Способ очистки культуральной жидкости микроорганизмов - продуцентов протеолитических ферментов Советский патент 1989 года по МПК C12N1/02 

. 1

Изобретение относится к биотехнологии и касается предварительной обработки ферментационных жидкостей в процессах получения очищенных ферментных препаратов.

Цель изобретения - повышение качества и ускорение процесса очистки.

Очистку культуральной жидкости (ЮК) осуществляют следующим образом.

Очистка КЖ начинается с разделения твердой и жидкой фаз. Разделение фаз, а также последующее выделение фермента, особенно прн разработке сокращенных технологических схем, требует получешш очищенных фильтратов КЖ повьш1енной степени чистоты, т.е. без коллоидных примесей, взвешенных сопутствующих веществ и посторонней микрофлоры. Такую очистку КЖ можно достичь благодаря флокулянтам.

По окончании ферментации в КЖ, представляющую собой многокомпонеит-ную полидисперсную систему переменкО- го состава (в зависимости от питательной среды), вносится флокулянт

. на основе диметилдиаллиламмоний хлорида (ВПК-402) или винилбензилтриме- тиламмоний хлорида (ВПК-101) (катио- генные полизлектролиты). Предварительно рН ЮК доводят до рН 3,0-8,0 в зависимости от фермента. Эта величина влияет как на скорость процесса, так и на сохранение активности фермента, так как фпокулянты, являясь

СП

00

со

00

ю

полиэлектролитами, могут взаимодействовать с ферментным белком, вызы- :вая его коагуляцию, поэтому для каждого ферм ента эта зона индивидуальна. Так, для нейтральной протеазы оптимальным параметром является рН 6,5- 7,5, для щелочной - рН 7,5-8,0, для кислой про теиназы - рН 5,0-6,0.

Выбор параметров при коагуляции биомассы с помощью флокулянтов обуславливается не только свойствами того или иного фермента (последнее имеет определяющее значение, так как зави

сит от заряда клетки микроорганизма |И его морфологических свойств, от |состава и физико-химической характеристики культуральной жидкости в целом), но и свойствами того или иного флокулянта.

Флокулянт необходимо вносить по содержанию сухих веществ в товарном продукте в количестве 0,3-0,5% от объема . Внесение флокулянта в концентрации меньше 0,3% нецелесообразно, так как скорость фильтрации пада |ет. Дальнейшее увеличение концентра- :ции свьпие 0,5% не улучшает процесса, а эффективность процесса снижается. Нспользуемьй флокулянт выпускается :С содержанием сухих (основного продукта) веществ 10-50%. Оптимальные результаты очистки КЖ получены при концентрации поли- I электролита 0,3-0,5%. Это количество флокулянта способствует не только iкоагуляции биомассы, взвешенных в растворе сопутствующих веществ и очистке ферментного раствора от тонкодисперсных частиц, частичному удалению постороннем микрофлоры, а также сохранению суммарной исходной ферментативной активности раствора. На этой стадии флокулянт проявляет свойство и как известного реагента- коагулятора, и как стабилизатора-активатора фермента.

Сохранение и даже увеличение активности фермента в отфильтрованной Ш связано с тем, что флокулянт выво дит из исходных растворов ингибиторы ферментов, что позволяет сохранить и увеличить ферментативную актив-. ность.

При внесении флокулянта в КЖ для его полного внесения последний разводят 2-5 объемами воды. Затем смесь (КЖ с флокулянтом) перемешивают в течение 5-10 мин для того, чтобы обес

10

15

0

25

30

35

-

40

45

55

печить равномерное движение объемов раствора с активными центрами полиэлектролита, где происходит столкновение и слипание частиц.

Для полно ты осаждения биомассы, растворенных и нерастворенных примесей, т.е. для формирования осадка, указанную смесь вьщерживают без перемешивания 30-60 мин. Далее очищаемый раствор подают на центробежное оборудование и биомассу отделяют при том рН, которое установилось после внесения флокулянта и вьщержки смеси. Если используется фильтров.альное оборудование для отделения биомассы, то перед внесением флокулянта вводят 1,5- 2% фильтроперлита.

Осуществление предлагаемого способа позволяет увеличить скорость фильтрации до 120-150 л/м -ч, т.е. в 1,5- 2 раза по сравнению с известным способом..

