Способ определения НАД-зависимой формиатдегидрогеназы Советский патент 1989 года по МПК C12Q1/66 

Изобретение относится к микробиологии и биохимии, в частности к способу определения НАД-зависимой фор- миатдегидрогенаэы в растворах, бесклеточных экстрактах и целых клетках микроорганизмов, и может найти применение в медицинской, фармацевтической и микробиологической промышленности, а также в научных исследованиях.

Цель изобретения - расширение функциональных возможностей способа, упрощение и ускорение процесса.

Предлагаемый способ включает нарушение целостности клеточной оболочки в 10-20%-ном растворе сахарозы или 20-30%-ном растворе глицерш1а замораживанием-размораживанием или обработкой лизоцимом в концентрации 1-2 мг/мп, или воздействием катионного поверхностно-активного вещества в концентрации 0,001-0,01 мг/нл суспензии. Детекцию НАДН, образующегося при ферментативной реакции,проводят биолюминесцентным методом в присутствии иммобилизованных НАДН1: 3 1Н - оксидоредуктазы и люциферазы.

Предлагаемый способ позволяет определять формиатдегидрогеназу в целых клетках микроорганизмов, что расширяет технологические возможности способа и значительно упрощает процесс по сравнению со сгектрофото- метрическим методом, СБЯЗс:Нным с необходимостью получения бесклеточного экстракта центрифугированием клеточной суспензии.

Обработка бактерий и дрожжей в растворе сахарозы или глицерина перечисленными способами в отличие от действия ультразвуком не приводит к полному разрушению клеточной стенки и выходу формиатдегидрогеназы в раствор, а лишь частично разрушает ее, образуя каналы, через которые осуществляется свободная диффузия субстрата и кофактора. Формиатде- гидрогеназа остается внутри клетки ( в этих условиях в течение длительного времени сохраняет свою активность, что позволяет определять чрезвычайно малые концентрации фермента даже в случае высоколабильного фермента.

Применение сахарозы или глицерина способствует также равномерному распределению клеток в объеме, что гарантирует надежность и воспроизводимость результатов. Снижение концентрации сахарозы (ниже 10 мас.%) или глицерина (ниже 20 об.%) приводит к частичному осаждению клеток, а увеличение концентрации .сахарозы и глицерина вьш1е указанных пределов снижает скорость ферментативной реакции за счет увеличения вязкости раствора, причем и в том, и в другом случаях уменьшается чувствительность метода.

При разрушении клеточной стенки под действием лизоцима используют концентрации 1-2 мг/мл клеточной суспензии. Уменьшение концентрации лизоцима ниже 1 мг/мл суспензии уменьшает чувствительность метода, ипользование концентрации вьш1е 2 мг/м суспензии нецелесообразно, так как не. влияет на чувствительность мегода

0

5

0

5

0

5

0

5

0

5

Для нарушения целостности клеточной оболочки можно использовать поверхностно-активные вещества катион- ной природы, тогда как применение анионных или неионных поверхностно- активных веществ не является эффективным. В качестве катионного поверхностно-активного вещества могут использоваться петилтриметиламмоний бромид, цетилпиридиннй хлорид, цетил- зтилдиметиламмоний бромид и т.д. в концентрации 0,001-0,01 мг/мл суспензии клеток. При использовании концентрации ниже 0,001 мг/мл уменьшается чувствительность анализа, при увеличении концентрации 0,01 мг/мл происходит нн 1ктивация иммобилизованных НАДН5 :ФМ11 - оксидоредуктазы и люциферазы, что также приводит к уменьшению чувствительности анализа,

Биолюминесцентньп метод с испол)- зованием НАДН. оксилор( дуктазы и люциферазы позволяет определять формиатдегидрогеназу в клетках и растворах в концентрации до 10 . Т. Для этого к клеточной суспен- ич и.ан раствору, содержащему формиатды идро- геназу, добавляют 11ЛЛН-, - окси- доредуктазу и люциферазу Beneckea harveyi, совместно иммобилизованные на BrCN-ariipo3e, и субстраты этих ферментов-флавинмононуклет ид ( МИ ) и деканаль. Иммобилизация ILVIH - оксидоредуктазы и люциферэзы } 1 ГИгг:Кеа harveyi приводит к значительной стабилизации их ферментлтивно ,чк1 HDH-.IC- ти в условиях данной реакции, Иммобилизацию НАДН,:ФМН - оксипорйдуктазы и люциферазы Beneckea hai Vi. y осуществляют инкубацией экстракта клеток с агарозой, активированной Br C N.

Пример 1. Определение активности формиатдегидрогеназы в целых клетках Pseudornonas .sp. 101.

В качестве продуцента используют щтамм метилотрофных бактерий Pseudo- monas sp 101 № ВКМ В-1545Д Института микробиологии АН СССР. Клетки 10 /мл суспендируют в 0,5 М калийфосфатном буфере, рН 7,0, содержащем 15% сахарозы, и подвергают последовательному замораживанию при -20 С и размораживают при 25°С. 2 мл полученной суспензии помещают в кювету люмипометра, добавляют 100 мкл 0,25 нМ раствора ШН в воде, 100 мкл 0,5 нМ раствора деканаля в 2%-ном растворе иэогтропа51

нола и 100 мкл суспензии иммобилизованных НАДН2.:ФМН - оксидоредуктазы и люциферазы Beneckea harveyi. Добавляют 100 мкл 25 нМ раствора НАД в воде и регистрируют фоновое свечение. Затем добавляют 100 мкл 3 М раствора формиата натрия и регистрируют свечение. Интенсивность свечения, определенная по разности между интенсивностью сигнала в присутствии формиата натрия и в отсутствии последнего, составляет 20 мВ в 1 мин, что соответствует 4 10 М формиатдегидрогена зы.

