СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТЫ, ШТАММ ESCHERICHIA COLI TDH7Δ MLC::CAT/PPRT614-ПРОДУЦЕНТ L-ТРЕОНИНА Российский патент 2005 года по МПК C12N1/21 C12P13/04 C12N1/21 C12R1/19 

Предпосылки к созданию изобретения

Область техники

Настоящее изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к способу получения L-аминокислот с использованием бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, в которых ген mlс инактивирован.

Предшествующий уровень техники

Белок Мlс является глобальным регулятором (репрессором) метаболизма углеводов (Decker et al, Mol Microbiol 1998, 27:2:381-90; Kimata et al, Mol Microbiol, 1998, 29:6:1509-19; Plumbridge, Mol Microbiol, 1998, 27:2:369-80). Было показано, что белок М1с регулирует экспрессию нескольких генов и оперонов. Это генptsG (Kimata et al, Mol Microbiol, 1998, 29:6:1509-19; Plumbridge, Mol Microbiol, 1998, 29:4:1053-63; Kirn et al, J Biol Chem, 1999, 274:36:25398-402; Plumbridge, Mol Microbiol 1999, 33:2:260-73; Tanaka et al, Genes Cells, 1999, 4:7:391-9), кодирующий субъединицу IICB(Glc) глюкозофосфотрансферазной системы (PTS), связанную с мембраной; оперон ptsHIcrr, кодирующий основные белки PTS (Kimata et al, Mol Microbiol, 1998, 29:6:1509-19; Plumbridge, Mol Microbiol, 1998, 29:4:1053-63; Kirn et al, J Biol Chem, 1999, 274:36:25398-402; Plumbridge, Mol Microbiol 1999, 33:2:260-73; Tanaka et al, Genes Cells, 1999, 4:7:391-9); оперон manXYZ, кодирующий фермент II PTS маннозы (Plumbridge, Mol Microbiol, 1998, 29:4:1053-63); ген та1Т, кодирующий активатор мальтозного регулона (Decker et al, Mol Microbiol 1998, 27:2:381-90).

Гены регулона т1с также позитивно регулируются комплексом CRP-cAMP (Chapon and Colb, J. Bacteriol, 1983, 156:1135-43; Decker et al, Mol. Microbiol, 1998,27:2:381-90; Kimata et al, Mol. Microbiol., 1998, 29:6:1509-19; Plumbridge, Mol. Microbiol., 1998, 27:2:369-80; Plumbridge, Mol. Microbiol, 1998, 29:4:1053-63; Kirn et al, J. Biol. Chem. 1999, 274:36:25398-402; Plumbridge, Mol. Microbiol 1999, 33:2:260-73; Tanaka et al, Genes Cells, 1999,4:7:391-9).

Регуляция транскрипции гена mlс является довольно сложной. Во-первых, транскрипция негативно регулируется самим белком Мlс. Нефосфорилированный белок EIICB(Glc) (продукт гена.ptsG) может удалять белок Мlс из его участка связывания путем прямого белок-белкового взаимодействия и, как следствие, индуцировать экспрессию регулона mlс в ответ на присутствие глюкозы (Tanaka et al, EMBO J, 2000, 19:20, 5344-52; Lee et al, EMBO J, 2000, 19:20:5353-61; Nam et al, EMBO J, 2001, 20:3:491-8). Во-вторых, транскрипция гена mlc осуществляется с двух промоторов Р1 и Р2 (Shin et al, J. Biol. Chem. 2001, 276:28:25871-75). Промотор P1 узнается только РНК-полимеразой, содержащей сигма-фактор σ ⁷⁰ (Еσ ⁷⁰), тогда как промотор Р2 узнается как Еσ ⁷⁰, так и Еσ ³², содержащей сигма-фактор теплового шока. Таким образом, ген mlc принадлежит к классу генов, транскрибируемых с множественных промоторов, один из которых узнается РНК-полимеразой, ассоциированной с альтернативным сигма фактором, для обеспечения ответа на различные условия окружающей среды. Дополнительно, в промоторе гена mlc присутствует высококонсервативный участок связывания CRP (Shin et al, J. Biol. Chem. 2001,276:28:25871-75).

Транспорт углеводов, осуществляемый с помощью PTS, может быть лимитирующей стадией в суперпродукции некоторых аминокислот. Поэтому инактивация продукта гена mlc, негативно регулирующего экспрессию генов PTS, кажется необходимой для увеличения продукции аминокислот. В популяции клеток Escherichia coli, выросших в условиях недостатка глюкозы, были найдены полигенные мутации в генах mgl, mlc и malT (Munch К., Genetics, 1999,153:1:5-12). Но в настоящее время отсутствуют сообщения об использовании инактивации гена mic для продукции L-аминокислот.

