СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ БИОМАССЫ МИКРООРГАНИЗМОВ Российский патент 2005 года по МПК C12N1/02 

Изобретение относится к биотехнологии и касается способа выделения биомассы микроорганизмов из культуральной жидкости действием флокулянта.

Известны способы выделения биомассы микроорганизмов из культуральной жидкости, предусматривающие добавление высокомолекулярных реагентов-флокулянтов с последующим отделением осадка. В качестве высокомолекулярных реагентов используют поли-1-этил-2-метил-5-винилпиридиний бромид [1], фталоилжелатину или сополимер акриловой кислоты и 2-метил-5-винилпиридина [2], сополимер акрилонитрила с N-триметиламмонийэтилметакрилат-метилсульфатом [3].

Недостатками известных способов являются невысокая эффективность, кроме того некоторые из них [1, 2] приемлимы только для выделения дрожжевой биомассы.

Наиболее близким по технической сущности и принятым за прототип является способ, связанный с использованием в качестве флокулянта катионогенного водорастворимого полиэлектролита поли-N,N-диметил-N,N-диаллиламмоний хлорида [4].

Недостатком указанного способа является то, что использование указанного катионогенного полиэлектролита в некоторых случаях приводит к значительному снижению численности, и активности осажденных клеток.

Технической задачей изобретения является повышение качества процесса выделения биомассы, заключающееся в сохранении численности жизнеспособных клеток и их активности, в частности антагонистической активности по отношению к различным грибным фитопатогенам.

Поставленная задача решается путем применения в качестве флокулянта в процессе выделения биомассы водорастворимого полимера “гивпан”, представляющего собой продукт гидролиза полиакрилонитрильного сополимера акрилонитрила с метакрилатом. Промышленное производство “гивпана” осуществляется на ГУП “Опытный завод Академии Наук Республики Башкортостан” (г.Уфа) в соответствии с ТУ 2216-001-04698227-99, известно его использование в качестве ингредиента бурового раствора.

Антагонистическая активность микробных клеток выделенной биомассы определяется следующим образом. На чашки Петри с глюкозо-пептонным агаром (глюкоза - 5 г; пептон - 5 г; калий фосфорнокислый двузамещенный - 4 г; калий фосфорнокислый однозамещенный - 2 г; вода дистиллированная - 1 л) высевают сплошным газоном суспензию спор грибного фитопатогена. В качестве тест-грибов используются микромицеты, вызывающие плесневение семян и корневые гнили злаковых культур: Bipolaris sorokiniana, Alternaria alternata, Fusarium culmorum. Затем на эти же чашки уколом сажают бактерии-антагонисты, относящиеся к классу псевдомонад. Чашки инкубируют при 28°С в течение 3 суток. Учет проводят по зонам отсутствия или подавления роста грибов вокруг колонии штамма.

При использовании в качестве бактерий-антагонистов представителей рода Azotobacter на чашки Петри наносится агаризованная среда КГА (картофель тертый - 200 г; глюкоза - 20 г; агар - 20 г; вода водопроводная - 1 л).

Пример 1. В культуральную жидкость, полученную при выращивании штамма-антагониста грибных фитопатогенов Pseudomonas putida ИБ 17 [5], с титром микроорганизмов 1,3·10⁹ КОЕ/мл на питательной среде Кинг В, вводят флокулянт “гивпан” в количестве 0,1-0,8% (по сухому веществу). Параллельно в эту культуральную жидкость в аналогичном количестве вводят флокулянт по известному способу - ВПК-402. Кроме того, в качестве аналога в эту культуральную жидкость параллельно вводят еще один водорастворимый катионогенный полиэлектролит - “Каустомин-15”, представляющий собой поли-N,N-диметил-N-(2-гидрокси)-пропиламмоний хлорид. Данный полимер получают реакцией диметиламина с эпихлоргидрином с последующей поликонденсацией образующегося 1-диметиламино-2-гидрокси-3-хлорпропана. Промышленное производство “каустомина-15” осуществляется на Стерлитамакском ЗАО “Каустик” в соответствии с ТУ 2227-222-00203312-2002.

Смесь перемешивают 10 мин, оставляют без перемешивания на 40 мин. Процесс отделения скоагулированной биомассы проводят сепарированием. Затем проводят определение антагонистической активности выделенных клеток микроорганизмов. Результаты экспериментов приведены в табл.1.

Биомассу микроорганизмов, выделенную из культуральной жидкости при помощи флокулянтов, вносят в питательную среду вышеупомянутого состава, объем которой равен объему исходной культуральной жидкости перед осуществлением процесса флокуляции. Далее общепринятыми методами определяют число жизнеспособных клеток в 1 мл жидкости. Результаты этих определений показали, что биомасса микроорганизмов, выделенная из культуральной при помощи “гивпана”, содержала жизнеспособных микроорганизмов на уровне 1,3·10⁹ КОЕ/мл, то есть не отличалась по численности от исходной культуральной жидкости. В то же время осажденная при помощи флокулянтов ВПК-402 и Каустомин-15 биомасса микроорганизмов содержала, соответственно, 1,2-4,3·10⁸ КОЕ/мл и 1,3-3,2·10⁸ КОЕ/мл.

