СПОСОБ ИССЛЕДОВАНИЯ ПОГЛОТИТЕЛЬНОЙ И МЕТАБОЛИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ НЕЙТРОФИЛОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ МЕТОДАМИ ФАГОЦИТОЗА И НСТ-ТЕСТА Российский патент 2005 года по МПК G01N33/52 

Известен способ определения поглотительной активности нейтрофилов периферической крови с использованием в качестве тест-системы окрашенных частиц латекса диаметром 3 мкм (Медведев А.Н., Чаленко В.В. Способ исследования поглотительной фазы фагоцитоза // Лабораторное дело, 1991, №2, с.19-20).

Известен способ исследования реакций бактериального фагоцитоза нейтрофилами капиллярной крови (Нестерова И.В., Слынько Л.И., Светличная М.А., Майченко Л.Г. Диагностика изменений в микробицидной системе нейтрофильных гранулоцитов при аллергических заболеваниях / Методические рекомендации. Краснодар, 1989, с.11-12).

Известен способ исследования кислородзависимого метаболизма нейтрофилов периферической крови с использованием в качестве тест-системы лабораторного штамма Staphylococcus aureus P-209 (Park B.H., Fikrig S.M., Smithwich E.M. Infection and nitrobluetetrazolium reduction by neutrophils; a diagnostic aid // Lancet, 1968, vol.11, №2, p.532-534).

Существует также способ исследования метаболической активности нейтрофилов (Виксман М.Е., Маянский А.Н. Характеристика опсонических факторов по реакции восстановления нитросинего тетразолия нейтрофилами человека // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 1980, т.89, №2, с.214-215).

Каких либо работ, описывающих определение поглотительной фазы фагоцитоза и метаболической активности нейтрофилов периферической крови в порядке одного исследования, в литературе не обнаружено.

Целью изобретения является оптимизация исследования, сокращение времени, удешевление и повышение его чувствительности.

Эта цель достигается тем, что гепаринизированную венозную кровь ребенка разливают в пять конических пробирок по 0,1 мл, первые три из которых содержат по 0,1 мл суспензии неокрашенного латекса с размером частиц 1,5 мкм, 4-я - 0,1 мл среды 199 и 0,1 мл 0,1% водного раствора нитросинего тетразолия (НСТ), 5-я - 0,1 мл суспензии латекса и 0,1 мл 0,1% водного раствора НСТ, инкубируют в термостате при t 37°С: 1-ю пробирку - 5 мин, 2-ю - 30 мин, 3-ю - 1 час, 4-ю и 5-ю - 40 мин; готовят из 0,2 мл инкубационной смеси мазки на стеклах, высушивают при t 37°С, фиксируют в пламени горелки, окрашивают 1% водным раствором метиленового синего, повторно высушивают и микроскопируют под иммерсией при увеличении 90×10, причем результаты исследования оценивают по поглотительной активности в реакциях фагоцитоза, определяя процент фагоцитирующих клеток, фагоцитарное число, фагоцитарный интегральный индекс и показатели скорости фагоцитоза, а реакцию НСТ-теста определяют путем подсчета процента формазан-позитивных клеток, вычисления цитохимического показателя активности и индекса стимуляции НСТ-теста.

Пример 1. Исследование поглотительной фазы фагоцитоза и метаболической активности нейтрофилов периферической крови было проведено у 36 практически здоровых детей в возрасте от 1 месяца до 5 лет. Первую группу составили 16 детей в возрасте до 1 года (средний возраст - 4,2±1,1 мес), вторую группу - 20 детей в возрасте от 1 года до 5 лет (2,9±1,8 лет). Зависимость показателей функциональной активности нейтрофилов периферической крови от возраста детей представлена в табл.1.

