ЛИПОСОМАЛЬНАЯ КОМПОЗИЦИЯ, НЕЙТРАЛЬНЫЙ ЛИПОПОЛИМЕР И СПОСОБ УВЕЛИЧЕНИЯ ВРЕМЕНИ ЦИРКУЛЯЦИИ ЛИПОСОМЫ Российский патент 2005 года по МПК C08G65/329 A61K9/127 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к ПЭГ-замещенным нейтральным липополимерам и их использованию для получения липосом с продолжительным временем циркуляции. Липосомы, содержащие такие липополимеры, характеризуются сходными временами циркуляции в крови по сравнению с липосомами, включающими общепринятые отрицательно заряженные ПЭГ-замещенные фосфолипиды.

Уровень техники

Липосомы используются для многочисленных терапевтических целей, и прежде всего, для доставки терапевтических агентов в клетки-мишени с помощью системного введения липосомальных составов, содержащих такие агенты. К преимуществам составов на основе липосом, содержащих лекарственные средства, относятся улучшенные свойства по доставке лекарственного средства, которые включают, например, контролируемое высвобождение лекарственного средства. В большинстве случаев для липосом требуется продолжительное время циркуляции, чтобы обеспечить достижение липосомами области-, клетки- или участка-мишени. Прежде всего, это необходимо, если область-, клетка- или участок-мишень не расположены вблизи участка инъекции. Например, если липосомы вводят системным способом, то желательно иметь липосомы с покрытием из гидрофильного агента, например, с покрытием из гидрофильных полимерных цепей, таких как полиэтиленгликоль (ПЭГ), чтобы продлить время циркуляции (продолжительность существования) липосом в крови. Такие липосомы с модифицированной поверхностью обычно называют липосомами с "пролонгированной циркуляцией" или "стерически стабилизированными" липосомами.

Наиболее общим способом модификации поверхности липосом является присоединение цепей ПЭГ, обычно имеющих молекулярную массу от приблизительно 1000 дальтон (Да) до приблизительно 5000 Да, к приблизительно 5 мол.% липидов, входящих в состав липосом (см., например, книгу Stealth Liposomes (Липосомы типа "Стелc"), CRC Press. Под ред. Lasic D. и Martin F., Boca Raton, FL, (1995) и упомянутые в ней ссылки). Фармакокинетика, которую проявляют такие липосомы, характеризуется дозонезависимым снижением поглощения липосом печенью и селезенкой с участием системы мононуклеарных фагоцитов (СМФ), а также значительно увеличенным временем циркуляции в крови по сравнению с липосомами с немодифицированной поверхностью, которые имеют тенденцию к быстрому удалению из кровотока и к накоплению в печени и селезенке.

Наиболее широко используемыми и выпускаемыми в промышленности являются ПЭГ-замещенные фосфолипиды на основе фосфатидилэтаноламина (ФЭ), обычно дистеароилфосфатидил-этаноламин (ДСФЭ), который отрицательно заряжен в полярной головной группе. В некоторых случаях отрицательный заряд на поверхности липосом может оказывать неблагоприятное действие, например, при взаимодействии с клетками (см., например, в статье Miller и соавт., Biochemistry, 37:12875-12883 (1998)) и при доставке катионных лекарственных средств, когда возможна утечка лекарственного средства (см., например, в статье Webb и соавт., Biochim. Biophys. Acta, 1372:272-282 (1998)).

B связи с этим в настоящее время существует необходимость в разработке незаряженных ПЭГ-производных липидов, которые эффективно встроены в липидный бислой и обеспечивают продолжительные времена циркуляции липосом. В идеальном случае такие липиды обладают низкой токсичностью и могут быть легко получены.

Сущность изобретения

Один аспект настоящего изобретения включает нейтральный липополимер, представленный формулой:

где каждый из R¹ и R² означает алкильную или алкенильную цепь, содержащую от приблизительно 8 до приблизительно 24 атомов углерода;

n равно от приблизительно 10 до приблизительно 300,

Z выбирают из группы, состоящей из гидрокси, алкокси, бензилокси, сложного эфира карбоновой кислоты, сложного эфира сульфоновой кислоты, алкил- или арилкарбоната, амино и алкиламино, и

L выбирают из группы, состоящей из (i) -X-(C=0)-Y-CH₂-, (ii) -X-(C=0)- и (iii) -Х-СН²-, где Х и Y независимо выбирают из кислорода, NH и простой связи.

Согласно другому аспекту L означает гидролизуемую связь, такую как карбаматная связь, сложноэфирная связь или карбонатная связь. В другом аспекте Z означает гидрокси- или метоксигруппу, R¹ и R² предпочтительно являются неразветвленными. Согласно одному аспекту R¹ и R² оба означают стеарильные группы (С₁₇Н₃₅). Согласно другому аспекту величина n предпочтительно составляет от приблизительно 20 до приблизительно 115, и, таким образом, молекулярная масса ПЭГ-группы составляет от приблизительно 1000 Да до приблизительно 5000 Да.

В следующем аспекте изобретение включает липосомальную композицию, которая содержит вышеуказанный нейтральный липополимер. Предпочтительным является содержание нейтрального липополимера в количестве от приблизительно 1 мол.% до приблизительно 10 мол.% и наиболее предпочтительным - от приблизительно 3 мол.% до приблизительно 6 мол.%.

