дрожжей.

Реализация биотехнологии применения протеолитических ферментов совместно с амилолитическими в производстве этанола позволяет сократить длительность спиртового брожения на 40% с одновременным увеличением выхода этанола на 2,8%, перерабатывать высококонцентрированное зерновое сусло (1).

Полезно наличие в ферментных препаратах глюканазы, которая интенсифицирует процесс гидролиза растительного сырья и способствует повышению выхода спирта за счет гидролиза других полисахаридов сырья.

Для подавляющего большинства продуцентов амилолитических ферментов характерен предпочтительный биосинтез одного из ферментов. Способность к образованию комплекса внеклекточных амилолитических ферментов, особенно термостабильных, обнаруживается очень редко. В этой связи можно назвать ряд термостабильных анаэробов из рода Clostridium.

Известен штамм Clostridium thermohidrosulfuricum, синтезирующий комплекс, содержащий термостабильные пуллуланазу и глюкоамилазу (2).

В литературе описано несколько анаэробных термофилов из рода Clostridium, осуществляющих биосинтез амилазы и пуллуланазы (3) либо альфа-амилазы и глюкоамилазы, активных при высокой температуре (4).

Однако сложность культивирования анаэробных бактерий в заводских условиях делает этот способ получения препарата амилолитических ферментов практически непригодным.

Из литературных данных известно, что наиболее термостабильными гидролитическими ферментами, такими как альфа-амилазы, пуллуланазы, а в ряде случаев и протеазы являются ферменты, продуцируемые термофильными бактериями Bacillus licheniformis.

Известен аэробный термофил Bacillus licheniformis, который при культивировании на среде с кукурузной мукой оптимального для получения продукта состава синтезирует комплекс внеклеточных амилолитических ферментов - альфа-амилазу и пуллуланазу в количествах 2 ед/мл и 0,68 ед/л соответственно (5). Недостатком данного штамма является низкая активность продуцируемых ферментов, узкий спектр действия комплекса и длительность процесса культивирования (144 часа).

Наиболее близким аналогом по совокупности существенных признаков и достигаемому результату является штамм Bacillus licheniformis (депонирован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ В-6508), образующий комплекс амилолитических ферментов на среде состава, г/л: кукурузная мука -160,0; кормовые дрожжи - 30,0; NaH₂PO₄ - 3,0; MgSO₄ - 20,0; CaCO₃ - 2,5; pH 7,2-7,4, обработанной последовательно альфа-амилазой и глюкоамилазой (6). Комплекс содержит термостабильную альфа-амилазу (до 69,0 ед/мл), а также, как нами было определено, обладает пуллуланазной (0,9 ед/л) и протеазной (4,7 ед/мл) активностями.

Недостатками штамма являются сравнительно низкий уровень активностей, а также высокая стоимость культивирования из-за применения высококонцентрированной питательной среды и продолжительности процесса.

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является создание термостабильного штамма, обеспечивающего синтез высокоактивного комплекса гидролитических ферментов разной специфичности, активных при высокой температуре и работающих в близких условиях.

Технический результат, который может быть получен при осуществлении изобретения, заключается в получении штамма, обладающего повышенной способностью синтеза комплекса термостабильных амилолитических и протеолитических ферментов, обладающего также бета-глюканазной и ламинариназной активностями.

Сущность объекта изобретения - штамм Bacillus licheniformis ВКМ В-2184 Д - продуцент комплекса термостабильных амилолитических и протеолитических ферментов.

Новый штамм Bacillus licheniformis - 78 выделен селекционным путем при изучении естественной изменчивости штамма ВКПМ - 6508 с применением методов эффективного мутагенеза ультрафиолетовым облучением и обработкой нитрозогуанидином.

Полученный штамм бактерий Bacillus licheniformis-78 депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов под N В-2184 Д.

Характеристика штамма
Культурально-морфологические признаки. Клетки представляют собой грамположительные, одиночные подвижные палочки размером 0,6-0,8 и 0,2-0,3 мк, спорообразующие. В первые часы роста (логарифмическая фаза) образуются цепочки из 2-3 клеток более вытянутой формы, к 48-56 часам роста (стационарная фаза) цепочки распадаются, клетки утолщаются, появляются споры, имеющие центральное положение и овальную форму.

Мясопептонный агар (t 40^oC, 24 часа). Штамм дает обильный рост, колонии неправильной формы с приподнятым центром, слизистые, гладкие, непрозрачные, 2-5 мм в диаметре с ровными краями, в начале роста - кремовые, затем - постепенно розовеющие.

