ШТАММ БАКТЕРИЙ PAENIBACILLUS MACERANS - ПРОДУЦЕНТ АЛЬФА-ЦИКЛОДЕКСТРИНГЛЮКАНОТРАНСФЕРАЗЫ Российский патент 2007 года по МПК C12N1/20 C12N9/14 

Изобретение относится к пищевой промышленности, в частности к технической микробиологии, биотехнологии, а именно к получению нового штамма-продуцента циклодекстринглюканотрансферазы (альфа-1,4-глюкан-4-гликозилтрансфераза циклизующая, КФ 2.4.1.19; ЦГТ-аза).

Циклодекстринглюканотрансфераза - фермент микробного происхождения, при воздействии которого на крахмал и аналогичные субстраты образуются циклические нередуцирующие декстрины различных размеров (Абелян В.А. Циклодекстрины: Получение и применение. Изд. Дом "Ван-Арьян", Ереван, 2001, 519 с.). В зависимости от количества альфа-D-глюкопиранозных остатков (6, 7 и 8) циклодекстрины обозначаются соответственно как альфа-, бета- и гамма- циклодекстрины (ЦД). Именно эти циклодекстрины получили широкое практические применение прежде всего в пищевой промышленности, а также в фармакологии, медицине и других отраслях. Вследствие уникального строения (гидрофильная внешняя поверхность и гидрофобная сквозная внутримолекулярная полость) они способны образовывать комплексы включения с различными органическими и неорганическими соединениями, кардинально изменяя при этом их физико-химические свойства. Нерастворимые субстанции становятся растворимыми, обладающие горьким вкусом - безвкусными, пахучие - лишенными запаха, летучие - нелетучими, нестабильные - стабильными. В пищевой промышленности наиболее востребован альфа-циклодекстрин, который применяется для введения в рецептуры пищевых продуктов витаминов и ароматических веществ, повышая их растворимость в воде.

Основными критериями, определяющими эффективность продуцентов альфа-ЦГТ-аз, являются продуктивность (активность) ЦГТ-азы и селективность фермента в отношении синтеза альфа-циклодекстрина.

Известны штаммы бактерий вида Paenibacillus circulans и Bacillus sterothermophilus, образующие ЦГТ-азы, катализирующие образование, преимущественно альфа-циклодекстрина (Циклодекстрины // Под ред. Егорова Н.С. - Итоги науки и техники. ВИНИТИ. Сер. Микробиология. - 1988-1989. - Т.20-21; Szeitli J. Cyclodextrin technology. Kluwer academic publishers, 1989. 450 p.). Но они могут быть использованы только в технологии получения бета-циклодекстрина для предварительного расщепления крахмала (Усанов Н.Г., Логинов О.Н., Пруцакова Е.А., Терехова Е.Я. Получение бета-ЦД из картофельного крахмала / Тезисы докладов Всесоюзной конференции. Черновцы, 1991 - Т.1 - с.122). Для получения альфа-циклодекстринов ферменты этих штаммов непригодны.

Наиболее близким аналогом по совокупности существенных признаков и достигаемому результату является штамм Bacillus stearothermophilus, секретирующий ЦГТ-азу, которая преимущественно образует альфа-циклодекстрин. Недостатком этого штамма является то, что он обладает невысокой продуктивностью (активностью) по ЦГТ-азе (SU 1814313 А1, кл. С12P 19/18, 1989). Другим недостатком альфа-ЦГТ-азы штамма Bacillus stearothermophilus является то, что доля альфа-циклодекстрина в сумме других циклических олигосахаридов недостаточно высока.

Задачей, на решение которой было направлено заявляемое изобретение, являлся поиск природного штамма, обеспечивающего синтез внеклеточной альфа-ЦГТ-азы, обладающей высокой активностью, преимущественно образующей альфа-циклодекстрин.

Технический результат, который может быть получен при осуществлении изобретения, заключается в обнаружении культуры микроорганизмов, обладающей способностью к образованию ЦГТ-азы, пригодной для синтеза альфа-циклодекстрина и катализирующей реакцию трансформации крахмала до получения конверсионной смеси с преимущественным содержанием доли альфа-циклодекстрина.

Сущность объекта изобретения - штамм Paenibacillus macerans 1АМБ.

Предлагаемый штамм Paenibacillus macerans 1АМБ депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов под номером ВКПМ В-9481, продуцирует ЦГТ-азу с высокой активностью, преимущественно образующую альфа-циклодекстрин. Штамм является галофильным, так как растет на средах, содержащих 15% NaCl, тогда как рост большинства известных бактерий останавливается при концентрации 7% и ниже. Это уникальное свойство значительно облегчает поддержание чистоты культуры.

Штамм выделен из образца почвы, отобранного в Волгоградской обл. путем накопительной культуры на элективной питательной среде, содержавшей минеральные буферные компоненты и альфа-циклодекстрин в качестве единственного источника углерода и энергии.