Изобретение включает также способ увеличения времени циркуляции в крови липосомы, содержащей везикулообразующие липиды, путем встраивания в липосому нейтрального липополимера вышеуказанной формулы. При этом встраиваемое количество нейтрального липополимера может варьировать в широких пределах, однако предпочтительным является его содержание от приблизительно 1 мол.% до приблизительно 10 мол.%, а наиболее предпочтительным - от приблизительно 3 мол.% до приблизительно 6 мол.%.

Перечень фигур чертежей

На фигуре 1 представлена схема синтеза незаряженного липополимера с карбаматной связью (ПЭГ-к-ДС).

На фигурах 2.1-2.4 представлена схема синтеза незаряженных липополимеров с эфирной, сложноэфирной, амидной и кетосвязью.

На фигурах 3.1-3.3 представлены графики биораспределения липосом ГФХС/ХС, содержащих 3 мол.% ПЭГ-к-ДС (Фиг.3.1); 5 мол.% ПЭГ-ДСФЭ (Фиг.3.2) или 5 мол.% ПЭГ-к-ДС (Фиг.3.3), в крови, печени и селезенке.

На фигуре 4 показан график удерживания в крови липосом ГФХС 2:1, не содержащих ПЭГ (крестики), то есть без ПЭГ; 5 мол.% ПЭГ-ДСФЭ (треугольники) и 5 мол.% ПЭГ-к-ДС (кружочки).

На фигуре 5 представлен график удерживания в крови липосом ЧГФХЯ, содержащих 5 мол.% ПЭГ-к-ДС (кружочки) и 5 мол.% ПЭГ-ДСФЭ (квадратики).

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

I. Определения

Термин "нейтральный" липополимер, использованный в данном описании, означает незаряженный липополимер, то есть неионного типа.

Термин "везикулообразующие липиды" означает амфипатические липиды, содержащие гидрофобные и полярные фрагменты в головных группах. Такие везикулообразующие липиды могут самопроизвольно образовывать в воде везикулы из бислоя, например, фосфолипиды, или могут устойчиво встраиваться в липидные бислои, причем гидрофобный фрагмент находится в контакте с внутренней средой, то есть с гидрофобной областью бислойной мембраны, а полярный фрагмент головной группы ориентирован во внешнюю среду, то есть к полярной поверхности мембраны. Обычно класс везикулообразующих липидов этого типа включает в себя одну или две гидрофобные ацильные углеводородные цепи или стероидную группу и может содержать реакционноспособную группу, такую как амин, кислота, сложный эфир, альдегид или спирт), присоединенную к полярной головной группе. В этот класс включены фосфолипиды, такие как фосфатидилхолин (ФХ), фосфатидилэтаноламин (ФЭ), фосфатидовая кислота (ФК), фосфатидилинозит (ФИ) и сфингомиелин (СМ), в которых длина двух углеводородных цепей составляет от приблизительно 14 до приблизительно 22 атомов углерода, а степень ненасыщенности может изменяться. Другие везикулообразующие липиды включают в себя гликолипиды, такие как цереброзиды и ганглиозиды, и стеролы, такие как холестерин. Предпочтительными компонентами для описанных в данном контексте композиций являются фосфолипиды, такие как ФХ и ФЭ, холестерин и нейтральные липополимеры, описанные в данном контексте.

Термин "алкил" означает полностью насыщенный одновалентный радикал, содержащий углерод и водород, который может быть разветвленной или линейной цепью. Примеры алкильных групп включают метил, этил, н-бутил, трет-бутил, н-гептил и изопропил. Термин "низший алкил" означает алкильный радикал, содержащий от приблизительно одного до приблизительно 6 атомов углерода, примерами которого являются метил, этил, н-бутил, изобутил, трет-бутил, изоамил, н-пентил и изопентил.

Термин "алкенил" означает одновалентный радикал, содержащий углерод и водород, который может быть разветвленной или линейной цепью и который содержит по крайней мере одну двойную связь.

Сокращения: ПЭГ: полиэтиленгликоль; мПЭГ: полиэтиленгликоль с метоксигруппой в концевом фрагменте; ХС: холестерин; ФХ: фосфатидилхолин; ЧГФХ: частично гидрированный фосфатидилхолин; ЧГФХЯ: частично гидрированный фосфатидилхолин из яиц; ГФХС: гидрированный фосфатидилхолин из соевых бобов; ДСФЭ: дистеароилфосфатидилэтаноламин; ДСП или ПЭГ-к-ДС: дистеароилПЭГ с карбаматной связью; АПД: 1-амино-2,3-пропандиол; ДТПК: диэтилентетрааминпентауксусная кислота; Бн: бензил.

II. Нейтральные липополимеры

ПЭГ-замещенные нейтральные липополимеры по настоящему изобретению имеют структуру, показанную ниже:

где каждый из R¹ и R² означает алкильную или алкенильную цепь, содержащую от приблизительно 8 до приблизительно 24 атомов углерода;

n равно от приблизительно 10 до приблизительно 300,

Z выбирают из группы, состоящей из гидрокси, алкокси, бензилокси, сложного эфира карбоновой кислоты, сложного эфира сульфоновой кислоты, алкил- или арилкарбоната, амино и алкиламино, и

L выбирают из группы, состоящей из (i) -X-(C=0)-Y-CH₂-, (ii) -X-(C=0)- и (iii) -X-CH₂-, где X и Y независимо выбирают из кислорода, NH и простой связи.

