СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННОГО МНОГОКОМПОНЕНТНОГО РЕАГЕНТА ДЛЯ БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНОГО АНАЛИЗА Российский патент 2005 года по МПК C12Q1/66 C12N11/04 

Изобретение относится к биохимии, в частности к способам получения иммобилизованных ферментов, и может быть использовано в химии, биохимии, медицине, гистологии, микробиологии, экологии и сельском хозяйстве для анализа веществ биолюминесцентным методом.

Известен иммобилизованный реагент для определения количества никотинамидадениндинуклеотида (НАДН), включающий биферментную систему НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза, выделенную из светящихся бактерий Vibrio fischeri, диазотированное ариламинированное стекло, фосфатный буфер, дитиотрейтол (ДТТ), этилендиаминтетрауксусную кислоту и глицерин. Способ получения иммобилизованного реагента состоит в контактировании фермента с предварительно диазотированным ариламинированным пористым стеклом при температуре 3-5°С. Носитель представляет собой стеклянные бусинки, склеенные в стержни. Связывание люциферазы с носителем происходит внутри пор носителя [Oda К., Yoshida S., Hirose S., Takeda T. Photon counting determination of ultratrace levels of nicotineamide adenine dinucleotide, reduced form (NADH) by use of immobilized luciferase. //Chem. Pharm. Bull., 1984. - V.32, № 1, p.185-192].

Недостатком известного реагента и способа его приготовления является то, что получаемый реагент является малопригодным для аналитических исследований, поскольку для проведения анализа необходимо приготовление четырех растворов компонентов (3-х субстратов и буфера) с последующим их смешиванием в реакционную смесь, что существенно увеличивает время анализа и уменьшает точность измерений, в частности при проведении длительных анализов.

Наиболее близким к изобретению является иммобилизованный регент и способ его получения, включающий биферментную систему светящихся бактерий НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза, выделенную из Photobacterium leiognathi, крахмальный гель и фосфатный буфер. Иммобилизация включала следующие стадии [Кратасюк В.А., Дмитриева О.Н., Белобров П.И. Свойства иммобилизованной в крахмальный гель люциферазы. //Люминесцентный анализ в медико-биологических исследованиях. Рига: Изд. РМИ, 1986. - c.93-97 (прототип)]:

1. Приготовление 2-10% геля кипячением суспензии крахмала в фосфатном буфере.

2. Смешивание препарата НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза с гелем, охлажденным до 24-47°С.

3. Нанесение полученного препарата дозами по 50-100 мкл на лавсановую пленку.

4. Высушивание при температуре 4-8°С в течение 12 часов.

Недостатком известного реагента и способа его приготовления является отсутствие в иммобилизованном реагенте субстратов биферментной системы НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза, так что при проведении анализов необходимо приготовление четырех растворов компонентов биферментной реакции (субстратов и буфера) с последующим их добавлением к иммобилизованному препарату биферментной системы НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза, что существенно увеличивает время анализа и уменьшает точность измерений, в частности, при проведении длительных анализов.

Технический результат изобретения состоит в улучшении качества реагента для биолюминесцентного анализа путем уменьшения количества необходимых компонентов реакционной смеси (с четырех до одного), сокращения времени анализа в два раза и увеличения точности измерений при необходимости проведения длительных анализов.

Технический результат достигается тем, что в способе получения иммобилизованного многокомпонентного реагента для биолюминесцентного анализа, заключающемся в приготовлении 3-5% геля кипячением суспензии крахмала в фосфатном буфере, охлаждении геля до 24-30°С, смешивании буферного раствора биферментной системы светящихся бактерий НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза с гелем крахмала, дозировании на лавсановую пленку и высушивании при 4-10°С, согласно изобретению компоненты биферментной реакции вводят в крахмальный гель в следующем порядке: миристиновый альдегид, никотинамидадениндинуклеотид, биферментная система НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза и флавинмононуклеотид. При этом растворы субстратов никотинамидадениндинуклеотида, флавинмононуклеотида и миристинового альдегида готовят на фосфатном буфере рН 6,8-7,0.

Иммобилизованный многокомпонентный реагент для биолюминисцентного анализа готовят следующим образом (пример 1):

раствор биферментной системы НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза готовят на 0,05 М фосфатном буфере, рН 7,0. Растворы НАДН и ФМН готовят на дистиллированной воде или 0,05 М фосфатном буфере, рН 7,0. 0,002% раствор миристинового альдегида готовят из 0,2% спиртового раствора разбавлением в дистиллированной воде или 0,05 М фосфатном буфере, рН 7,0. Навеску 1,1 г крахмала помещают в 30 мл 0,05 М фосфатного буфера, рН 7,0, интенсивно перемешивают на мешалке, и кипятят полученную смесь до получения прозрачного 3,5% раствора. К 5 мл охлажденного до 28°С геля приливают 130 мкл 0,002% раствора миристинового альдегида, 130 мкл 1,6-10^-2 М раствора НАДН, 130 мкл раствора биферментной системы НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза, содержащей 0,25 мг люциферазы и 0,7 единиц активности НАДН:ФМН-оксидоредуктазы, 130 мкл 1,3-10^-3 М раствора ФМН, интенсивно перемешивают в течение 20 с. Наносят полученную смесь по 50 мкл на лавсановую пленку и высушивают при температуре 4°С в течение 12 часов. Многокомпонентный иммобилизованный реагент представляет собой диск диаметром 7-8 мм, толщиной 50-60 микрон, сухой вес 9±0,5 мг.