Описание изобретения

Целью настоящего изобретения является увеличение продуктивности штаммов продуцентов L-аминокислот и предоставление способа получения L-аминокислот с использованием указанных штаммов.

Данная цель была достигнута путем установления того факта, что инактивация гена mlс, кодирующего репрессор метаболизма углеводов, увеличивает продукцию L-аминокислоты, такой как L-треонин. Таким образом было совершено настоящее изобретение.

Настоящее изобретение включает в себя следующее:

1. Бактерия, принадлежащая к роду Escherichia, - продуцент L-аминокислоты, которая модифицирована с целью инактивации гена mlс.

2. Бактерия, принадлежащая к роду Escherichia, - продуцент L-аминокислоты, где указанной аминокислотой является L-треонин.

3. Способ получения L-аминокислоты, включающий стадии выращивания бактерии в соответствии с 1-2 в питательной среде с целью продукции и накопления L-аминокислоты в питательной среде и выделения L-аминокислоты из культуральной жидкости.

4. Способ в соответствии с 3, в котором указанной аминокислотой является L-треонин.

5. Способ в соответствии с 4, в котором указанная бактерия модифицирована с целью увеличения экспрессии L-треонинового оперона.

Настоящее изобретение будет описано ниже более подробно.

1. Бактерия согласно настоящему изобретению

Бактерией согласно настоящему изобретению является бактерия, принадлежащая к роду Escherichia, - продуцент L-аминокислоты, которая модифицирована с целью инактивации гена mlс.

Согласно настоящему изобретению “бактерия - продуцент L-аминокислоты” означает бактерию, обладающую способностью к накоплению L-аминокислоты в питательной среде, в условиях, когда бактерия согласно настоящему изобретению выращивается в указанной питательной среде. Способность к продукции L-аминокислоты может быть придана или улучшена путем селекции. Использованный здесь термин “бактерия - продуцент L-аминокислоты” также означает бактерию, обладающую способностью к продукции и накоплению в культуральной жидкости L-аминокислоты в количестве большем, чем природный или родительский штамм, в случае Е. coli, например, штамм Е. coli К-12.

Термин “бактерия, принадлежащая к роду Escherichia”, означает, что бактерия относится к роду Escherichia в соответствии с классификацией, известной специалисту в области микробиологии. В качестве примера микроорганизма, принадлежащего к роду Escherichia, использованного в настоящем изобретении, может быть упомянута бактерия Escherichia coli (E. coli).

Круг бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, не ограничен каким-либо образом, однако, например, бактерии, описанные в Neidhardt, F.C. et al. (Escherichia coli and Salmonella typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1208, Таблица 1) могут быть упомянуты.

Термин “ген mlс инактивирован” означает, что целевой ген модифицирован таким образом, что полученный модифицированный ген кодирует мутантный белок с пониженной способностью к регуляции или такой ген кодирует полностью неактивный белок. Также это означает, что модифицированный участок ДНК неспособен к осуществлению природной экспрессии белка Мlс вследствие делеции части этого гена или модификации участка, смежного с указанным геном.

Инактивация гена mlс, кодирующего репрессор PTS, приводит к увеличению поступления источника углерода, такого как глюкоза, внутрь клетки бактерии - продуцента L-аминокислоты.

Ген mlc кодирует белок Мlс (406 аминокислотных остатков), являющийся глобальным регулятором метаболизма углеводов. Ген mlc (gi: 16129552; номера нуклеотидов с 1665368 по 1666588 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.1 в базе данных GenBank) расположен между генами b1593 ynfL в хромосоме штамма Е. coli К-12.

Инактивация гена может быть осуществлена традиционными методами, такими как мутагенез с использованием УФ-излучения или обработка нитрозогуанидином (N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин), сайт-направленный мутагенез, разрушение гена с использованием гомологичной рекомбинации или/и инсерционно-делеционный мутагенез (Datsenko K.A. and Wanner B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97:12: 6640-45), также называемый “интеграция с использованием Red-системы”.

Бактерия - продуцент L-треонина

В качестве бактерии согласно настоящему изобретению может быть использована бактерия - продуцент L-треонина, которая модифицирована с целью инактивации гена mlc.