Липополимеры включают нейтральную связь (L) вместо заряженной фосфатной связи в ПЭГ-фосфолипидах, таких как ПЭГ-ДСФЭ, которые часто используются для получения стерически стабилизированных липосом. Такую нейтральную связь обычно выбирают из следующих групп: карбамат, сложный эфир, амид, карбонат, мочевина, амин и простой эфир. Гидролизуемые или расщепляемые другим способом связи, такие как карбаматы, карбонаты и сложные эфиры, предпочтительны в тех случаях, если требуется удаление ПЭГ-цепей через определенное время циркуляции in vivo. Такое свойство может быть использовано для высвобождения лекарственного средства или для ускорения поглощения клетками после того, как липосомы достигли своей мишени (см. Martin и соавт. в патенте США No 5891468; Zalipsky и соавт. в публикации РСТ No WO 98/18813 (1998)).

Молекулярная масса ПЭГ-группы, присоединенной к связующей группе, предпочтительно составляет от приблизительно 1000 Да до приблизительно 15000 Да, что выполняется, если n равно от приблизительно 20 до приблизительно 340. Более предпочтительная молекулярная масса составляет от приблизительно 1000 Да до приблизительно 12000 Да (n = от приблизительно 20 до приблизительно 275) и наиболее предпочтительная молекулярная масса составляет от приблизительно 1000 Да до приблизительно 5000 Да (n = от приблизительно 20 до приблизительно 115). Длина R¹ и R² обычно составляет от приблизительно 8 атомов углерода до приблизительно 24 атомов углерода и предпочтительно от приблизительно 16 до приблизительно 20 атомов углерода. Наиболее предпочтительным является R¹=R²=C¹⁷H₃₅, и, таким образом, COOR означает стеарильную группу.

Как было указано выше, встраивание незаряженного липида в липосому может представлять значительные преимущества, например, снижение утечки инкапсулированного катионного лекарственного средства. Кроме того, другим преимуществом является большая степень гибкости при модулировании взаимодействий поверхности липосом с клетками-мишенями и с ретикулоэндотелиальной системой RES (см. в статье Miller и соавт., Biochemistry, 37:12875-12883 (1998)). В качестве незаряженных компонентов стерически стабилизированных липосом были использованы ПЭГ-замещенные синтетические церамиды (см. в статье Webb и соавт., Biochim. Biophys. Acta, 1372:272-282 (1998)), однако такие молекулы характеризуются сложностью строения и высокой стоимостью их получения, и они в основном не встраиваются в фосфолипидный бислой, также как и диацилглицерофосфолипиды.

Липополимеры могут быть получены с помощью стандартных методов синтеза. Например, соединение с карбаматной связью (L означает -O-(С=O)-NH-CH₂-) получают, как показано на Фиг.1, при взаимодействии концевого гидроксила мПЭГ (метоксиПЭГ) с п-нитрофенилхлорформиатом с образованием п-нитрофенилкарбоната. Затем этот продукт взаимодействует с 1-амино-2,3-пропандиолом с образованием промежуточного карбамата. Гидроксильные группы диола ацилируют, при этом получают конечный продукт. Может быть использован аналогичный синтез с использованием глицерина вместо 1-амино-2,3-пропандиола, с образованием продукта с карбонатной связью (L означает -0-(С=0)-O-СН₂-). Получение дистеароил- и диэйкозаноиллипополимеров с карбаматной связью описано также в примере 1.

Как показано на Фиг.2.1, липополимер с эфирной связью (L означает -O-CH₂-) получают при взаимодействии концевого гидроксила, содержащегося в мПЭГ-ОН, с глицидилхлоридом с последующим гидролизом полученного эпоксида и ацилированием полученного диола. Липополимеры со сложноэфирной связью (L означает -O-(С=O)- или -O-(С=O)-СН₂-) могут быть получены, например, как показано на Фиг.2.2, при взаимодействии мПЭГ-ОН с активированным производным ацетонида глицериновой кислоты (2,2-диметил-1,3-диоксолан-4-карбоновой кислотой) или с гомологом из четырех атомов углерода, с 2,2-диметил-1,3-диоксолан-4-уксусной кислотой. Затем в диоле удаляют защитные группы и его ацилируют.

Для получения липополимеров, содержащих амидную, уреидную или аминную связь (то есть, если L означает -NH-(C=0)-NH-, -NH-(C=0)-CH2-, -NH-(C=0)-NH-CH₂- или -NН-СН₂-) могут быть использованы соответствующие реакции с использованием метода, описанного Zalipsky и соавт. в публикации РСТ No WO 98/18813 (1998), и мПЭГ-NH₂ вместо мПЭГ-ОН.

Соединения, в которых L означает -Х-(С=0)-, где Х означает O или NH, могут быть получены при взаимодействии активированного ПЭГ, содержащего концевую карбоксильную группу (полученного путем окисления концевой гидроксильной группы ПЭГ и активации карбоксильной группы, например, с помощью превращения нитрофенилового эфира или реакции с дициклогексилкарбодиимидом (ДЦКД)), с 1,2,3-пропантриолом или 1-амино-2,3-пропандиолом соответственно (Фиг.2.3). Соединение с кетосвязью (то есть, где Х означает простую связь) может быть получено путем конденсации ПЭГ, содержащего концевую альдегидную группу (полученного окислением в мягких условиях ПЭГ с концевой гидроксильной группой), например, с реагентом Гриньяра, ацетонидом 1-бром-2,3-пропандиолом (Фиг.2.4) с последующим окислением до кетона в не кислотных условиях и гидролизом ацетонида до диола. Затем в каждом случае диол ацилируют в стандартных условиях.