Таблица 1
Показатели фагоцитоза и НСТ-теста у здоровых детейПоказатель1 группа(n=16)2 группа (n=20)Достоверность различияФАГОЦИТОЗ%Ф 5 мин31,8±6,255,3±7,2Р<0,05ФЧ 5 мин2,66±0,782,57±0,61 %Ф 30 мин53,2±7,376,8±5,9Р<0,05ФЧ 30 мин2,86±0,323,84±0,48Р<0,05%Ф 1 час77,4±3,988,5±5,5Р<0,05ФЧ 1 час4,47±0,986,69±0,81Р<0,05КФЧ10,72±0,080,68±0,06 КФЧ20,59±0,070,41±0,05Р<0,05ФИИ2,01±0,512,94±0,55 Спонтанный НСТ-тест%ПК36,5±4,426,1±3,3Р<0,05ЦПА0,97±0,090,62±0,03Р<0,05Стимулированный НСТ-тест%ПК50,0±5,844,3±5,6 ЦПА1,46±0,111,28±0,17 ИСНСТ1,51±0,121,84±0,10Р<0,05

Исследование реакций фагоцитоза и НСТ-теста проводят параллельно, из одной порции биосубстрата, с применением идентичных реактивов, красителей, лабораторной посуды и оборудования.

В качестве тест-системы используют частицы неокрашенного латекса (10% полистирольная суспензия) диаметром 1,5 мкм производства фирмы ДИАэМ, Россия. При постановке НСТ-теста, кроме этого, используют нитросиний тетрозолий (НСТ) - С₄₀Н₃₀Сl₂N₁₀О₆ с молекулярным весом 817,65 производства Германии.

Методика фагоцитоза. Три конических пробирки, содержащих 0,1 мл суспензии латекса и 0,1 мл гепаринизированной венозной крови, инкубируют в термостате при 37°С (1-ю пробирку - 5 минут, 2-ю - 30 минут, 3-ю - 1 час). Готовят мазки инкубационной смеси на стекле, которые после высыхания, фиксации в пламени горелки, окраски 1% метиленовым синим микроскопируют при увеличении 90×10 под иммерсией. Учитывают данные на 100 нейтрофилов, из которых рассчитывают фагоцитарную активность (%Ф) - процент фагоцитирующих нейтрофилов; фагоцитарное число (ФЧ) - среднее количество частиц, захваченных одной клеткой, и фагоцитарный интегральный индекс (ФИИ) - среднее число поглощенных частиц латекса на 100 нейтрофилов. Высчитывают коэффициенты фагоцитарного числа (КФЧ), характеризующие скорость фагоцитоза: отношение ФЧ 5 мин к ФЧ 30 мин - КФЧ 1 и отношение ФЧ 5 мин к ФЧ 1 час - КФЧ 2.

Из той же порции крови одновременно с исследованием реакций фагоцитоза ставится НСТ-тест: 0,1 мл гепаринизированной крови и 0,1 мл 0,1% водного раствора НСТ инкубируют в конических пробирках при 37°С в течение 40 минут с 0,1 мл среды 199 - спонтанный НСТ-тест или с 0,1 мл суспензии латекса - стимулированный НСТ-тест. Аналогично приготовлению мазка для фагоцитоза готовят мазки: 0,2 мл инкубационной смеси наносят на стекло, просушивают, фиксируют, окрашивают 1% раствором метиленового синего, высушивают и микроскопируют под иммерсией при увеличении 90×10. Оценка НСТ-теста проводится по следующим показателям: % ПК - процент формазан-позитивных нейтрофилов; вычисляется индекса стимуляции НСТ-теста (ИС НСТ) - отношение % ПК в стимулированном НСТ-тесте к % ПК в спонтанном НСТ-тесте. С целью вычисления цитохимического показателя активности (ЦПА) проводят визуальную оценку количества гранул диформазана в нейтрофилах с использованием принципа Kaplow L.S. по формуле

где а, b, с, d, е - количество клеток соответственно 0, 1, 2, 3, 4-й степени.

Пример 2. Ребенок Р. Яна, 7 мес, поступила в отделение реанимации и интенсивной терапии Морозовской детской клинической больницы (МДКБ) по наряду скорой помощи из дома с диагнозом: Острая пневмония?, дыхательная недостаточность II степени. При обследовании в стационаре была выявлена острая полисегментарная деструктивная пневмония.

На 3-й, 10-й и 30-й день болезни ребенку было проведено исследование функциональной активности нейтрофилов (табл.2). Исследование проводилось аналогично примеру 1.

