СПОСОБ БИОХИМИЧЕСКОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ СТЕПЕНИ АКТИВНОСТИ ХРОНИЧЕСКОГО ГЕПАТИТА Российский патент 2005 года по МПК G01N33/52 G01N33/576 G01N33/68 

Изобретение относится к области медицины, а именно биохимии, и может быть использовано, в частности, для определения степени активности хронического гепатита.

В практической медицине известны способы определения активности хронического гепатита, основанные на общеклинических данных (Григорьев П.Я., Яковенко Э.П. Диагностика и лечение болезней органов пищеварения. - М.: Медицина, 1996. - 515 с.; Шерлок Ш., Дули Дж. Заболевания печени и желчных путей. - М.: ГЭОТАР, 1999. - 859 с.).

Недостатками этих способов являются:

высокая степень субъективности;

недостаточно хорошая воспроизводимость.

Наиболее близким способом к предлагаемому является способ определения активности хронического гепатита, основанный на оценке концентрации желчных кислот сыворотки крови (Axelson М., Mork В., Aly A., Waldivs G. Concentration of bile acids in plasma from patients with liver disease // J. Lipid. Res. - 1999. - Vol.40, № 6. - P.1788-1792).

Данный способ имеет следующие недостатки: способ не является достаточно точным, так как имеет достаточно широкую “серую зону”, в пределах которой достоверность интерпретации уровня сывороточных желчных кислот для определения степени активности хронического гепатита низкая.

Целью представленного изобретения является повышение точности определения степени активности хронического гепатита.

Поставленная цель в изобретении достигается тем, что в сыворотке крови определяют уровень лактоферрина и желчных кислот и при их отношении, равном 5-17, определяют хронический гепатит высокой активности.

Изолированное определение желчных кислот сыворотки крови в ряде случаев не позволяет однозначно диагностировать хронический гепатит высокой степени активности, так как высокий уровень желчных кислот характерен и для цирроза печени (Григорьев П.Я., Яковенко Э.П., 1996). Определение только лактоферрина в данном случае также не является информативным, так как снижение уровня этого белка наблюдается при целом ряде патологических состояний (Николаев А.А., 1994). Одновременное определение в сыворотке крови уровня лактоферрина и уровня желчных кислот с последующим определением соотношения между ними позволяет значительно повысить эффективность способа определения хронического гепатита высокой степени активности.

Таким образом, преимущество предлагаемого способа в более высокой диагностической точности при определении хронического гепатита высокой степени активности.

Положительный эффект предлагаемого способа достигается точностью оценки сывороточного уровня лактоферрина и желчных кислот.

Предложенный способ был успешно апробирован в I Александро-Мариинской Областной клинической больнице с января 2001 года по январь 2003 года на 128 пациентах с хроническими диффузными заболеваниями печени.

Ниже приводятся результаты апробации.

Пример 1.

Больной И-в Т. М., 39 лет (история болезни № 15947), находился в клинике с 3.10.2002 по 29.10.2002 г. Поступил со следующими жалобами: тупые боли в правом подреберье, плохой аппетит, снижение массы тела, слабость, кожный зуд.

Объективно: состояние удовлетворительное, кожные покровы с желтушным оттенком, склеры субиктеричны, телеангиэктазии на лице, шее, груди, пальмарная эритема. Легкие и сердце без особенностей. Живот мягкий, слегка болезненный в правом подреберье. Размеры печени по Курлову: 13-11-8 см, при пальпации край мягкий, закруглен. Селезенка пальпаторно и перкуторно не увеличена.

Для определения уровня желчных кислот сыворотки крови был использован энзиматический метод.

В основе метода лежит ферментативная реакция окисления 3-альфа-гидрокси группы желчных кислот в оксо группу под действием фермента 3-альфа-гидроксистероиддегидрогеназы и дальнейший перенос атома водорода с помощью фермента диафоразы и НАД на нитросиний-тетразолий с образованием окрашенных продуктов. Интенсивность окраски прямо пропорциональна концентрации желчных кислот в сыворотке крови. Схема проведения реакции такова:

1) Пробы 20 мкл сыворотки крови или стандартного раствора желчных кислот помещают в пробирки.

2) Добавление Реагента А из набора 0,5 мл.

3) Экспозиция при 37°С 5 минут.

4) Добавление Реагента Б из набора 0,5 мл.

5) Экспозиция при 37°С 15 минут.

6) Добавление стоп-реагента 0,2 мл.

7) Колориметрия при 530 нм.

Параллельно с анализом проб проводили исследование стандартных разведений желчных кислот для построения калибровочных кривых.

Уровень желчных кислот сыворотки крови составил 113,2 мкмоль/л.

Уровень лактоферрина сыворотки крови определяли методом иммуноферментного анализа.

В настоящей работе нами использовался твердофазный иммуноферментный анализ, когда на нерастворимый носитель сорбируется белок (антиген или антитело) и далее все иммунохимические взаимодействия происходят на этом носителе.

В качестве твердой фазы мы применяли 96-луночные плашки фирмы “Linbro”. В лунки вносили 200 мкл специфических антител (2-5 мкг), инкубировали в течение 16-20 часов и отмывали, используя забуференный физиологический раствор (рН 7,2), содержащий 0,05% твина-20. После промывки в лунки вносили по 200 мкл последовательных разведений стандартного антигена, обычно содержащие от 0,1 до 200 нг/мл белка, исследуемые образцы и отмывающий раствор (контроль).