Концевой группой олигомера ПЭГ, не связанной с остатком глицерина (α концевая группа, вышеупомянутая группа Z) обычно является гидрокси или метокси, однако эта группа может быть функциональной группой, полученной в соответствии с методами, известными в данной области техники для ускорения присоединения различных молекул к нейтральному липополимеру и/или для использования с целью доставки липосом к определенным клеткам или типам тканей или для ускорения доставки лекарственного средства другим путем. Молекулы, предназначенные для присоединения, могут включать, например, белки, пептиды, сахариды, антитела или витамины. В примерах 2 и 3 описаны стадии получения липополимеров с α-функциональной группой с использованием методов, аналогичных описанным выше, но которые получают с использованием выпускаемых в промышленности олигомеров ПЭГ, в которых α-концевая группа замещена группой, такой как трет-бутиловый простой эфир или бензиловый простой эфир, которые легко превращаются в гидроксильную группу после синтеза липидного фрагмента молекулы. Затем эту концевую группу активируют, в данном случае с помощью превращения в п-нитрофенилкарбонат.

III. Фармакокинетика липосом

Липосомы с высоким временем циркуляции формируют с помощью встраивания нейтрального липополимера в липосомы, состоящие из везикулообразующих липидов. Предпочтительным является содержание нейтрального липополимера в липосомах в количестве от приблизительно 1 до приблизительно 10 мол.% и наиболее предпочтительным - от приблизительно 3 до приблизительно 6 мол.%. Для иллюстрации способа получают липосомы, включающие от приблизительно 3 до приблизительно 5 мол.%, либо мПЭГ₂₀₀₀-ДСФЭ (дистеароилфосфатидилэтаноламин), либо липополимера с карбаматной связью, мПЭГ₂₀₀₀-к-ДС, как описано в примере 4. Молярное соотношение липидов, состоящих из ГФХС и холестерина, составляет 1,5:1. Липосомы содержат маркер ¹²⁵I-тираминилинулин. Образец каждого препарата вводят в хвостовую вену мыши и определяют распределение в тканях через различные промежутки времени, как описано в примере 4. Уровни, определенные в крови, печени и селезенке, представлены в таблицах 1-3 и показаны в виде графиков на фигурах 3.1-3.3. Полученные данные свидетельствуют о том, что фармакокинетика липосом, содержащих ПЭГ-к-ДС, очень близка к фармакокинетике липосом, содержащих ПЭГ-ДСФЭ.

Таблица 1.
Распределение липосом в кровиВремя% от введенной дозы АВС30 мин-94,8±3,9989,7±6,942 ч85,1±1,9979,8±3,4273,0±17,46 ч67,1±6,2554,5±3,0555,3±2,5112 ч54,9±6,0439,7±2,5244,4±2,5224 ч14,8±2,8112,4±2,3416,6±2,38

Таблица 2.
Распределение липосом в печениВремя% от введенной дозы АВС30 мин-2,27±0,133,14±0,952 ч8,76±2,019,42±1,2411,7±1,746 ч21,7±2,5519,3±1,3720,8±0,8612 ч26,6±0,5126,4±1,9930,4±1,2824 ч43,9±2,736,6±2,2542,6±0,48

Таблица 3.
Распределение липосом в селезенкеВремя% от введенной дозы АВС30 мин-0,09±0,060,23±0,082 ч0,96±0,160,99±0,091,08±0,096 ч1,94±0,071,96+0,292,12±0,1312 ч3,15±0,313,13±0,123,35±0,2224 ч4,69±0,373,91±0,314,56±0,29

Аналогичное исследование проводят для сравнения характеристик обоих типов ПЭГ-замещенных липидов по сравнению с контрольным составом, не содержащим ПЭГ. На Фиг.4 показано удерживание в крови липосом ГФХС 2:1, не содержащих липидов ПЭГ (крестики), содержащих 5 мол.% ПЭГ₂₀₀₀-ДСФЭ (треугольники) или 5 мол.% ПЭГ₂₀₀₀-к-ДС (кружочки).

Дальнейшие исследования проводят с использованием липосом, содержащих мПЭГ₂₀₀₀-к-ДС:ЧГФХ:ХС в молярном соотношении 5:55:40. В липосомы вводят метку путем включения комплекса индий-ДТПК. Процент от введенной дозы определяют в крови и различных тканях в течение 24 ч. Результаты представлены в таблицах 4-6. И в этом случае липосомы характеризуются типичной фармакокинетикой с пролонгированной циркуляцией, причем среднее удерживание составляет более 70% от введенной дозы через 4 ч и более 30% через 24 ч.