Предлагаемьц способ обеспечивает чистоту нативного раствора, снижает содержание посторонней микрофлоры на 2-3 порядка (см. табл. I),

Пример (контрольный). Очистку КЖ щелочной протеазы осуществляют растворами солей хлористого кальция и фосфатов с фильтроперлитом.

По окончании ферментации бактериальную КЖ, содержащую щёлочнум про- теазу в количестве 10000 л охлаждают до 13°С, доводят рН до 6,2 раствором едкого натра, добавляют 900 кг фильт- роперлита и вносят 500 кг хлористого кальция, предварительно .растворенного в 770 л воды и перемешивают в течение 15 мин. При этом рН КЖ понижается до 4,8, его повыщают до 5,6 раствором едкого натра, который приготавливают заранее (2400 л- воды + 600 л 36%-ного раствора. NaOH или 127 кг кристаллического едкого натра). Затем в эту смесь загружают 160 кг динатрий фосфата и 240 кг тринатрий фосфата, предварительно растворенных в 1200 л воды, подогретой до 40°С. КЖ с солями и фильтро перлитом перемешивают в течение 15 мин, рН доводя до 6,4 раствором NaOH при включенной мещалке, затем отключают мешалку и Выдерживают без перемешивания в течение 2 ч. Исходная активность щелочной протеазы 8000 ед/мл, содержание микрофлоры 5 -10 кол/мл. Процесс отделения твердой фазы от жидкой проводят на ленточных фильтрах,

51458382

на которые наносят слой фильтроперлита (около 500 кг для намывки на ткань 1 фильтра). Общий объем фильтрата с промывными водами составляет . 12800 л, активность 46УО ед/мл, содержание микрофлоры 1 о кол/мл, полученный фильтрат имеет коэффициент осветления 65%. Общее количество отИз .табл. 1 видно, что при Коагуляции биомассы гелем фосфата кальция выход на стадии отделения биомассы составляет 75%, а с использованием флокулянта 95% (5% - это механические потери). Ecjra рассматривать действие коагулянтов на фермент, то по известному способу наблюдается инделяемой биомассы с солями составляет ю активация активности на 5,8%, а при

использовании флокулянта ВПК-АО2 наблюдается повьппение ферментативной активности в 1 мл фильтрата по сравнению с исходной.

Лабораторные испытания способа.

Пример 1. 300 мл КЖ Bacillus subtilis шт. 72 с активностью 6274 ед/мл и содержанием микрофлоры 3 10 кол/мл, рН 6,4, подщелачивают

2750 кг (в отвал). Затраты времени на проведение технологических операций (подщелачивание, обработка солями) 10 ч; скорость фильтрации 80 . Потери активности состав- 15 ляют 25%. Снижения содержания микрофлоры нет.

П р и м е р 2. Очистка КЖ щелочной протеазы с использованием флокулянта.

Посл-е окончания процесса фермента- 20 до рН 7,5 раствором едкого натра, ции 10000 л КЖ Bacillus subtilis добавляют флокулян т ВПК-402 в коли- щт. 72 с активностью 8000 ед/мл и содержанием микрофлоры 3-10 кол/мл подщелачивают до рН 8,0 раствором едкого натра, добавляют флокулянт ВПК- 25 составляет 15,3 г/л или 4,6 г на 402 в количестве 0,4% (по сухому ве- 300 мл КЖ. ПpeдвapитeJrьнo флокулянт ществу) от объема КЖ. Флокулянт разводят водой в соотношении 1:5.

Смесь перемешивают 10 мин, остав-.. ляют без перемешивания на 30 мин. Процесс отделения скоагулированной биомассы проводят сепарированием. Общий объем очищенного фильтрата тавляет 9400 л с активностью 8120 ед/мл, содержание микрофлоры 2 -10 кол/мл, коэффициент осветления 90%. Общееколичество отделяемой биомассы 585 кг, его можно использовать на корм скоту. Затраты времени на

подщелачивание и обработку флокулян- 40 протеазы с активностью 3570 ед/мл том 1,5 ч. Производительность сёпари- и содержанием микрофлоры 10 .-кол/мл, рования 0,4-0,5 .

Таким образом, в сравнении с известным способом по предлагаемому . . способу потерь ферментативной актив- 45 а воронке Бюхнера, то вносят ,5% ности от инактивации нет, наблюдается фильтроперлита, затем вносят флокутп повышение активности на 129 ед/мл

честве 0,5% (по сухому веществу, -со- .держание которого в данном случае составляет 31,8%) от объема КЖ. Это

разводят водой в соотношении It3.