После инкубации и промывки вносили 200 мкл антител к исследуемому антигену, ковалентно связанных с ферментом (конъюгат) в разведении, которое устанавливалось эмпирически. После инкубации и промывки проводили ферментативную реакцию и спектрофотометрию. Калибровочный график строили в каждом опыте. Чувствительность метода в нашей работе составила 6 нг/мл.

Конъюгацию антител с ферментом проводили перийодатным окислением. Растворяли 5 мг пероксидазы-6 (“Sigma”) в 1 мл дистиллированной воды, прибавляли 2 мл свежеприготовленного 0,1 М раствора перийодата натрия и перемешивали в течение 30-40 минут при комнатной температуре. Альдегидный раствор пероксидазы диализовали против 10 мл карбонатного буфера (рН 9,5) и добавляли 10 мг специфических антител, растворенных в том же буфере, после чего перемешивали при комнатной температуре 2-3 часа. В полученную смесь добавляли 0,1 мл 0,4% раствора боргидрида натрия и оставляли на 2 часа при комнатной температуре. Для стабилизации к конъюгату добавляли бычий сывороточный альбумин до 1%, глицерин до 40% и хранили при -20°С до использования.

Сывороточный уровень лактоферрина составил 917,2 нг/мл.

Соотношение рассчитывали по формуле:

уровень лактоферрина (нг/мл)/уровень желчных кислот (мкмоль/мл).

Соотношение составило 917,2/113,2=8,1. Так как 8,1 входит в диапазон 5-17, то больному поставлен диагноз: хронический гепатит высокой степени активности.

Проведенное в дальнейшем клинико-инструментальное исследование, включавшее рентгенологические, ультразвуковые и др. методы исследования, позволило полностью верифицировать поставленный диагноз.

Пример 2.

Больной М-в В. В., 22 лет (история болезни №7539), находился в клинике с 8.02.2002 по 27.02.2002 г. Поступил с жалобами на периодические ноющие боли в правом подреберье. Больным себя считает с 1999 г., когда перенес острый вирусный гепатит “В”.

Объективно: состояние удовлетворительное, кожные покровы обычной окраски. Легкие и сердце без особенностей. Живот мягкий, при пальпации умеренно болезненный в правом подреберье и эпигастральной области. Размеры печени по Курлову: 9-8-7 см, при пальпации край мягкий, закруглен. Селезенка пальпаторно и перкуторно не увеличена.

В вирусном маркерном спектре: HbsAg (+), HbeAg (-), aHCV (+), aHDV (-).

Уровень желчных кислот сыворотки крови, определенный по описанному выше методу (см. пример 1), составил 37,7 мкмоль/мл, а уровень лактоферрина, определенный иммуноферментным методом (см. пример 1), составил 1690,0 нг/мл.

Соотношение составило 1690,0/37,7=44,8. Так как 44,8 не входит в диапазон 5-17, то больному при постановке диагноза высокая степень активности была исключена. Диагноз: хронический гепатит сочетанной вирусной этиологии (В+С), минимальной степени активности.

Проведенное в дальнейшем клинико-инструментальное исследование, включавшее рентгенологические, ультразвуковые и др. методы исследования, позволило полностью верифицировать поставленный диагноз.

Пример 3.

Больная Ш-а О. Д., 52 лет (история болезни № 13471), находилась в клинике с 21.08.2001 по 22.09.2001 г. Жалобы: тупые боли в правом подреберье, кожный зуд, слабость, утомляемость, сонливость в дневные часы, увеличение живота в объеме, тошнота, сухость во рту, десневые, носовые кровотечения, геморраггии на коже, судороги в конечностях, артралгии, дрожание рук, головы, отечность ног, малое количество мочи.

Объективно: состояние тяжелое, заторможена, кожные покровы желтушной окраски, со следами расчесов, телеангиэктазии на теле, геморрагии на конечностях, теле, склеры субиктеричны, “печеночный” язык, пальмарная эритема. Отеки нижних конечностей. Легкие и сердце без особенностей. Живот увеличен в объеме за счет свободной жидкости в брюшной полости, болезненный при пальпации в правом подреберье. Размеры печени по Курлову: 10-7-7 см, при пальпации край плотный, неровный. Пальпируется нижний полюс селезенки на вдохе.

Уровень желчных кислот сыворотки крови, определенный по описанному выше методу (см. пример 1), составил 98,3 мкмоль/л. Уровень лактоферрина, определенный иммуноферментным методом (см. пример 1) составил 302,1 нг/мл.

Соотношение составило 302,1/98,3=3,07. Так как 3,07 не входит в диапазон 5-17, то больному при постановке диагноза гепатит высокой степени активности был исключен. Диагноз: цирроз печени.

Проведенное в дальнейшем клинико-инструментальное исследование, включавшее рентгенологические, ультразвуковые и др. методы исследования, позволило полностью верифицировать поставленный диагноз.

Предлагаемым способом достигается положительный эффект: повышается точность определения степени активности хронического гепатита. Это позволяет своевременно назначить адекватное лечение, что повышает его эффективность, а значит, улучшает прогноз для больного.

Предлагаемый способ может быть использован в клинической практике для определения степени активности хронического гепатита.

Изобретение относится к области медицины, а именно биохимии, и может быть использовано для определения степени активности хронического гепатита. В сыворотке крови определяют уровень лактоферрина и желчных кислот. При их отношении, равном 5-17, определяют хронический гепатит высокой активности. Способ позволяет повысить точность определения степени активности хронического гепатита.

Способ биохимического определения степени активности хронического гепатита путем оценки уровня желчных кислот сыворотки крови, отличающийся тем, что в сыворотке крови определяют уровень лактоферрина и желчных кислот и при их соотношении, равном 5-17, определяют хронический гепатит высокой активности.