Бактерия согласно настоящему изобретению может быть улучшена путем увеличения экспрессии одного или нескольких генов, вовлеченных в биосинтез L-треонина. Примерами таких генов являются гены треонинового оперона, то есть thr оперона, предпочтительно включающие мутантный ген thrA, кодирующий аспартокиназу-гомосериндегидрогеназу I, устойчивую к ингибированию треонином по типу обратной связи; ген thrB, кодирующий гомосеринкиназу; ген thrC, кодирующий треонинсинтазу. Другим предпочтительным воплощением указанной бактерии является бактерия, модифицированная с целью увеличения экспрессии гена rhtA, кодирующего предполагаемый трансмембранный белок. Следующим предпочтительным воплощением указанной бактерии является бактерия, модифицированная с целью увеличения экспрессии гена aspC, кодирующего аспартатаминотрансферазу (аспартаттрансаминазу) (патентная заявка РФ №2002104983).

Наиболее предпочтительным воплощением бактерии согласно настоящему изобретению является бактерия, модифицированная с целью увеличения экспрессии гена aspC, мутантного гена thrA, генов thrB, thrC, rhtA и модифицированная с целью инактивации гена mlс.

В качестве родительского штамма могут быть использованы штаммы – продуценты L-треонина, принадлежащие к роду Escherichia, такие как штамм Е. coli ВКПМ В-3996 (патенты США 5,175,107 и 5,705,371), штамм Е. coliNRRL-21593 (патент США 5,939,307), штамм Е. coli FERM ВР-3756 (патент США 5,474,918), штаммы Е. coli FERM ВР-3519 и FERM ВР-3520 (патент США 5,376,538), штамм Е. coli MG442 (Гусятинер и др.. Генетика, 14, 947-956 (1978)), штаммы Е. coli VL643 и VL2055 (европейская патентная заявка ЕР 1149911 А) и подобные им.

Бактерия согласно настоящему изобретению может быть получена путем инактивации гена mlс в бактерии, уже обладающей способностью к продукции L-аминокислоты. С другой стороны, бактерия согласно настоящему изобретению может быть получена путем придания бактерии, уже содержащей инактивированный ген mlс, способности к продукции L-аминокислоты.

Методами получения плазмидной ДНК, разрезания и лигирования ДНК, трансформации, выбора олигонуклеотидов в качестве затравок и подобные им могут быть обычные методы, хорошо известные специалисту в данной области. Эти методы описаны, например, в книге Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, Т., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).

2. Способ согласно настоящему изобретению

Способом согласно настоящему изобретению является способ получения L-аминокислоты, включающий стадии выращивания бактерии согласно настоящему изобретению в питательной среде с целью продукции и накопления L-аминокислоты в питательной среде, и выделения L-аминокислоты из культуральной жидкости. Более конкретно, способом согласно настоящему изобретению является способ получения L-треонина, включающий стадии выращивания бактерии согласно настоящему изобретению в питательной среде с целью продукции и накопления L-треонина в питательной среде, и выделения L-треонина из культуральной жидкости.

Согласно настоящему изобретению выращивание, выделение и очистка L-аминокислоты из культуральной или подобной ей жидкости может быть осуществлена способом, подобным традиционным способам ферментации, в которых аминокислота продуцируется с использованием микроорганизма.

Питательная среда, используемая для выращивания, может быть как синтетической, так и натуральной, при условии, что указанная среда содержит источники углерода, азота, минеральные добавки и, если необходимо, соответствующее количество питательных добавок, необходимых для роста микроорганизмов. К источникам углерода относятся различные углеводы, такие как глюкоза и сахароза, а также различные органические кислоты. В зависимости от характера ассимиляции используемого микроорганизма, могут использоваться спирты, такие как этанол и глицерин. В качестве источника азота могут использоваться различные неорганические соли аммония, такие как сульфат аммония, другие соединения азота, такие как аммиак и амины, природные источники азота, такие как пептон, гидролизат соевых бобов, ферментолизат микроорганизмов. В качестве минеральных добавок могут использоваться фосфат калия, сульфат магния, хлорид натрия, сульфат железа, сульфат марганца, хлорид кальция и подобные им соединения. В качестве витаминов могут использоваться тиамин, дрожжевой экстракт и подобные вещества.

Выращивание осуществляется предпочтительно в аэробных условиях, таких как перемешивание культуральной жидкости на качалке, взбалтывание с аэрацией, при температуре в пределах от 20 до 40° С, предпочтительно в пределах от 30 до 38° С, рН среды поддерживают в пределах от 5 до 9, предпочтительно от 6.5 до 7.2. рН среды может регулироваться аммиаком, карбонатом кальция, различными кислотами, основаниями и буферными растворами. Обычно выращивание в течение от 1 до 5 дней приводит к накоплению целевой L-аминокислоты в культуральной жидкости.

