Изобретение относится к биохимии и может быть использовано в экологии и медицине, для количественной оценки ремедиационной способности природного детоксиканта - гуминовых веществ.
Известен способ мониторинга токсичности среды, основанный на определении концентрации ингибиторов биологической активности, включающий обработку анализируемой пробы реакционной смесью, содержащей альдегид и НАДН в насыщающих концентрациях, люциферазу, НАДН: ФМН-оксидоредуктазу и ФМН и определение концентрации по величине интенсивности свечения [а.с. №1204639, МПК C12Q 1/26, опуб. 15.01.86 г., бюл. №2].
Известен способ определения концентрации ингибиторов биологической активности, включающий обработку анализируемой пробы реакционной смесью, содержащей люциферазу и ее субстраты, измерение времени достижения максимума биолюминесценции, по величине которого определяют концентрацию ингибитора [а.с. №865904, МПК C12Q 1/26, опубл. 23.09.81 г., бюл. №35 (прототип)].
Недостатками этих способов является отсутствие избирательности и количественной оценки детоксицирующего фактора.
Техническим результатом изобретения является разработка способа определения антиоксидантной активности гуминовых веществ, избирательного к группе оксидантов.
Указанный технический результат достигается тем, что в биолюминесцентном способе определения антиоксидантной активности гуминовых веществ, включающем приготовление рабочей и контрольной биолюминесцентных проб на основе ферментов, при приготовлении контрольной пробы используют стандартный биолюминесцентный раствор с добавлением оксиданта, при приготовлении рабочей пробы - стандартный биолюминесцентный раствор с добавлением оксиданта, содержащий гуминовые вещества, а в качестве оксиданта используют феррицианид калия в концентрациях от 5·10-6 M до 3·10-5 М и регистрируют индукционный период биолюминесценции обеих проб, при отношении ТГВ/Т0<1 гуминовые вещества обладают антиоксидантной активностью.
Заявляемый способ использует избирательность биолюминесцентного ферментативного анализа к группе оксидантов, что позволяет количественно определять антиоксидантную активность природных детоксикантов - гуминовых веществ и оценивать их реамедиационные свойства.
Признаки заявляемого технического решения, не выявлены в других технических решениях при изучении данной области и смежных областей техники и, следовательно, обеспечивают заявляемому решению соответствие критериям «новизна» и «изобретательский уровень».
Сущность изобретения поясняется чертежами.
На фиг.1 представлена зависимость интенсивности биолюминесценции (I/I0) от времени в растворах феррицианида калия: 1-C=3·10-6 M, 2-С=5·10-6 М, 3-С=10-5 М, 4-C=3·10-5 M, 5-C=5·10-5 М.
На фиг.2 дана зависимость индукционного периода (Т) биолюминесценции от концентрации гуминовых веществ в растворе феррицианида калия, С=10-5 М.
Заявляемый биолюминесцентный способ определения антиоксидантной активности гуминовых веществ осуществляется следующим образом:
Предварительно, при комнатной температуре определяют воздействие оксиданта на биолюминесцентную систему, для этого в раствор, содержащий 5 мкл раствора Комплекта Реактивов Аналитической Биолюминесценции (КРАБа), 50 мкл 0,0025% раствора миристинового альдегида, 50 мкл 5·10-4 М раствора флавинмононуклеотида, 150 мкл 0,05 М калий-фосфатного буфера рН 6,9, 200 мкл
4·10-4 М раствора NADH, вносят раствор, содержащий оксиданты различных концентрации. Примеры оксидантов: перекисные соединения, хиноны, соли металлов переменной валентности и т.д. (т.е. соединения характеризующиеся окислительной активностью). Выбирают концентрацию раствора оксиданта, дающую индукционный период биолюминесценции 3-6 минут. Этот раствор затем используют для приготовления контрольной и рабочей проб.
Состав контрольной пробы: 5 мкл раствора КРАБа, 50 мкл 0,0025% раствора миристинового альдегида, 50 мкл 5·10-4 М раствора флавинмононуклеотида, 150 мкл 0,05 М калий-фосфатного буфера рН 6,9, 200 мкл 4·10-4 М раствора NADH и 50 мкл раствора оксиданта выбранной концентрации.
Состав рабочей пробы: 5 мкл, раствора КРАБа, 50 мкл 0,0025% раствора миристинового альдегида, 50 мкл 5·10-4 М раствора флавинмононуклеотида, 150 мкл 0,05 М калий-фосфатного буфера рН 6,9, 200 мкл 4·10-4 М раствора NADH, 50 мкл раствора оксиданта выбранной концентрации и 0,2 г/л раствора гуминовых веществ. С помощью биолюминометра измеряют интенсивность биолюминесценции, определяют зависимость интенсивности биолюминесценции от времени для рабочей и контрольной проб, измеряют индукционный период (Т) биолюминесценции. Характеристикой антиоксидантной активности гуминовых веществ является отношение величин Т в присутствии гуминовых веществ концентрации 0,002 г/л (ТГВ) и в отсутствии гуминовых веществ (Т0). Если ТГВ/Т0<1, то гуминовые вещества обладают антиоксидантной активностью. Если ТГВ/Т0>1, то гуминовые вещества увеличивают оксидантную токсичность раствора.
Пример: Проведено определение антиоксидантной активности гуминовых веществ (Препарат Гумат-80, Иркутск) в растворах неорганического окислителя - феррицианида калия. Для этого сравнивали времена задержки свечения в растворах феррицианида в присутствии гуминовых веществ и без. Предварительно определяли концентрацию феррицианида, при которой Т=4 мин. Для этого варьировали концентрацию феррицианида в растворах, состав которых описан ниже.