Таблица 2
Показатели функциональной активности нейтрофилов периферической крови ребенка Р. Яны, 7 мес.Показатели3-й день болезни10-й день болезни30-й день болезниНормальные значенияФАГОЦИТОЗ%Ф 5 мин2770*3231,8±6,2ФЧ 5 мин3,223,91*2,812,66±0,78%Ф 30 мин4684*4853,2±7,3ФЧ 30 мин3,266,83*3,742,86±0,32%Ф 1 час60*89*7477,4±3,9ФЧ 1 час4,015,92*5,504,47±0,98КФЧ10,79*0,83*0,730,72±0,08КФЧ20,47*0,75*0,510,59±0,07ФИИ7,09*4,84*1,422,01±0,51Спонтанный НСТ-тест%ПК2860*3436,5±4,4ЦПА0,52*0,970,880,97±0,09Стимулированный латексом НСТ-тест%ПК34*87*5550,0±5,8ЦПА1,84*2,20*1,551,46±0,11ИСНСТ1,21*1,451,621,51±0,12* - достоверность различия с нормальными значениями Р<0,05.

При исследовании зависимости показателей фагоцитоза от времени инкубации было установлено, что % Ф и ФЧ достоверно увеличиваются во времени, достигая максимальных значений к 1 часу. При дальнейшей инкубации показатели фагоцитарной активности не меняются. На чертеже представлена зависимость показателя %Ф нейтрофилов от времени инкубации в минутах. Очевидно, что длительная инкубация, предлагаемая в некоторых методиках, при исследовании поглотительной фазы фагоцитоза с применением в качестве тест-системы частиц латекса не рациональна. Инкубация в течение 1 часа является достаточной для достоверной оценки фагоцитарной активности нейтрофилов, одновременно сокращая временные затраты на проведение исследования.

Установлено, что для одновременного исследования поглотительной фазы в реакциях фагоцитоза и кислородзависимого метаболизма нейтрофилов периферической крови методом НСТ-теста рационально использовать неокрашенный латекс с диаметром частиц 1,5 мкм. Использование более крупных и/или окрашенных частиц латекса затрудняет визуальную оценку стимулированного НСТ-теста по принципу Kaplow. Более мелкие частицы латекса захватываются нейтрофилами в значительном количестве (20-30 частиц на одну клетку), что затрудняет подсчет с применением обычного светового микроскопа.

Установлено влияние формы дна пробирки - круглой и конической. В конических пробирках наблюдаются более высокие значения как показателей фагоцитоза, так и НСТ-теста. По-видимому, повышение показателей функциональной активности нейтрофилов обусловлено влиянием короткодистанционного взаимодействия. Это послужило критерием выбора лабораторной посуды, как было отмечено в примере 1, при проведении исследования используются пробирки конической формы.

В ходе проведенного исследования зависимости поглотительной способности и метаболической активности нейтрофилов от различных стабилизаторов крови установлено, что трилон Б (динатриевая соль ЭДТА), в отличие от гепарина подавляет фагоцитоз, снижает кислородзависимый метаболизм нейтрофилов.

Пример 3. Ребенок С. Филипп, 5 лет, поступил в 8 отделение МДКБ с диагнозом: правосторонняя полисегментарная пневмония. Исследование фагоцитарной и метаболической активности нейтрофилов периферической крови было проведено на 4-й день и на 22-й день заболевания по методике, описанной в примере 1 (табл.3).

Таблица 3
Показатели функциональной активности нейтрофилов периферической крови ребенка С. Филиппа, 5 летПоказатель4-й день болезни22-й день болезниНормальные значенияФАГОЦИТОЗ%Ф 5 мин80*6355,3±7,2ФЧ 5 мин2,72,312,57±0,61%Ф 30 мин97*7976,8±5,9ФЧ 30 мин5,43*3,593,84±0,48%Ф 1 час98*8988,5±5,5ФЧ 1 час4,84*5,996,69±0,81КФЧ10,51*0,640,68±0,06КФЧ20,56*0,510,41±0,05ФИИ5,27*3,312,94±0,55Спонтанны и НСТ-тест%ПК73*3026,1±3,3ЦПА1,73*0,620,62±0,03Стимулированный латексом НСТ-тест%пк69*5244,3±5,6ЦПА1,70*1,331,28±0,17ИСНСТ0,94*1,741,84±0,10* - достоверность различия с нормальными значениями Р<0,05.