После выращивания твердые остатки, такие как клетки, могут быть удалены из культуральной жидкости методом центрифугирования или фильтрацией через мембрану, а затем L-аминокислота может быть выделена и очищена методами ионообменной хроматографии, концентрирования и кристаллизации.

Краткое описание чертежей.

На Фиг.1 показано относительное расположение затравок mlcIL и mlcIR на плазмиде pACYC 184, использовавшейся для амплификации гена cat.

На Фиг.2 показано конструирование хромосомного фрагмента ДНК, содержащего неактивный ген mlс.

Наилучший способ осуществления изобретения

Более детально настоящее изобретение будет разъяснено ниже со ссылкой на Примеры.

Пример 1. Конструирование штамма с неактивным геном mlс.

1. Получение делении в гене mlс.

Делецию в гене mlс получали методом, впервые разработанным Datsenko and Wanner (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12), 6640-6645), также называемым “интеграцией с использованием Red-системы”. В соответствии с указанным методом были получены затравки для ПЦР mlcIL (SEQ ID NO: 1) и mlcIR (SEQ ID NO: 2), каждая из которых содержала участки, гомологичные как участкам, смежным с геном mlс, так и к гену, придающему устойчивость к антибиотику, расположенному на плазмиде, использовавшейся в качестве матрицы. В качестве матрицы для ПЦР использовали плазмиду pACYC 184 (NBL Gene Sciences Ltd., Великобритания) (инвентарный номер Х06403 в базе данных GenBank/EMBL). Температурные условия ПЦР были следующими: начальная денатурация ДНК в течение 3 минут при 95° С; профиль для двух первых циклов: 1 мин при 95° С, 30 секунд при 34° С, 40 секунд при 72° С; профиль для следующих 30 циклов: 30 секунд при 95° C, 30 секунд при 50° С, 40 секунд при 72° С; и финальная полимеризация в течение 5 минут при 72° С.

Полученный продукт ПЦР длиной 935 п.о. (Фиг.1, SEQ ID NO: 3) очищали в агарозном геле и использовали для электропорации штамма Е. coli MG1655, содержащего плазмиду pKD46 с репликоном, чувствительным к температуре. Плазмида pKD46 (Datsenko and Wanner, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12), 6640-6645) содержит ДНК фрагмент (2154 пар нуклеотидов, 31088 - 33241) фага лямдба (номер J02459 в базе данных GenBank), состоящий из генов λ Red-системы гомологичной рекомбинации (гены γ , β и ехо) под контролем промотора Р_агаВ, индуцируемого арабинозой. Плазмида pKD46 необходима для интеграции продукта ПЦР в хромосому штамма MG1655.

Электрокомпетентные клетки получали следующим образом: ночную культуру клеток штамма Е. coli MG1655, выросшую при 30° С на LB-среде, содержащей ампициллин (100 мг/л), разбавляли в 100 раз 5 мл среды SOB (Sambrook et al, "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)), содержащей ампициллин и L-арабинозу (1 мМ). Полученную культуру выращивали с аэрацией при 30° С до достижения оптической плотности OD₆₀₀≈_{0.6, затем концентрировали в 100 раз и промывали 3 раза деионизованной водой с температурой около 0° С. Электропорацию проводили, используя 70 мкл клеток и приблизительно 100 нг продукта ПЦР. Клетки после электропорации инкубировали с аэрацией в 1 мл среды SOC (Sambrook et al, "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) при 37° С в течение 2.5 часов, а затем высевали на L-агар и выращивали при 37° C для того, чтобы отобрать рекомбинантные бактерии, устойчивые к хлорамфениколу (Сm^R). Затем, чтобы удалить плазмиду pKD46, проводили 2 пассажа при 42° С на L-агаре с хлорамфениколом и полученные колонии проверяли на чувствительность к ампициллину.}

Подтверждение деления гена mlс с помощью ПЦР

Наличие делеции гена mlс в мутантах, маркированных геном устойчивости к хлорамфениколу, проверяли с помощью ПЦР. Для подтверждения использовали локус-специфические затравки mlcPL (SEQ ID NO: 4) и mlcPR (SEQ ID NO: 5). Температурные условия ПЦР были следующими: начальная денатурация ДНК в течение 3 минут при 94° С; профиль для 30 циклов: 30 секунд при 94° С, 30 секунд при 52° С, 2 минуты при 72° С; и финальная полимеризация в течение 7 минут при 72° С. Продукт ПЦР, полученный в ходе амплификации ДНК из к четок родительского Mlc⁺ штамма MG1655, содержал 1492 нуклеотида (Фиг.2, SEQ ID NO: 6). Продукт ПЦР, полученный в ходе амплификации ДНК из клеток мутантного штамма MG1655 Δ mlc::cat, содержал 1191 нуклеотида (Фиг.2, SEQ ID NO: 7).