Культурально-морфологические особенности штамма. Единичные палочки шириной 0,2-0,3 мкм, длиной 3-5 мкм. Окраска по Грамму - вариабельна. Через 24 ч инкубации при 37°С образуют эндоспоры (спорообразование терминальное и субтерминальное; споры расширяют материнскую клетку булавовидно). Клетки подвижные. Штамм при росте на среде состава "А" (состав среды указан в таблице 2) через 24 часа при 37°С образует единичные колонии круглые с фестончатым краем. Диаметр колоний 1-4 мм. Поверхность гладкая, слегка бугристая к краям. Полупрозрачная, блестящая мучнистая структура. Цвет колоний: молочно-серый, молочно-желтый, иногда с легким розоватым оттенком. Профиль колоний: изогнутый. Структура колоний: однородная. Край колоний: волнистый.

При росте на МПА через 24 часа при 37°С штамм образует единичные колонии с волнистыми краями, диаметром 3-5 мм. Цвет: молочно-желтый. Поверхность: гладкая, матовая.

При росте на тиогликолевой среде через 24 часа при 37°С штамм образует однородную равномерно заполненную поверхность без отдельных колоний. Цвет: светлый молочно-желтый. Поверхность: гладкая, матовая.

Штамм при росте на картофельном агаре через 24 часа при 37°С образует единичные плотно сгруппированные колонии. Цвет: молочно-желтый. Поверхность: гладкая.

При росте на ГРМ через 24 часа при 37°С образует единичные колонии диаметром 4-7 мм. Цвет: молочно-желтый. Поверхность: гладкая, слизеобразная.

При посеве на срез картофеля через 36 часов при 37°С наблюдаются обильный разрастающийся рост культуры, образование пленки, цвет молочно-желтый, поверхность пленки гладкая, слизистая, непрозрачная.

Условия роста. Температура: +5 - +50°С (оптимальное значение: +30 - +40°С), рН 3,3-9,9 (оптимальное значение 6,0-8,0).

Физиолого-биохимические признаки продуцента. Реакция Фогес-Проскауэра отрицательная, каталазная активность положительная, микроорганизм является аэробом (анаэробный рост отсутствует). Штамм образует кислоту при росте на углеводах и сахаро-спиртах (глюкоза, манит, сахароза, мальтоза, лактоза). Газ из вышеприведенных углеводов и спирта не образует. Гидролизует крахмал, слабо гидролизует желатин и казеин. Индол не образует, нитраты восстанавливает до нитритов. Микроорганизм является прототрофным, не требует внесения в среду готовых витаминов или других факторов роста. Отношение к источникам азота: хорошо растет на различных органических и неорганических азотосодержащих соединениях. Оксидазной активностью не обладает. Отношение к концентрации хлористого натрия: наблюдается рост в питательном бульоне, содержащим до 15% NaCl (данные по определению устойчивости продуцента к высоким концентрациям солей приведены в таблице 1).

Таблица 1Концентрация NaCl, %Наличие роста и его интенсивность (24 ч)5Хороший рост, густой штрих, по краям наличие отдельных колоний10Хороший четкий рост, наличие отдельных колоний к концу штриха15Слабый рост, большое количество отдельных колоний20Нет роста

Штамм Paenibacillus macerans 1АМБ (ВКПМ В-9481) продуцирует на жидких средах циклодекстринглюканотрансферазу, преимущественно образующую альфа-циклодекстрин, который может быть использован в пищевой промышленности, а также в фармакологии, сельском хозяйстве и медицине.

Филогенетические характеристики штамма. Данные сиквенса 16S ribosomal RNA и проведенный поиск гомологичных последовательностей при помощи BLAST'a (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) выявили, что целевой штамм с точностью 98% относится к роду Paenibacillus вида macerans.

На основании изучения совокупности морфологических, биохимических и филогенетических характеристик описываемой культуры новый штамм, продуцирующий альфа-ЦГТ-азу, был идентифицирован как Paenibacillus macerans 1АМБ.

Условия и состав сред для длительного хранения штамма. Штамм хранят следующим образом: 1. Периодически выращиваемая культура инкубируется на картофельно-глюкозном агаре (рН 7,0) при температуре 37°С в течение 36 часов, хранится на этой же среде при 4°-6°С в течение 6 месяцев. 2. В стерильной почве. Срок хранения 12 месяцев. В данных условиях хранения штамм сохраняет до 70-80% жизнеспособности. ЦГТ-азная активность проявляется сразу после первого пересева на оптимальной среде.

Для роста культуры и биосинтеза альфа-ЦГТ-азы источником углерода могут служить крахмал, декстрины, зерновые и бобовые культуры, картофель. Источниками азота могут служить пептон, дрожжевой экстракт, кукурузный экстракт, дрожжевые клетки, аммонийный азот. В качестве минеральных добавок может использоваться одно- и двузамещенный фосфат калия, одно- и двузамещенный фосфат аммония, сода, карбонат кальция.

Культивирование штамма осуществляют в аэробных условиях в ферментере или колбах при температуре 37-40°С в течение 56-64 часов, рН среды 7-7,5. В процессе культивирования осуществляется контроль за активностью альфа-ЦГТ-азы в культуральной жидкости.

Возможность использования изобретения иллюстрируется примерами, которые не ограничивают объем и сущность притязаний, связанных с ними.