Активность иммобилизованного реагента определяют по максимальной интенсивности свечения в реакционной смеси, содержащей иммобилизованный реагент и 400 мкл фосфатного буфера, рН 7,0. Свечение регистрируют с помощью биолюминометра BLM 8801 (СКТБ “Наука” КНЦ СО РАН г. Красноярск), сигнал с которого подается на самописец (LKB, Швеция). Активность полученного реагента составляет 120 мВ.

Примеры 2-4 отличаются от заявляемого способа порядком добавления компонентов.

Пример 2

Иммобилизацию биферментной системы НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза и ее субстратов проводили аналогичным образом, добавляя компоненты в охлажденный до 28°С 3,5% гель в следующем порядке: 130 мкл раствора биферментной системы НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза, 130 мкл раствора миристинового альдегида, 130 мкл раствора НАДН, 130 мкл раствора ФМН. Концентрации всех компонентов соответствовали концентрациям в примере 1. Активность полученного реагента составляла 10 мВ.

Пример 3

Аналогичным образом проводили иммобилизацию биферментной системы НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза и ее субстратов, добавляя компоненты в охлажденный до 28°С 3,5% гель в следующем порядке: 130 мкл раствора биферментной системы НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза, 130 мкл раствора НАДН, 130 мкл раствора миристинового альдегида, 130 мкл раствора ФМН. Концентрации всех компонентов соответствовали концентрациям в примере 1. Активность полученного реагента составляла 9 мВ.

Пример 4

Аналогичным образом проводили иммобилизацию биферментной системы НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза и ее субстратов, добавляя компоненты в охлажденный до 28°С 3,5% гель в следующем порядке: 130 мкл раствора биферментной системы НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза, 130 мкл раствора ФМН, 130 мкл раствора НАДН, 130 мкл раствора миристинового альдегида. Концентрации всех компонентов соответствовали концентрациям в примере 1. Активность полученного реагента составляла 12 мВ.

Активность полученных в примерах 1-4 многокомпонентных иммобилизованных реагентов представлена на чертеже.

Использование описываемого реагента позволяет существенно сократить время проведения биолюминесцентного анализа. Обычный способ анализа веществ, описываемый в прототипе, требует разведения 4-х компонентов биферментной реакции с последующим введением каждого из них в реакционную смесь в процессе одиночного измерения. Процедура анализа с использованием описываемого реагента сводится к добавлению одного компонента - буфера (в качестве контрольного образца) или анализируемой смеси. Кроме того, при проведении стандартной процедуры анализа растворы субстратов биферментной реакции (миристинового альдегида и НАДН) быстро инактивируются, что приводит к уменьшению точности анализов. Описываемый реагент отличается стабильностью при хранении, что позволяет увеличить точность, в частности, при проведении длительных анализов.

Изобретение относится к биохимии, в частности к способам получения иммобилизованных ферментов, и может быть использовано в химии, биохимии, медицине, гистологии, микробиологии, экологии и сельском хозяйстве для анализа веществ биолюминесцентным методом. В способе получения иммобилизованного многокомпонентного реагента для биолюминесцентного анализа, заключающемся в приготовлении 3-5% геля кипячением суспензии крахмала в фосфатном буфере, охлаждении геля до 24-30°С, смешивании буферного раствора биферментной системы светящихся бактерий НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза с гелем крахмала, дозировании на лавсановую пленку и высушивании при 4-10°С, согласно изобретению компоненты биферментной реакции вводят в крахмальный гель в следующем порядке: миристиновый альдегид, никотинамидадениндинуклеотид, биферментная система НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза и флавинмононуклеотид. При этом растворы субстратов никотинамидадениндинуклеотида, флавинмононуклеотида и миристинового альдегида готовят на фосфатном буфере рН 6,8-7,0. Изобретение обеспечивает улучшение качества реагента для биолюминесцентного анализа путем уменьшения количества необходимых компонентов реакционной смеси (с четырех до одного), сокращение времени анализа в два раза и увеличение точности измерений при необходимости проведения длительных анализов. 1 з.п. ф-лы, 1 ил.

1. Способ получения иммобилизованного многокомпонентного реагента для биолюминесцентного анализа, заключающийся в приготовлении 3-5% геля кипячением суспензии крахмала в фосфатном буфере, охлаждении геля до 24-30°С, смешивании буферного раствора биферментной системы светящихся бактерий НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза с гелем крахмала, дозировании на лавсановую пленку и высушивании при 4-10°С, отличающийся тем, что компоненты биферментной реакции вводят в крахмальный гель в следующем порядке: миристиновый альдегид, никотинамидадениндинуклеотид, биферментная система НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза и флавинмононуклеотид.2. Способ получения по п.1, отличающийся тем, что растворы субстратов никотинамидадениндинуклеотида, флавинмононуклеотида и миристинового альдегида готовят на фосфатном буфере рН 6,8-7,0.