Таблица 4.
Процент от введенной дозы индия в кровиЖивотное0,0 ч0,5 ч1,0 ч2,0 ч4,0 ч24 чКрыса 1103,791,282,573,872,033,1Крыса 297,787,779,478,774,430,7Крыса 395,183,177,868,664,429,8Крыса 491,985,478,575,672,633,2Сред. велич.97,186,879,674,270,931,7Станд. откл.5,03,42,14,24,41,7

Таблица 5.
Процент от введенной дозы в тканях через 24 чТканьКрыса 1Крыса 2Крыса 3Крыса 4Сред. велич.Станд. откл.Печень7,56,96,77,27,10,3Селезенка4,95,45,64,85,20,4Сердце0,40,50,50,60,50,1Почки1,21,21,01,21,10,1Легкое0,70,70,70,80,70,1Кожа0,10,30,20,20,20,1Кость0,30,20,20,20,20,2Мышцы0,10,10,10,20,10,4Моча11,213,45,712,310,73,4

Таблица 6. Процент от введенной дозы/г в тканях через 24 чТканьКрыса 1Крыса 2Крыса 3Крыса 4Сред. велич.Станд. откл.Печень0,70,70,70,70,70,3Селезенка7,36,98,25,97,10,9Сердце0,50,50,50,50,50,4Почки0,60,60,50,60,60,6Легкое0,60,50,50,60,50,6Кожа0,10,10,10,10,10,1Кость0,40,40,40,40,40,3Мышцы0,10,10,10,10,10,2Моча*0,60,60,30,80,60,2

И наконец, липосомы, содержащие 5 мол.% мПЭГ₂₀₀₀-к-ДС или мПЭГ₂₀₀₀-ДСФЭ и остальное количество процентов ЧГФХЯ, сравнивают по проценту остаточного количества в крови через промежуток времени вплоть до 24 ч после введения. Как показано на Фиг.4, типы фармакокинетики практически идентичны, причем удерживание через 24 ч составляет приблизительно 40%.

Все публикации, патенты и патентные документы включены в данное описание в качестве ссылок, как если бы каждый документ был отдельно включен в качестве ссылки. Изобретение описано со ссылкой на различные специфические и предпочтительные варианты воплощения изобретения и методики. Однако следует понимать, что возможны многочисленные изменения и модификации, которые включены в сущность и объем притязаний по изобретению.

Следующие примеры приведены для иллюстрации, но не для ограничения объема притязаний изобретения.

Пример 1А. Синтез мПЭГ-к-ДС (мПЭГ аминопропандиол дистеароил: α-метокси-ω-2.3-ди(стеароилокси)пропилкарбамат-поли(этиленоксид))

Раствор мПЭГ₂₀₀₀ (20 г, 10 моль) сушат путем упаривания в виде азеотропной смеси в толуоле (50 мл, 120°С). После того, как температура вышеуказанного раствора достигнет 25°С, его обрабатывают нитрофенилхлорформиатом (3,015 г, 15 моль), а затем ТЭА (2,01 мл, 15 моль). Реакцию в полученной смеси проводят в течение 1,5 ч. Соль ТЭА отфильтровывают, а растворитель удаляют, при этом получают неочищенный мПЭГ₂₀₀₀-нитрофенилхлорформиат, к которому добавляют раствор аминопропандиола (3 г, 30 моль) в ацетонитриле (50 мл). Полученную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение ночи. Нерастворенные вещества удаляют фильтрованием, а растворитель упаривают. Полученный продукт дважды перекристаллизовывают из изопропанола. Выход: 13,7 г, 65%. ¹Н ЯМР: (300 МГц, DMSO-D₆) δ 3,23 (s, ОСН₃, 3Н), 3,65 (s, ПЭГ, 180 Н), 4,05 (t, уретан CH₂, 2Н), 4,42 (t, 10 ОН, 1Н), 4,57 (d, 20 ОН, 1Н).

Полученный продукт, мПЭГ_2000-аминопропандиол (2,3 г, 1,08 моль, 2,17 миллиэкв. ОН), растворяют в толуоле (30 мл) и сушат путем упаривания в виде азеотропной смеси, удаляя приблизительно 10 мл раствора. Раствор охлаждают до комнатной температуры. При помощи пипетки добавляют пиридин (4 мл, 20%), а затем стеароилхлорид (1 г, 4,3 моль). При этом наблюдается немедленное образование осадка белого цвета. Реакционную смесь нагревают с обратным холодильником при 120°С в течение ночи и затем охлаждают. Когда температура реакционного сосуда достигнет приблизительно 40°С, соль пиридина отфильтровывают. Фильтрат упаривают. продукт (ПЭГ₂₀₀₀-к-ДС) очищают двухкратной перекристаллизацией из изопропанола (2×30 мл) и сушат в вакууме над Р₂О₅.

Выход: 2,26 г, 80%. ТСХ (хлороформ/метанол, 90:10): мПЭГ-аминопропандиол, R_f=0,266; ПЭГ-к-ДС, R_f=0,533. ¹H ЯМР: (300 МГц, DMSO-D₆) δ 0,89 (t, СН₃, 6Н), 1,26 (s, CH₂, 56H), 1,50 (2t, 2CH₂, 4Н), 2,24 (t, CH_gCH_s -С=0, 4Н), 3,23 (s, ОСН₃, 3Н), 3,50 (s, ПЭГ, 180 Н), 4,00 (dd, CH₂ из АПД, 1Н), 4,02 (t, СН₂OC=O-N, 2Н), 4,20 (dd, СН₂ из АПД, 1Н), 4,98 (m, CHOC(O), 1H), 7,34 (m, NH, 1H).