Смесь перемешивают 10 мин, оставляют без перемешивания на 40 мин.

30 Отделение скоагулированной биомассы проводят центрифугированием. Обпц1й объем очищенного фильтрата составляет 290 мл с активностью 6800 ед/мл, содержание микрофлоры 10 кол/мл, ко35 эффициент осветления 92%. Активация 1 мл фильтрата после контакта с фло- кулянтом составляет 8,3%.

Пример 2. 200 мл КЖ щелочной

подщелачивают до рН 8,0, Так как отделение скоагулированной биомассы проводят фильтрованием под вакуумом

лянт ВПК-4,2 в количестве 0,3% (1,8 г на 20.0 мл ЮК или 9 г/л). Фпо- кулянт для полного внесения в КЖ растворяют 2 объемами воды.

Смесь перемешивают 5 мин, остав- ляют без перемешивания ,на 30 мин. Затем отфильтровывают. Скорость фильв фильтрате по сравнению с исходной активностью, снижается содержание посторонней микрофлоры на 3 порядка, 50 повьшается прозрачность фильтрата (осветление) на 25%, исключается полностью использование дефицитного сырья (фильтроперлита, солей фосфатов), сокращается время обработки 55 составляет 189 мл. Ферментативная КЖ с 10 до 1,5 ч, уменьшается в 4 ра- актиш1ость щелочной протеазы за количество отделяемой биомассы.

Данные по примерам I и 2 сведены в табл. 1.

трации 130 . Объем фильтрата

3866 ед/мл. Содержание .микрофлоры снижается на 4 порядка (21.0 кол/мл) прозрачность фильтрата (коэффициен

Из .табл. 1 видно, что при Коагуляции биомассы гелем фосфата кальция выход на стадии отделения биомассы составляет 75%, а с использованием флокулянта 95% (5% - это механические потери). Ecjra рассматривать действие коагулянтов на фермент, то по известному способу наблюдается инактивация активности на 5,8%, а при

использовании флокулянта ВПК-АО2 наблюдается повьппение ферментативной активности в 1 мл фильтрата по сравнению с исходной.

Лабораторные испытания способа.

Пример 1. 300 мл КЖ Bacillus subtilis шт. 72 с активностью 6274 ед/мл и содержанием микрофлоры 3 10 кол/мл, рН 6,4, подщелачивают

до рН 7,5 раствором едкого натра, добавляют флокулян т ВПК-402 в коли-

честве 0,5% (по сухому веществу, -со- .держание которого в данном случае составляет 31,8%) от объема КЖ. Это

составляет 15,3 г/л или 4,6 г на 300 мл КЖ. ПpeдвapитeJrьнo флокулянт

протеазы с активностью 3570 ед/мл и содержанием микрофлоры 10 .-кол/мл,

разводят водой в соотношении It3.

Смесь перемешивают 10 мин, оставляют без перемешивания на 40 мин.

Отделение скоагулированной биомассы проводят центрифугированием. Обпц1й объем очищенного фильтрата составляет 290 мл с активностью 6800 ед/мл, содержание микрофлоры 10 кол/мл, коэффициент осветления 92%. Активация 1 мл фильтрата после контакта с фло- кулянтом составляет 8,3%.

Пример 2. 200 мл КЖ щелочной

протеазы с активностью 3570 ед/мл и содержанием микрофлоры 10 .-кол/мл,

. . воронке Бюхнера, то вносят ,5% фильтроперлита, затем вносят флокутп

подщелачивают до рН 8,0, Так как отделение скоагулированной биомассы проводят фильтрованием под вакуумом

а воронке Бюхнера, то вносят ,5% фильтроперлита, затем вносят флокутп

лянт ВПК-4,2 в количестве 0,3% (1,8 г на 20.0 мл ЮК или 9 г/л). Фпо- кулянт для полного внесения в КЖ растворяют 2 объемами воды.

Смесь перемешивают 5 мин, остав- ляют без перемешивания ,на 30 мин. Затем отфильтровывают. Скорость фильсоставляет 189 мл. Ферментативная актиш1ость щелочной протеазы

трации 130 . Объем фильтрата

составляет 189 мл. Ферментативная актиш1ость щелочной протеазы

3866 ед/мл. Содержание .микрофлоры снижается на 4 порядка (21.0 кол/мл), прозрачность фильтрата (коэффициен

осветления) 89%. Активация фермента 8,2%.