Мясопептонный бульон (t 40^oC, 24 часа). Обильный рост клеток, раствор становится мутным, к 24 часам роста появляется кремовато-розовый оттенок.

Агаризованная среда с казеином или микробными клетками. Обильный рост и образование зон гидролиза вокруг колоний. Колонии неправильной формы, слизистые, гладкие, непрозрачные, с приподнятым центром, 2-6 мм в диаметре, с ровными краями. К 72 часам роста колонии имеют коричневато-бордовый цвет.

Физиолого-биохимические свойства.

Аэроб.

Температурный диапазон роста - 18-45^oС.

Оптимальная температура роста - 40^oС.

Растет при значениях рН среды - 5,0 - 10,0.

Оптимум рН роста - 40^oС.

Желатин разжижает. Крахмал и казеин быстро гидролизует. Восстанавливает лакмусовое молоко.

Нитраты восстанавливает до нитритов. Образует тирозиназу (каталазоположительный), образует сероводород. Вызывает гемолиз.

Сбраживает с образованием кислоты арабинозу, ксилозу, фруктозу, сахарозу, трегалозу, мальтозу, раффинозу, маннозу, маннит, сорбит, глицерин, декстрин, гликоген без выделения газа, глюкозу ферментирует анаэробно, утилизирует лимонную кислоту.

Штамм способен расти на средах с аммонийными солями в качестве единственного источника азота, а также на среде, содержащей дрожжевые клетки ( прессованные пекарские дрожжи, кормовые дрожжи или БВК), как источник углеродного и азотного питания.

Основной метод хранения штамма - метод лиофилизации.

Штамм может храниться без потери полезных свойств при комнатной температуре на косяках с агаризованной средой следующего состава: мясо-пептонный бульон и солодовое сусло (7 Б) в соотношении 1: 1; растворимый крахмал 1,0%; агар-агар - 2,5%; pH среды 7,5, не менее 6 месяцев с обязательным пересевом не реже одного раза в 2 месяца.

На основании указанных свойств штамм ВКМ В-2184 идентифицирован по Определителю Берги (7) как штамм Bacillus licheniformis.

Вид Bacillus licheniformis, к которому отнесен штамм, отсутствует в списках патогенных бактерий по Положению минздрава и в списках патогенных бактерий в Official Journal of the European Communities NC 217/3237, 24.08.92.

Штамм Bacillus licheniformis ВКМ В-2184 Д отличается от наиболее близкого к нему штамма Bacillus licheniformis ВКПМ В-6508 большей пигментированностью колоний (от кремовато-розового до коричневато-бордового) при росте на агаризованных питательных средах. Модификации в результате мутаций 3 OS рибосомы штамма Вас. licheniformis ВКПМ В-6508 привели к изменению уровня синтеза основных ферментов - альфа-амилазы, пуллуланазы и протеазы, а также способствовали продуцированию сопутствующих ферментов - бета-глюканазы и бета-ламинариназы.

Штамм Bacillus licheniformis BKM B-2184 продуцирует не менее пяти внеклеточных ферментов, основными из которых являются термостабильные альфа-амилаза, пуллуланаза, протеаза, а также сопутствующие ферменты - бета-глюканаза и бета-ламинариназа. Ферменты активны при близких значениях рН и температуры.

Для роста культуры и биосинтеза гидролитических ферментов источником углерода могут служить крахмал, гидролизованный крахмал, мальтоза, кукурузная и другая зерновая мука или же их экстракты, дрожжевые клетки. Источниками азота служат пептон, дрожжевой экстракт, дрожжевые клетки, мочевина, аммонийный азот.

Культивирование штамма осуществляют в аэробных условиях при температуре 40^oС в течение 80-100 часов, рН среды 7,5-7,8. Каждые 24 часа, начиная с 48 часов роста, отбирают пробы, в которых определяют спообность культуральной жидкости гидролизовать крахмал, пуллулан, казеин, бета-глюкан, ламинарин.

Активность альфа-амилазы в культуральной жидкости определяют по способности катализировать гидролиз крахмала до декстринов различной молекулярной массы (8). За единицу активности принимают такое количество ферментов, которое в течение 10 минут при 90^oС и рН 7,5 катализирует гидролиз 1 г растворимого крахмала, что составляет 30% от введенного в реакцию.