Для получения полимеров мПЭГ с молекулярным весом 750, 5000 и 12000 используют методику, аналогичную использованной для получения ПЭГ-к-ДС. Структуры полимеров определяют методами ¹H ЯМР и масс-спектрометрии. Молекулярные массы определяют методом МС MALDI (лазерная десорбция на матрице/ионизация), полученные результаты приведены ниже:

КонъюгатМол. масса по МС (MALDI)мПЭГ(750)-к-ДС1426мПЭГ(2000)-к-ДС2892мПЭГ(5000)-к-ДС5816мПЭГ(12000)-к-ДС12729

Пример 1Б. Синтез ПЭГ-к-ДЭ (мПЭГ-аминопропандиолдиэйкозаноил: α-метокси-ω-2,3-ди(эйкозаноилокси)пропилкарбамат-поли(этиленоксид))

В круглодонной колбе объемом 100 мл растворяют эйкозановую кислоту (500 мг, 1,6 ммоль) в толуоле (20 мл), а затем при помощи пипетки добавляют оксалилхлорид(147 мкл, 1,68 ммоль). К перемешиваемой реакционной смеси добавляют 1% ДМФ. При добавлении ДМФ наблюдается выделение газа. Любые контакты с данным газом следует исключить. Через 10 мин толуол упаривают, добавляют еще 20 мл толуола и упаривают для удаления избытка оксалилхлорида. Остаток повторно растворяют в 10 мл толуола. К раствору добавляют мПЭГ-аминопропандиол, полученный по методике, приведенной выше (1,19 г, 0,56 ммоль), к колбе подсоединяют обратный холодильник и полученную смесь нагревают с обратным холодильником в течение ночи. Данные ТСХ (метанол/хлороформ, 9:1) свидетельствуют о том, что реакция завершена. После охлаждения реакционной смеси нерастворенные вещества отфильтровывают, а фильтрат высушивают досуха. Полученный продукт очищают трехкратной перекристаллизацией из изопропанола и сушат в вакууме над P₂O₅. Выход: 1,0 мг, 70%. ¹H ЯМР: (360 МГц, DMSO-D₆) δ 0,89 (t, СН₃, 6Н), 1,26 (s, CH₂, 66 Н из липида), 1,50 (t, 2СН₂, 4Н), 2,24 (t, СН₂СН₂ С=0, 4Н), 3,23 (s, OСН₃, 3Н), 3,50 (s, ПЭГ, 180 Н), 4,00 (dd, CH₂ из АПД, 1Н), 4,05 (t, СН₂СН₂С+O, 4H), 4,05 (t, CH₂OC=O-N, 2H), 4,20 (dd, CH₂ из АПД, 1Н), 4,98 (m, СНОС(О), 1Н), 7,34 (m, NH, 1H) част./млн.

Пример 2. Получение трет-бутил-O-ПЭГ-аминопропандиолачерезтрет-бутил-O-ПЭГ-O-сукцинимид

А.Трет-бутил-O-ПЭГ-O-сукцинимид

Трет-бутил-O-ПЭГ-2000, предоставленный лабораторией полимеров (Polymer Labs) (10 г, 5 ммоль), сушат путем упаривания в виде азеотропной смеси, растворяя в 120 мл толуола и удаляя приблизительно 20 мл растворителя, причем воду собирают в ловушку Дина Старка.

Раствор охлаждают до комнатной температуры и добавляют фосген (15 мл). Реакцию проводят при комнатной температуре в течение ночи. После завершения реакции растворитель удаляют на роторном испарителе. В реакционную смесь добавляют приблизительно 50 мл свежеперегнанного толуола и удаляют на роторном испарителе. Остаток растворяют в сухом толуоле (30 мл) и хлористом метилене (10 мл). К полученному раствору добавляют N-гидроксисукцинимид (NHS) (1,7 г, 14,8 ммоль) и триэтиламин (ТЭА) (2,1 мл, 14,9 ммоль) и реакцию проводят при комнатной температуре в течение ночи, данные ТСХ свидетельствуют о том, что реакция завершена.

Соль отфильтровывают из реакционной смеси, растворитель удаляют упариванием и твердое вещество дважды перекристаллизовывают из изопропилового спирта, сушат над P₅O₅. Выход: 9,2 г, 85%. ¹H ЯМР: (СDСl₃, 360 МГц) δ 1,25 (s, трет-бутил, 9Н), 2,82 (s, CH₂CH₂, 4Н), 3,60 (s, ПЭГ, 180 Н), 4,45 (t, СН₂ОСОМН, 2Н) част./млн.

Б. Трет-бутил-O-ПЭГ-аминопропандиол

К раствору аминопропандиола (300 мг, 3,2 ммоль) в ДМФ (10 мл) добавляют трет-бутил-ПЭГ-OSc (5 г, 2,29 ммоль) и проводят реакцию в течение ночи. При этом потребляется весь эфир NHS, что позволяет получить гомогенный продукт (по данным ТСХ одно пятно).

К реакционной смеси добавляют предварительно промытую ионно-обменную смолу в кислотной форме (~ 1 г) и через 30 мин ее удаляют фильтрованием. Растворитель удаляют и остаток перекристаллизовывают из 200 мл изопропилового спирта. Твердое вещество собирают и сушат над Р₂О₅. Выход: 4,2 г, 85%. ¹H ЯМР: (D₆-DMSO, 360 МГц) δ 1,25 (s, трет-бутил, 9Н), 3,68 (s, ПЭГ, 180 Н), 4,03 (t, CH₂OCONH, 2H), 4,43 (t, 10 ОН, 1Н), 4,55 (d, 20 ОН, 1Н), 6,98 (t, NH, 1H) част./млн.

Пример 3. Получение п-нитросфенилкарбонат-ПЭГ-к-ДС

А. Бн-0-ПЭГ-нитрофенилкарбонат (НФК)

Бн-О-ПЭГ-2000, приобретенный на фирме Shearwater Polymers (Huntsville, LA; 5 г, 2,41 ммоль), сушат путем упаривания в виде азеотропной смеси, растворяя в 120 мл толуола и удаляя приблизительно 20 мл растворителя, причем воду собирают в ловушку Дина Старка. Раствор охлаждают до комнатной температуры и оставшийся растворитель упаривают при пониженном давлении.