Для приготовления растворов использовали 0,05 М калий-фосфатный буфер (рН 6,9). Во флакон Комплекта Реактивов Аналитической Биолюминесценции (КРАБ) вносили 1 мл калий-фосфатного буфера с ДТТ 0,05 М. Интенсивность биолюминесценции измеряли в растворах следующего состава: 5 мкл раствора КРАБа, 50 мкл 0,0025% раствора миристинового альдегида, 50 мкл 5·10-4 М раствора флавинмононуклеотида, 150 мкл 0,05 М калий-фосфатного буфера рН 6,9, 200 мкл
4·10-4 М раствора NADH, 50 мкл раствора феррицианида калия различных концентраций (0-5·10-4 M).
Строили зависимость интенсивности биолюминесценции (I/I0) от времени (фиг.1). Выбрали концентрацию ферриципнида 10-5 М, при которой Т=4 мин. (контрольная проба). В выбранный раствор добавляли 5 мкл раствора гуминовых веществ различных концентраций (0÷0,002 г/л) и таким образом готовили рабочие пробы. Снова регистрировали зависимость интенсивности биолюминесценции от времени, а затем определяли Т. Строили зависимости Т от концентрации гуминовых веществ (фиг.2).
Антиоксидантную активность гуминовых веществ в растворе феррицианида оценивали по отношению величин Т в присутствии гуминовых веществ концентрации 0,002 г/л (ТГВ) и в их отсутствии (Т0). В нашем случае ТГВ/Т0=2,7, что свидетельствует об увеличении оксидантной токсичности раствора в присутствии гуминовых веществ.
Преимущества заявляемого способа заключаются в том, что он определяет антиоксидантную активность гуминовых веществ по изменению интегральной токсичности всех окислителей присутствующих в растворе, прост, не требует сложного оборудования и дорогостоящих реактивов и является чувствительным и экспрессным (10-30 мин).
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЙ СПОСОБ МОНИТОРИНГА РАДИОТОКСИЧНОСТИ РАСТВОРА | 2006 |
|
RU2311462C1 |
| ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЙ СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ КАЛЬЦИЯ НА ОСНОВЕ РАЗРЯЖЕННЫХ ФОТОПРОТЕИНОВ | 2009 |
|
RU2411000C1 |
| БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЙ СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТИ ВЕЩЕСТВА | 2013 |
|
RU2571229C2 |
| СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЛЮИЗИТА В ВОДНО-СПИРТОВЫХ ЭКСТРАКТАХ | 1998 |
|
RU2141108C1 |
| Ферментативный способ оценки интегральной токсичности воздушной среды | 2019 |
|
RU2734621C1 |
| СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ УРОВНЯ РАБОТОСПОСОБНОСТИ СПОРТСМЕНОВ | 2020 |
|
RU2752621C1 |
| СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННОГО МНОГОКОМПОНЕНТНОГО РЕАГЕНТА ДЛЯ БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНОГО АНАЛИЗА | 2003 |
|
RU2252963C1 |
| Способ определения уровня стрессоустойчивости человека | 2017 |
|
RU2665144C1 |
| ЭКСПРЕСС-СПОСОБ БИОТЕСТИРОВАНИЯ ПРИРОДНЫХ, СТОЧНЫХ ВОД И ВОДНЫХ РАСТВОРОВ | 2009 |
|
RU2413771C2 |
| БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЙ БИОМОДУЛЬ ДЛЯ АНАЛИЗА ТОКСИЧНОСТИ РАЗЛИЧНЫХ СРЕД И СПОСОБ ЕГО ПРИГОТОВЛЕНИЯ | 2009 |
|
RU2413772C2 |
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в экологии и медицине, для количественной оценки ремедиационной способности природного детоксиканта-гуминовых веществ. Способ включает приготовление рабочей и контрольной биолюминесцентных проб на основе ферментов регистрируют индукционный период биолюминесценции обеих проб, при отношении ТГВ/Т0<1 гуминовые вещества обладают антиоксидантной активностью. При приготовлении контрольной пробы используют стандартный биолюминесцентный раствор с добавлением оксиданта, а при приготовлении рабочей пробы - стандартный биолюминесцентный раствор с добавлением оксиданта, содержащий гуминовые вещества. В качестве оксиданта используют феррицианид калия в концентрациях от 5·10-6 M до 3·10-5 М. Изобретение не требует сложного оборудования и дорогостоящих материалов и реактивов и является чувствительным и экспрессным (10-30 мин). 2 ил.
Биолюминесцентный способ определения антиоксидантной активности гуминовых веществ, включающий приготовление рабочей и контрольной биолюминесцентных проб на основе ферментов, при приготовлении контрольной пробы используют стандартный биолюминесцентный раствор с добавлением оксиданта, а при приготовлении рабочей пробы - стандартный биолюминесцентный раствор с добавлением оксиданта, содержащий гуминовые вещества, а в качестве оксиданта используют феррицианид калия в концентрациях от 5·10-6 M до 3·10-5 М и регистрируют индукционный период биолюминесценции обеих проб, при отношении
ТГВ/Т0<1 гуминовые вещества обладают антиоксидантной активностью.
| ФЕДОРОВА Е.С | |||
| и др | |||
| Детоксикация растворов органических красителей гуминовыми веществами, Биолюминесцентный мониторинг | |||
| Доклады академии наук, т.403, №4, с.554-556, 2005 | |||
| Способ определения концентрации ингибиторов биологической активности | 1980 |
|
SU865904A1 |
| Способ определения концентрации ингибиторов биологической активности | 1983 |
|
SU1204639A1 |