Пример 1. Инокулят штамма Paenibacillus macerans 1АМБ (ВКПМ В-9481), выращенный в пробирках на скошенных агаризованных средах состава "А" (состав среды приведен в таблице 2) в течение 28-30 часов при 38-40°С, смывают стерильной водой из расчета 10 см³ воды на одну пробирку и вносят в колбы Эрленмейера объемом 250 см³, содержащие по 50 см³ стерильных сред состава "Б" для получения посевного материала.

Таблица 2КомпонентыСодержание компонентов, % в средах"А""Б""В"крахмал1,01,01,0белый кукурузный декстрин 0,50,5пептон0,30,30,3дрожжевой экстракт0,50,50,5MnCl₂--0,003(NH₄)₂HPO₄0,20,20,2СаСО₃-0,50,5агар2,0--

Соотношение инокулята и питательной среды 1:5, культивирование осуществляется на качалках со скоростью встряхивания 220 об/мин в течение 30-32 часов, температура выращивания 38-40°С. Полученный таким образом посевной материал используют для засева лабораторного ферментера общим объемом 20 дм³ (рабочий объем 16 дм³) на питательной среде состава "В". Ферментацию проводят при следующих условиях: температура культивирования 38-40°С, количество посевного материала - 5%, степень аэрации 1 объем воздуха на 1 объем среды в минуту, перемешивание 250 об/мин, длительность культивирования 56-64 часа. Через каждые 8 ч культивирования отбирают пробу культуральной жидкости и измеряют активность альфа-ЦГТ-азы по методу Мякеля-Лааксо (J Agric. Food Chem. 1988 / Vol.36 pp 83-88 Nonchromatographic cyclodextrin assays: evaluation of sensitivity, specificity, and conversion mixture applications. Mauri J. Makela, Timo K. Korpela, Juhani Puisto, and Simo V. Laakso).

За единицу активности принимают количество ЦГТ-азы, катализирующее образование 1 мкМ альфа-циклодекстрина в течение 1 мин из 3% раствора крахмала при рН 6.0 и температуре 40°С.

Динамика накопления ЦГТ-азы в культуральной жидкости Paenibacillus macerans 1АМБ (ВКПМ В-9481)приведена в таблице 3.

Таблица 3Длительность культивирования, ч816243240485664Активность альфа-ЦГТ-азы, ед/см³-5,0-6,09,0-10,017,5-18,525,5-26,536,5-37,542,5-43,540,0-41,0

Максимальная активность альфа-ЦГТ-азы Paenibacillus macerans 1АМБ (ВКПМ В-9481) наблюдается в культуральной жидкости к 56 часу роста и составляет величину 43,0±0,5 ед/см³.

Пример 2. Специфичность ЦГТ-азы определяют по продуктам реакции этого фермента с крахмалом. Анализ продуктов ферментативной конверсии крахмалов проводят методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Условия реакции: 2 см³ 3% раствора крахмала в 0,01 М Na-ацетатном буфере (рН 6,2) смешивают с 1 см³ раствора фермента, смесь помещают в термостат на 30 минут при температуре 40°С. Реакцию останавливают добавлением к смеси ацетонитрила в соотношении 1:1. Реакционную смесь центрифугируют в течение 2 мин при 10000 оборотах, для определения используют супернатант. Условия хроматографирования: колонка для разделения продуктов реакции МН2-диасфер, размер 4,6×250 мм, скорость подачи элюента 0,8 см³/мин, элюент 60% водный ацетонитрил. Соотношение продуктов конверсии крахмала с ЦГТ-азой штамма Paenibacillus macerans 1АМБ (ВКПМ В-9481) составляет, %: альфа-циклодекстрин 74,7; бета-циклодекстрин 10,4; гамма-циклодекстрин 14,9. В качестве раствора фермента используется культуральная жидкость выращенного на среде «В» штамма Paenibacillus macerans 1АМБ (ВКПМ В-9481), разведенная в 10 раз 0,01 М Na-ацетатным буфером (рН 6,2).

Таким образом, галофильный штамм Paenibacillus macerans 1АМБ (ВКПМ В-9481) обладает более высокой продуктивностью по ЦГТ-азе, чем известные штаммы, а также продуцирует ЦГТ-азу, образующую преимущественно альфа-циклодекстрин, который имеет наибольшее применение в фармакологии, медицине, пищевой промышленности и других областях.

Штамм бактерий Paenibacillus macerans ВКПМ В-9481 обеспечивает синтез внеклеточной альфа-циклодекстринглюканотрансферазы, образующей альфа-циклодекстрин. Активность альфа-ЦГТ-азы в культуральной жидкости составляет 43,5 ед/см. За единицу активности принимают количество ЦГТ-азы, катализирующее образование 1 мкМ альфа-циклодекстрина в течение 1 мин из 3% раствора крахмала при рН 6,0 и температуре 40°С. Доля альфа-циклодекстрина в сумме других циклических продуктов составляет 74,7%. 3 табл.

Штамм бактерий Paenibacillus macerans ВКПМ В-9481 - продуцент альфа-циклодекстринглюканотрансферазы.