II р и м е р 3. По окончании ферментации КЖ Bacillus subtilis ш.т.ЮЗ содержащую нейтральную протеазу, в -количестве 500 мл доводят до р}1 6,5. Исходная активность нейтральной про- теазы 14,0 ед/мл. Добавляют 0,4% фло кулянта ВПК-402 (в пересчете на сухое вещество 6 г). Флокулянт раство- ряют 2 объемами воды. Смесь переме- 1 шивают 10 мин, оставляют в нокое на I 60 мин для полного формирования фло- кул, после чего образовавшийся оса- : ДОК отделяют центрифугированием. Ис- : ходная КЖ имеет обсемененность 10 кол/мл. Затраты времени на про- ведение технологических операций (до ведение рН, внесение растврренного I полиэлектролита, перемешивание и вы- I держка смеси) 1,5 ч. Очищенный, фильт рат в объеме 469 мл содержит I 15,7 ед/мл, содержание посторонней I мукрофлоры 2-10 кол/мл, коэффициент i осветления 84%. Активация фермента

Ll2%.

П р и м е р 4. 250 мл КЖ, содержащей нейтральную протеазу, подщелачи- вашт до р11 7,5. Добавляют 2% фильтро перлита и 0,5% (по сухому веществу) флокулянта ВПК-101, т.е. 20 г/л, так как. флокулянт содержит 25% сухих веществ. Смесь перемешивают 5 мин, затем выключают мешалку и оставляют без перемешивания 50 мин. Скоагулиро ванную биомассу отделяют фильтрова- : нлем. Скорость фильтрации -150 л/м -ч Исходная активность нейтральной п-ро- теазы составляет 12,4 ед/мл, в отфильтрованном растворе 1-3,6 ед/мл. Активация фермента 9,6%. Содержание

1

микрофлоры снижается на 2 порядка. Коэффициент осветления 89%.

II р и м е р 5. .К КЖ нейтральной протеазы (300 мл) с рН 7,0 добавл я- юТ флокулянт ВГ1К-402 в количестве 0,45%, что составляет 16,8 г/л, затем перемешивают 10 мин, оставляют без перемешивания 30 мин. Отделяют

скоагулированную биомассу центрифугированием. Исходная активность КЖ 11,5 ед/мл, содержание микрофлоры 10 кол/мл . Фильтрат в объеме 285 мл имеет активность 12,6 ед/мл и обсемененность 10 кол/мл, прозрачность 91%.

Результаты испытаний приведены в табл. 2.

20

Формула изобретения

Способ очистки культуральной жидкости микроорганизмов - продуцентов

5 протеолитических ферментов, предус- матрцвающий регулирование значения рН среды, осаждение биомассы путем добавления коагулирукщего агента, перемешивание, выдерживание до мак0 симального образования осадка с последующим его отделением, отличающийся тем, что, с целью повышения качества и ускорения процесса очистки, значение рН среды устанавливают до 5-8, в качестве коагулирующего агента используют катионогенный водорастворимый полиэлектролит поли-К,Ы-диметил-Н, Ы-ди- аллиламмоний хлорид или поли-4(ви- шш)И-бензилтриметиламмоний хлорид в количестве 3-5 г сухого вещества

в 1 л культуральной жидкости. Т а б л и ц а I

5

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к способу биотехнологии, и касается предварительной обработки ферментационных жидкостей в процессах получения очищенных ферментов. Цель изобретения - повышение качества и ускорение процесса очистки. Культуральную жидкость, полученную в результате ферментации продуцентов ферментов, подщелачивают до значения рН от 5 до 8, добавляют в качестве коагулирующего агента 3-5 г/л (по сухому веществу) катионогенные водорастворимые полиэлектролиты поли-N,Н-диметил-Ы,N- -диаллиламмонгш хлорид или поли-4 (винил)-N-бензилтриметиламмоний хлорид, перемешивают от 5 до 10 мин с интенсивностью 50-70 об/мин, а затем выдерживают до образования осадка от 30 до 60 мин. Осадок отделяют центрифугированием или фильтрованием с добавлением фильтроперлита. 2 табл. S (Л

Контроль (обработка по известному способу)

12800 бйО.

816 1017

Предлагаемый способ

10000 8000

9400

8120

816

1310

Объем биомассы с 1 м КЖ в кг

1 1,2

65

10 10«

275

1,Ь

90

10

10

58