Активность пуллуланазы определяют и по восстанавливающим сахарам, образующимся при гидролизе пуллалана (линейного полисахарида, состоящего из мальтотриозных единиц, соединенных альфа-1,6-гликозидными связями). За единицу активности принимается такое количество фермента, которое при 60^oС, рН 6,0 гидролизует пуллалан со скоростью, соответствующей образованию восстанавливающих групп, эквивалентных 1 мкмолю глюкозы в минуту, определяемых методом Сомоджи-Нельсона (9).

Протеолитическую активность определяют по методу Каверзневой, используя в качестве субстрата 2%-ный раствор казеина (10). За единицу протеолитической активности (ПЕ) принято такое количество фермента, которое за 1 минуту при 30^oС катализирует переход в неосаждаемое ТХУ состояние такого количества казеина, которое содержит 1 мкмоль тирозина.

Бета-глюканазную активность определяют по способности образовывать редуцирующие сахара из ячменного бета-глюкана с последующим определением образовавшихся сахаров по методу Сомоджи-Нельсона (9). За единицу активности принимают количество фермента, способного в минуту в стандартных условиях при температуре 30 град. и рH 5,5 получить из глюкана такое количество олигосахаридов, которое по восстанавливающей способности соответствует 1 мкмолю глюкозы.

Активность бета-ламинариназы определяют аналогичным способом, но в качестве субстрата используют ламинарин.

Ферментативный комплекс может применяться в виде культуральной жидкости при использовании его в процессах ферментативной обработки в производстве спирта или выделен известными биохимическими методами, например осаждением этанолом из ультрафильтрата культуральной жидкости. При необходимости из комплекса могут быть выделены отдельные ферменты традиционными методами.

Благодаря наличию пуллуланазной активности комплекс осуществляет гидролиз не только альфа-1,4-, но и альфа-1,6- гликозидных связей в молекуле крахмала и декстринов с образованием глюкозы и низкомолекулярных мальтоолигосахаридов.

Альфа-амилаза комплекса активна в диапазоне значений рН 5,0-10,0 с двумя заметными пиками активности при рН 7,5 и 8,5; при температуре 30-105^oС с оптимумом активности при 90-95^oС. Фермент способен сохранять активность без изменений в водных растворах npи температуре 90^oС и рН 6,0-8,5 в течение 40 минут, в присутствии ионов кальция (0,005 М) - 2 часа; при температуре 100^oС в присутствии ионов кальция активность не меняется в течение 20 минут.

Пуллуланаза активна в диапазоне значений рН 5,0-9,5 с оптимумом активности при рН 6,0-6,5; в диапазоне температур 30-80^oС с оптимумом активности при 75^oC. Период полной стабильности при 70^oC - 15 мин.

Протеаза активна в широком диапазоне рН от 6,5 до 11,0, с оптимумом при рН 9,0; в диапазоне температур 30-70^oС с оптимумом активности - 60^oC. Период полной стабильности фермента при 70^oC - 10 мин, при рН 11 и температуре 60^oC сохраняет 60% активности.

Таким образом, основные ферменты комплекса активны при близких значениях рН и температуры, что обеспечивает эффективность использования комплекса при биоконверсии растительного сырья.

Возможность использования изобретения иллюстрируется примерами, которые не ограничивают объем и сущность притязаний, связанных с ними.

Пример 1. Посевной материал (инокулюм) получают выращиванием штамма на жидкой питательной среде состава: крахмал растворимый - 1%; мясо-пептонный бульон и солодовое сусло в соотношении 1: 1, рН среды 7,5. Культивирование проводят в колбах, содержащих 50 мл стерильной среды, на качалке с 240 об/мин при 40^oС в течение 36-48 часов.

Полученный посевной материал в количестве 0,3% к объему среды вносят в качалочные колбы объемом 750 мл, содержащей 50 мл среды состава, г/л: кукурузная мука - 120,0; сухие кормовые дрожжи - 20,0; СаСО_З - 2,5; MgSO₄•7H₂0 - 2,5, рН среды 7,5-7,8. Среду предварительно обрабатывают амилосубтилином Гзх из расчета 2 ед/г крахмала при 50^oС в течение 20 минут. Затем разжиженную массу осахаривают глюкаваморином Г 3Х из расчета 6 ед/г крахмала до исчезновения синего окрашивания йодной пробы и стерилизуют обычным способом.