Остаток растворяют в 30 мл смеси хлористый метилен/этилацетат (60:40), затем добавляют п-нитрофенилхлорформиат (729 мг, 3,6 ммоль) и триэтиламин (1 мл, 7,2 ммоль). Реакцию проводят при 4°С в течение 8-16 ч. Этот метод снижает скорость реакции, но исключает образование бисПЭГ-карбоната. Данные ТСХ на силикагелевой пластине GF (пятно наблюдают в УФ) свидетельствуют о том, что реакция завершена.

Реакционную смесь обрабатывают предварительно очищенной ионно-обменной смолой в кислотной и основной форме в течение 30 мин, фильтруют и высушивают досуха. Полученный продукт перекристаллизовывают из изопропилового спирта и сушат над P₂O₅. Выход: 4,4 г, 80%.

Б. Бн-O-ПЭГ-аминопропандиол

К раствору аминопропандиола (260 мг, 1,9 ммоль) в ДМФ (10 мл) добавляют Бн-0-ПЭГ-НФК, полученный, как описано выше (4,3 г, 2,9 ммоль), и проводят реакцию в течение 5 ч. Весь Бн-0-ПЭГ-НФК потребляется, по данным ТСХ (хлороформ/метанол/вода, 90:18:2), в реакционной смеси наблюдается одно пятно.

Реакционную смесь обрабатывают 5 г предварительно очищенной ионно-обменной смолы в кислотной форме в течение 30 мин, фильтруют и высушивают досуха. Полученный продукт перекристаллизовывают из изопропилового спирта и сушат над Р₂O₅. Выход: 3,8 г, 91%.

В. Бн-0-ПЭГ-к-дистеароил

Раствор Бн-0-ПЭГ-аминопропандиола (3 г, 1,36 ммоль), стеариновой кислоты (1,94 г, 6,79 ммоль) и ТСДП (4-толуолсульфонат 4-(диметиламино)пиридиния) в качестве катализатора (408 мг, 1,36 ммоль) перемешивают при комнатной температуре в течение 20 мин. Добавляют при помощи пипетки диизопропилкарбодиимид (1,28 мл, 8,16 ммоль) и проводят реакцию в течение ночи. Данные ТСХ (хлороформ/метанол, 90:10) свидетельствуют о том, что все диольные группы вступили в реакцию.

К реакционной смеси добавляют ионно-обменную смолу в основной форме (~5 г). Смесь встряхивают в течение 30 мин, смолу отфильтровывают и фильтрат высушивают досуха. Остаток перекристаллизовывают из изопропанола (100 мл) и сушат над P₂O₅. Выход: 4 г, 80%.

Г. НО-ПЭГ-к-дистеароил

Существуют два различных метода удаления защитной бензильной группы с Бн-0-ПЭГ-к-ДС.

Метод 1. Гидрогенолиз: удаление защитной группы в присутствии палладия на угле. К раствору Бн-0-ПЭГ-к-ДС (218 мг, 0,08 ммоль) в 5 мл метанола добавляют 10% Pd/C (110 мг) и формиат аммония (107 мг, 0,8 ммоль), проводят реакцию при комнатной температуре в течение ночи. Pd/C удаляют фильтрованием через слой целита, фильтрат высушивают досуха. Остаток повторно растворяют в хлороформе и три раза промывают насыщенным раствором NaCl. Фазу хлороформа собирают, сушат над МgSO₄, фильтруют и концентрируют. Твердый остаток лиофилизируют из трет-бутанола и полученный порошок сушат над Р₂O₅. Выход: 80%, 175 мг.

Метод 2. Удаление защитной группы в присутствии тетрахлорида титана.

Раствор Bn-0-ПЭГ-к-ДС (1,18 г, 0,43 ммоль) в хлористом метилене (10 мл) охлаждают на ледяной бане в течение 5 мин. Тетрахлорид титана (3 мл, 21,5 моль, избыток) переносят при помощи высушенного в термостате шприца в герметично закрытый реакционный сосуд. Через 5 мин ледяную баню удаляют и удаление защитной группы проводят при комнатной температуре в течение ночи. По данным ТСХ на силикагелевой пластине GF происходит полное удаление защитной группы, о чем свидетельствует смещение пятна по сравнению с исходным веществом.

К реакционной смеси добавляют приблизительно 40 мл хлороформа и смесь переносят в делительную воронку, содержащую 40 мл насыщенного раствора NаНСO₃. Полученную смесь осторожно встряхивают (чтобы избежать образования эмульсии) и слой хлороформа собирают. Эту экстракцию повторяют три раза, фазу хлороформа собирают и экстрагируют еще раз свежей порцией насыщенного раствора NаНСО₃, чтобы убедиться в том, что TiCl₄ удален полностью. Собранную фазу хлороформа сушат над MgS0₄, фильтруют и концентрируют.

Полученный по вышеописанной методике остаток повторно растворяют в 1 мл хлороформа и наносят на подготовленную колонку с силикагелем (200-400 меш, 60 ). Полярность подвижной фазы (хлороформ) увеличивают постепенным добавлением метанола (с приращением 2%) до элюирования продукта при соотношении метанол/хлороформ, 10:90. Продукт собирают и растворитель удаляют на роторном испарителе. Твердое вещество лиофилизируют из трет-бутанола и сушат над Р₂О₅. Выход: 70%, 800 мг.