3. Конструирование штамма с инактивированным геном mlc - продуцента L-20 треонина.

Делецию Δ mlc::cat вводили в штамм Е. coli TDH7/pPRT614 - продуцент треонина (ВКПМ В-5318, патент США 6,132,999) с помощью стандартной процедуры трансдукции фагом PI (Sambrook et al, "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)). В качестве донора использовали штамм MG1655 25 Δ mlc::cat. Наличие делеции Δ mlc::cat в гене mic в полученном штамме TDH7Δ mlc::cat/pPRT614 проверяли с помощью ПЦР с использованием затравок rnlcPL (SEQ ID NO: 4) и rnlcPR (SEQ ID NO: 5).

Пример 2. Продукция L-треонина штаммом Е. coli с инактивированным геном m1с.

Каждый из штаммов Е. coli TDH7/pPRT614 и TDH7Δ mlc::cat/pPRT614 выращивали в течение 18-24 часов при 37° С на чашках с L-агаром, содержащим стрептомицин (50 мкг/мл). Затем одну петлю клеток переносили в 50 мл L-бульона следующего состава: триптон - 10 г/л, дрожжевой экстракт - 5 г/л, NaCl - 5 г/л. Клетки (50 мл, OD₅₄₀=0.12 о.е.), выросшие на качалке (140 об/мин) при 37° С в течение 4 часов, использовали для засева 450 мл 10 питательной среды для ферментации. Ферментацию до истощения источника углерода (batch fermentation) проводили в лабораторном ферментере объемом 1 л при аэрации (1/1 объем/объем/мин) при перемешивании со скоростью 1200 об/мин при 39° С. Значение рН поддерживали при 6.6 в автоматическом режиме с использованием 8% водного раствора аммиака. Результаты представлены в Таблице 1.

Состав среды для ферментации (г/л):

Глюкоза 100.0

NH₄Cl 1.75

КН₂РO₄ 1.0

MgSO₄×_{7H2O 0.8}

FeSO₄×_{7H2O 0.01}

MnSO₄×_{5H2O 0.01}

Mameno(TN) 0.15

Бетаин 1.0

Глюкозу и сульфат магния стерилизовали раздельно. рН поддерживали при 6.6

Таблица 1.ШтаммКоличество L-треонина, г/лВыход, %DCW, г/лВремя выращивания, чTDH7/pPRT61412.613.316.622.8TDH7Δ mlc::cat/pPRT61416.918.216.821.7

Как видно из Таблицы 1, инактивация гена mlс повышает продукцию L-треонина штаммом TDH7/pPRT614 - продуцентом L-треонина.

Изобретение относится к биотехнологии. L -аминокислоты получают с использованием бактерии, принадлежащей к роду Escherichia, в которой инактивирован ген mlc, кодирующий глобальный регулятор метаболизма углеводов. Для получения такой аминокислоты, как L - треонин используют штамм Escherichia coli TDH7Δmlc::cat/pPRT614, в котором ген mlc инактивирован. Данное изобретение позволяет получать L - аминокислоты с высокой степенью эффективности. 2 н. и 3 з.п. ф-лы, 2 ил., 1 табл.

1. Способ получения L-аминокислоты, включающий стадии выращивания бактерии Escherichia coli в питательной среде и выделения из культуральной жидкости полученной и накопленной в ней L-аминокислоты, отличающийся тем, что в качестве продуцента -L-аминокислоты используют бактерию Escherichia coli, модифицированную таким образом, что ген mlc в указанной бактерии инактивирован.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанной L-аминокислотой является L-треонин.3. Способ по п.2, отличающийся тем, что в указанной бактерии дополнительно усилена экспрессия треонинового оперона.4. Способ по п.3, отличающийся тем, что в качестве продуцента L-треонина используют штамм Escherichia coli ТDH7Δmlc::cat/pPRT614.5. Штамм Escherichia coli TDH7Δmlc::cat/pPRT614 - продуцент L-треонина.