Максимальные ферментативные активности культуральной жидкости на 120 часов роста составляют: альфа-амилаза - 148,7 ед/мл; пуллуланаза - 29,2 ед/л; протеаза - 40,1 ед/мл; - бета-глюканаза - 41,5 ед/ мл, бета-ламинариназа - 17,8 ед/мл (таблица).

Пример 2. Способ осуществляют как в примере 1, но вместо кукурузной муки среда содержит экструдат кукурузной муки в количестве 100 г/л.

Максимальные ферментативные активности культуральной жидкости на 96 часов роста составляют: альфа-амилаза - 160,0 ед/мл; пуллуланаза - 32,1 ед/л; протеаза - 44,0 ед/мл; - бета-глюканаза - 45,1 ед /мл, бета-ламинариназа - 19,6 ед/мл.

Таким образом, заявляемый штамм Bacillus licheniformis BKM В-2184 Д обладает повышенной способностью синтеза комплекса термостабильных амилолитических и протеолитических ферментов, обладающего широким спектром ферментов различной специфичности, в том числе - бета- глюканазной и бета-ламинариназной активностями.

Основными среди продуцируемых ферментов являются термостабильная - амилаза, пуллуланаза и протеаза, которые активны при близких и тех же значениях рН и температуры, что позволяет рассматривать этот штамм как продуцент ферментов, составляющих естественный комплекс, перспективный для одновременной обработки крахмала или крахмалосодержащего сырья с целью его глубокого гидролиза, с одной стороны, с другой стороны, использовать как продуцент щелочных протеаз для глубокого расщепления белков до аминокислот.

Кроме того, использование предлагаемого штамма позволяет усовершенствовать способ получения комплекса термостабильных амилолитических ферментов за счет сокращения продолжительности выращивания продуцента, снижения концентрации субстрата в питательной среде.

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ
1. Римарева Л. В. Биотехнология комплексных перпаратов кислых протеаз. Автореферат докт. дис. , Москва, 1997.

2. Appl. Environ. Microbiol, - 1985. - 49. Р. 1168-1173.

3. Appl. Microbiol. Biotechnol. - 1987.27. - P. 192-1988.

4. Патент Великобритании N 2145094, кл. С 12 N 9/34, 1985.

5. Патент России N 2001103, кл С 12 N 9/26, 1993.

6. Нефедова Л. И. , Б. А. Устинников, Н. В. Цурикова, Г. Н. Ермакова, Н. А. Кичакова. Культивирование продуцента термостабильной альфа-амилазы. Теоретический журнал "Хранение и переработка сельхозсырья". В. 5, стр. 38, 1996.

7. Краткий определитель бактерий Берги. "Мир", М. , под ред. Дж. Хоулта, 1980.

8. Препараты ферментные. ГОСТ 20264.4. -74.

9. Клесов А. А. , М. Л. Рабинович, А. П. Синицын и др. Ферментативный гидролиз целлюлозы. Биоорганическая химия. 1980. Т 6. С. 1225-1242.

10. Каверзнева Е. Д. Стандартный метод определения протеолитической активности для комплексных препаратов протеаз. Прикладная биохим. и микробиол. , Т 7. , вып. 2. С. 225-228.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в спиртовом, крахмало-паточном, пивоваренном, хлебопекарном, кондитерском, плодово-ягодном, текстильном производствах, где требуются ферменты, устойчивые к повышенным температурам. Штамм бактерий Bacillus licheniformis ВКМ В-2184 Д выделен селекционным путем при изучении естественной изменчивости штамма ВКПМ В-6508 с применением методов эффективного мутагенеза. Продуцирует комплекс, содержащий не менее пяти термостабильных амилолитических и протеолитических ферментов. Активен в диапазоне значений рН 5,0-11,0 и температуры 30-105^oС с максимальной активностью альфа-амилазы при 90-95^oС, пуллуланазы - при 75^oС, протеазы - при 60^oС. Перспективен для одновременной обработки крахмала или крахмалосодержащего сырья с целью его глубокого гидролиза и как продуцент щелочных протеаз для глубокого расщепления белков до аминокислот. Штамм обладает повышенной способностью синтеза комплекса термостабильных амилолитических и протеолитических ферментов, обладающего также бета-глюканазной и ламинариназной активностями. 1 табл.

Штамм бактерий Bacillus licheniformis ВКМ В-2184 Д - продуцент комплекса термостабильных амилолитических и протеолитических ферментов.