Д. п-Нитрофенилкарбонат-ПЭГ-к-ДС

Перед началом реакции реакционный сосуд, перемешивающий стержень, шприцы и исходное вещество (НО-ПЭГ-к-ДС, полученное, как описано выше) тщательно сушат.

К раствору НО-ПЭГ-к-ДС (1,2 г, 0,45 ммоль) в 10 мл смеси хлористый метилен/этилацетат (60:40) добавляют п-нитрофенилкарбонат (136 мг, 0,65 ммоль) и триэтиламин (188 мкл, 1,35 ммоль). Реакционную смесь выдерживают при 4°С (для предотвращения образования бисПЭГ-карбоната) в течение 8-16 ч, после чего данные ТСХ на силикагелевой пластине GF пластине свидетельствуют о завершении реакции.

СоединениеR_f (СНСl₃/СН₃ОН, 90:10)НО-ПЭГ-к-ДС
НФК-ПЭГ-к-ДС0,40
0,54

Реакционную смесь обрабатывают в течение 30 мин предварительно очищеннами ионно-обменными смолами в кислотной и основной форме и фильтруют. Фильтрат высушивают досуха и остаток перекристаллизовывают из изопропилового спирта. Твердое вещество сушат над P₂O₅. Выход: 70%. ¹H ЯМР: (D₆-DMSO, 360 МГц) δ 0,86 (t, СН₃, 6Н), 1,22 (s, ДС, 56Н), 1,48 (m, СН₂СH₂(СО), 4Н), 2,26 (2 xt, CH₂OCONH, 2H) 4,03 & 4,22 (2 xd, CH₂CH из липида, 2H), 4,97 (m, СНСH₂ из липида), 6,98 (t, NH, 1H), 7,55 & 8,32 (2xd, ароматический, 4Н) част./млн.

Пример 4. Получение и изучение биораспределения липосом, содержащих ПЭГ-ДСФЭ и ПЭГ-к-ДС.

Липидные пленки формируют путем растворения и удаления растворителя из смеси липидов, содержащей ГФХС:ХС:ПЭГ в следующем молярном соотношении:

А. 58:39:3; ПЭГ-липид = ПЭГ-к-ДС

Б. 57:38:5; ПЭГ-липид = ПЭГ-ДСФЭ

В. 57:38:5; ПЭГ-липид = ПЭГ-к-ДС

Пленки гидратируют в свежеприготовленном растворе ¹²⁵I-тираминилинулина в 25 мМ HEPES, содержащем 140 мМ NaCl, pH 7,4, и с помощью экструзии формируют липосомы диаметром 100-105 нм. Липосомы стерилизуют фильтрацией через фильтр Миллипор с диаметром пор 0,22 мкм со шприцевой насадкой для связывания низкомолекулярных белков (производства фирмы Millipore Corporation, Bedford, МА). В аликвотах определяют число импульсов ¹²⁵I для расчета дозы. Концентрацию липидов в препаратах липосом определяют по содержанию фосфатов и препараты липосом разбавляют в стерильном буфере до конечной концентрации 2,5 мкмол/мл. Мышам вводят по 0,2 мл разбавленных липосом внутривенно в хвостовую вену, таким образом каждая мышь получает по 0,5 мкмол фосфолипида. Через различные промежутки времени мышей умерщвляют путем эфтаназии с использованием анестезии галотаном с последующим цервикальным вывихом. Отбирают кровь из сердца и в крови, а также в различных органах определяют число импульсов ¹²⁵I.

Изобретение относится к нейтральному липополимеру формулы

где каждый из R¹ и R² независимо друг от друга означает алкильную или алкенильную цепь, содержащую от приблизительно 8 до приблизительно 24 атомов углерода; n равно от приблизительно 10 до приблизительно 300, Z выбирают из группы, состоящей из гидрокси, алкокси, бензилокси, сложного эфира карбоновой кислоты, сложного эфира сульфоновой кислоты, алкил- или арилкарбоната, амино и алкиламино, и L выбирают из группы, состоящей из (i) -X-(C=О)-Y-CH₂-, (ii) -X-(C=О)- и (iii) -X-CH₂-, где Х и Y независимо выбирают из кислорода, NH и простой связи, при условии, что если L означает -Х-(С=О)-, то Х не является NH. Также изобретение относится к липосомомальной композиции и к способу увеличения времени циркуляции липосомы. Изобретение позволяет получить нейтральные липополимеры, которые обеспечивают продолжительное время циркуляции липосом. 3 c. и 8 з.п. ф-лы, 10 табл., 5 ил.

1. Нейтральный липополимер формулы

где

каждый из R¹ и R² независимо друг от друга означает алкильную или алкенильную цепь, содержащую от приблизительно 8 до приблизительно 24 атомов углерода;

n равно от приблизительно 10 до приблизительно 300,

Z выбирают из группы, состоящей из гидрокси, алкокси, бензилокси, сложного эфира карбоновой кислоты, сложного эфира сульфоновой кислоты, алкил- или арилкарбоната, амино и алкиламино, и

L выбирают из группы, состоящей из (i) -X-(C=O)-Y-CH₂-, (ii) -X-(C=O)- и (iii) -X-CH₂-, где X и Y независимо выбирают из кислорода, NH и простой связи, при условии, что если L означает -Х-(С=O)-, то Х не является NH.