Пример 2. В культуральную жидкость, полученную при выращивании на питательной среде Кинг В штамма-антагониста грибных фитопатогенов Pseudomonas aureofaciens ИБ 51 [6], с титром микроорганизмов 1,7·10⁹ КОЕ/мл, вводят флокулянт “гивпан” в количестве 0,1-0,8% масс. (по сухому веществу). Для сравнения используют катионогенные полиэлектролиты ВПК-402 и Каустомин-15. Дальнейшие манипуляции аналогичны примеру 1. Результаты экспериментов приведены в табл. 2.

Определение численности микроорганизмов в скоагулированной биомассе, выполненное аналогично примеру 1, показало, что, как и в примере 1, использование “гивпана” не уменьшило величины численности микроорганизмов в биомассе по сравнению с исходной культуральной жидкостью. Выделенная при помощи ВПК-402 и Каустомин-15 биомасса содержала, соответственно, 1,1-5,8·10⁸ и 3,8-5,5·10⁸ КОЕ/мл жизнеспособных клеток.

Пример 3. В культуральную жидкость, полученную при ферментации на питательной среде С-40 штамма-антагониста грибных фитопатогенов Azotobacter vinelandii ИБ 1 [7], с титром микроорганизмов 1,8·10⁹ КОЕ/мл, вводят флокулянт “гивпан” в количестве 0,1-0,8% масс. (по сухому веществу). Для сравнения в этом примере также использованы известные флокулянты - высокомолекулярные катионогенные полиэлектролиты ВПК-402 и Каустомин-15. Время перемешивания культуральной жидкости и флокулянтов, а также время отстаивания аналогичны примеру 1. Результаты экспериментов приведены в табл. 3. Аналогично примеру 1 определена численность жизнеспособных клеток микроорганизмов в выделенной биомассе. Биомасса, выделенная при помощи флокулянта “гивпан”, содержала 1,8·10⁸ КОЕ/мл жизнеспособных клеток, биомасса, выделенная с использованием флокулянтов ВПК-402 и Каустомин-15 - 1,2-4,2·10⁸ и 3,2-4,5·10⁸ КОЕ/мл, соответственно, жизнеспособных клеток.

Данные по антагонистической активности нескольких штаммов микроорганизмов, выделенных из культуральных жидкостей при, помощи различных флокулянтов и приведенных в табл.1-3, свидетельствуют о том, что только применение “гивпана” в качестве флокулянта обеспечивает сохранение активности выделенных микроорганизмов. Применение катионогенных полиэлектролитов ВПК-402 и Каустомин-15 в качестве флокулянтов хотя и приводит к осаждению биомассы микроорганизмов из культуральной жидкости, но при этом теряется активность микроорганизмов по отношению к грибным фитопатогенам или основная функция биопрепаратов на основе этих микроорганизмов. Обнаруженное свойство катионогенных полиэлектролитов ВПК-402 и Каустомин-15, по-видимому, связано с высокой биостойкостью этих ксенобиотиков, используемой, в частности, в составах для вытеснения нефти. Число жизнеспособных клеток в выделенной биомассе микроорганизмов с использованием флокулянта “гивпан” не отличается от численности клеток в исходной культуральной жидкости трех различных штаммов микроорганизмов. Применение для осуществления процесса флокуляции катионогенных полиэлектролитов ВПК-402 и Каустомин-15 приводит к потере численности жизнеспособных клеток.

Предлагаемый способ выделения биомассы микроорганизмов - антагонистов грибных фитопатогенов может быть использован, в частности, при производстве препаративных форм биопрепаратов.

Список литературы

1. Авторское свидетельство СССР №1133290, кл. С 12 N 1/02, 1985.

2. Авторское свидетельство СССР №1105501, кл. С 12 N 1/02, 1984.

3. Авторское свидетельство СССР №1557160, кл. С 12 N 1/02, 1990.

4. Авторское свидетельство СССР №1458382, кл. С 12 N 1/02, 1989.

5. Решение о выдаче патента РФ от 24.04.2003 по заявке №2002107619/13 (007826) от 25.03.2002 на “Штамм бактерий Pseudomonas putida для получения препарата против заболеваний пшеницы, вызываемых грибными фитопатогенами”.

6. Патент РФ №2203945 на “Штамм бактерий Pseudomonas aureofaciens для получения препарата против заболеваний пшеницы, вызываемых грибными фитопатогенами”, Б.И. №13, 2003, кл. С 12 N 1/20.

7. Заявка на получение патента РФ №2002116983/13 (017904) от 25.06.2002 на “Штамм бактерий Azotobacter vinelandii для получения биопрепарата для борьбы с болезнями пшеницы, вызываемыми грибными фитопатогенами, и повышения урожая”.

Изобретение касается способа выделения биомассы микроорганизмов из культуральной жидкости и может быть использовано в производстве препаративных форм биопрепаратов. Способ предусматривает добавление в качестве флокулянта высокомолекулярного реагента "гивпан", представляющего собой продукт гидролиза полиакрилонитрильного сополимера акрилонитрила с метакрилатом. "Гивпан" вводят в количестве 0,1-0,8% масс. от объема культуральной жидкости. Использование предлагаемого способа позволяет сохранить активность выделяемых микроорганизмов - антагонистов грибных фитопатогенов и численность жизнеспособных клеток. 3 табл.

Способ выделения биомассы микроорганизмов из культуральной жидкости, предусматривающий добавление высокомолекулярного реагента-флокулянта с последующим отделением осадка, отличающийся тем, что в качестве флокулянта используют "гивпан", представляющий собой продукт гидролиза полиакрилонитрильного сополимера акрилонитрила с метакрилатом, и вводят его в количестве 0,1-0,8 мас.% от объема культуральной жидкости.