Настоящее изобретение не очевидно для специалиста, работающего в области клинической иммунологии и педиатрии. Определение поглотительной фазы фагоцитоза и метаболической активности нейтрофилов периферической крови в порядке одного исследования ранее не проводилось, сама постановка такого вопроса казалась абсурдной. Новизна изобретения заключается в возможности проведения в порядке одного исследования двух методов с использованием одной порции биосубстрата (кровь), идентичных реактивов и оборудования. Это позволяет оптимизировать метод, делает его доступным у детей раннего возраста и новорожденных, повышает его информативность. Объединение двух разных методик потребовало длительных исследований и кропотливого труда по подбору оптимальных условий, позволяющих одновременно с экономией времени, реактивов и меньшей инвазивностью, обеспечить высокую информативность исследования.

Заявленный способ имеет важное социальное и экономическое значение. Он позволяет экономить время и реактивы, не требует дорогостоящего оборудования, создает ранее неизвестную возможность обследования детских коллективов с выявлением неожиданных результатов, которые могут быть положены в основу диагностики различных патологических состояний. Применение оборудования стандартной клинической лаборатории приводит не только к снижению материальных затрат, но и открывает перспективу внедрения предложенного исследования для изучения параметров неспецифического иммунитета в амбулаторных условиях. Снижение трудовых затрат, экономия времени создает потенциальную возможность проведения исследования как скрининг-теста при обследовании различных детских коллективов, что неизвестно специалистам, работающим в области клинической иммунологии и педиатрии.

Изобретение относится к области клинической иммунологии, в частности к исследованию факторов неспецифической антимикробной защиты, точнее к исследованию фагоцитарной и метаболической активности нейтрофилов периферической крови у детей. Гепаринизированную венозную кровь разливают в пять конических пробирок по 0,1 мл, первые три из которых содержат по 0,1 мл суспензии неокрашенного латекса с размером частиц 1,5 мкм, 4-я - 0,1 мл среды 199 и 0,1 мл 0,1% водного раствора нитросинего тетразолия (НСТ), 5-я - 0,1 мл суспензии латекса и 0,1 мл 0,1% водного раствора НСТ. Инкубируют в термостате при t 37°С: 1-ю пробирку - 5 мин, 2-ю - 30 мин, 3-ю - 1 час, 4-ю и 5-ю - 40 мин. Готовят из 0,2 мл инкубационной смеси мазки на стеклах, высушивают при t 37°С, фиксируют в пламени горелки, окрашивают 1% водным раствором метиленового синего, повторно высушивают и микроскопируют под иммерсией при увеличении 90х10. Результаты исследования оценивают по поглотительной активности в реакциях фагоцитоза, определяя процент фагоцитирующих клеток, фагоцитарное число, фагоцитарный интегральный индекс и показатели скорости фагоцитоза. Реакцию НСТ-теста определяют путем подсчета процента формазан-позитивных клеток, вычисления цитохимического показателя активности и индекса стимуляции НСТ-теста. Способ позволяет сократить время исследования, удешевить и повысить точность исследования. 1 ил., 3 табл.

Способ исследования поглотительной и метаболической активности нейтрофилов периферической крови у детей методами фагоцитоза и НСТ-теста, отличающийся тем, что гепаринизированную венозную кровь разливают в пять конических пробирок по 0,1 мл, первые три из которых содержат по 0,1 мл суспензии неокрашенного латекса с размером частиц 1,5 мкм, 4-я - 0,1 мл среды 199 и 0,1 мл 0,1% водного раствора нитросинего тетразолия (НСТ), 5-я - 0,1 мл суспензии латекса и 0,1 мл 0,1% водного раствора НСТ, инкубируют в термостате при t 37°С: 1-ю пробирку - 5 мин, 2-ю - 30 мин, 3-ю - 1 ч, 4-ю и 5-ю - 40 мин; готовят из 0,2 мл инкубационной смеси мазки на стеклах, высушивают при t 37°С, фиксируют в пламени горелки, окрашивают 1% водным раствором метиленового синего, повторно высушивают и микроскопируют под иммерсией при увеличении 90х10, причем результаты исследования оценивают по поглотительной активности в реакциях фагоцитоза, определяя процент фагоцитирующих клеток, фагоцитарное число, фагоцитарный интегральный индекс и показатели скорости фагоцитоза, а реакцию НСТ-теста определяют путем подсчета процента формазан-позитивных клеток, вычисления цитохимического показателя активности и индекса стимуляции НСТ-теста.