Пример2. В кювету люминомет ра помещают 2 мл клеточной суспензии по примеру 1, но в 10%-ном растворе сахарозы. Добавляют 100 мкл 0,25 нМ раствора ШН в воде и остальные реагенты по примеру 1. Интенсивность свечения составляет 18 мВ в 1 мин, что соответствует 3, формиат- дегидрогеназы.

Пример 3. В кювету люминомет ра помещают 2 мл клеточной суспензии по примеру 1, но в 10%-ном растворе сахагЮзы. Добавляют 100 мкл 0,25 нМ раствора ФМН в воде и остальные реагенты по примеру 1. Интенсивность свечения составляет 22 мВ в 1 мин, что соответствует 4, формиат- дегидрогеназы.

Пример. В кювету люмино- метра помещают 2 мл клеточной суспензии по примеру 1, но в 5%-ном растворе сахарозы. Добавляют 100 мкл 0,25 нМ раствора ФМН в воде и остальные реагенты по примеру 1, Интенсивность свечения составляет 1I мВ в 1 мин, что соответствует фор- миатдегидрогеназы.

Пример5. В кювету люмино- метра помещают 2 мл клеточной суспензии по примеру 1, но в 30%-ном растворе сахарозы. Добавляют 100 мкл 0,25 нМ раствора ФМН в воде и остальные реагенты по примеру I. Интенсивность свечения 12 мВ в 1 мин, соответствующая 2,410 М формиатдегид рогеназы.

Примерб. В кювету люминомет ра помещают 2 мл клеточной суспензии по примеру 1, но в 20%-ном растворе глицерина. Добавляют 100 мкл 0,25 нМ раствора ФМН в воде и остальные реагенты по примеру I. Интенсивность свечения составляет 22 мВ в

6 6

1 мин, что соответствует 4, формиатдегидрогеназы.

Пример. В кювету люминомет- ра помещают 2 мл клеточной суспензии

по примеру 1, но в 25%-ном растворе глицерина. Добавляют 100 мкл 0,25 нМ раствора ФМН в воде и остальные реагенты по примеру 1.Интенсивность свечения составляет 21 мВ в 1 мин, что соответствует 4,2-1 (/ И формиатдегидро- геназы.

Примерз. В кювету люминомет- ра ромещают 2 мп клеточной суспензик . по примеру 1, но в 30%-ном

растворе глицерина. Добавляют 100 мкл 0,25 нМ раствора ФМН в воде и остальные реагенты по примеру 1. Интенсивность свечения составляет 20 мВ в

i мин, что соответствует 4,0-10 °М формиатдегидрогеназы.

Пример9. В кювету люминомет- ра помещают 2 мп клеточной суспензии по примеру 1, но в 10 %-ном растворе глицерина. Добавляют 100 мкл Э,25 нМ раствора ®iH в воде и остальные реагенты по примеру 1. Интенсивность свечения составляет 15 мВ в I мин, что соответствует 3 1 0 М

фермента.

Пример 10. В кювету люмино- метра помещают 2 мл клеточной суспензии по примеру 1, но в 40%-ном глицерине. Добавляют 100 мкл 0,25 нМ раствора ФМН в воде и остальные реагенты по примеру . Интенсивность свечения составляет 14 мВ в 1 мин, что соответствует 2,8-10 М формиатдегидрогеназы.

Пример II. В кювету люмино- метра помещают 2 мл клеточной суспензии Pseudomonas sp. 101, содержащей 10 клеток на 1 мл и 15%-ной сахарозы, и добавляют 2 мг на 1 мл лизоцима. Добавляют 100 мкл 0,25 нМ раствора WIH в воде и остальные реагенты по примеру I. Интенсивность свечения составляет 18 мВ в 1 мин или 3,6-10 М фермента.

Пример 12. В кювету люмино- метра помещают 2 мл клеточной суспензии по примеру 11, а лизоцима добавляют 1 мг на I мл. Добавляют 100 мкл 0,25 нМ раствора ФМН в воде и остальные реагенты по примеру 1. Интенсивность свечения составляет 16 мВ в 1 мин, что соответствует 3,() фермента.

Пример 13. В кювету люмино- метра помещают 2 мл клеточной суспензии по примеру I1, а лизоцим добавляют в количестве 3 мг на 1 мл. Добав- ляют 100 мкл 0,25 нМ раствора ФМН в воде и остальные реагенты по примеру I. Интенсивность свечения составляет 18 мП я 1 мии, соответствует 3,6-10- М формиатдегидрогеназы.

Пример 14. в кювету люми- нометра помещают 2 мл клеточной суспензии Pseudomonas sp. 101, содержащей 10 клеток в 1 МП 0,5 М калий- фосфатного буфера, содержащего 15% сахарозы, и добавляют 100 мкл 0,01%-ного раствора катионного поверхностно-акт вного вещества цетил-г триметйламмоний б ромида. Добавляют 100 мкл 0,25 нМ раствора 1Н в воде и остальные реагенты по примеру 1. Интенсивность свечения составляет 24 мВ в 1 мин, что соответствует 4,8-10 М формиатдегидрогеназы.

Пример 15. В кювету люмино- метра помещают 2 мл клеточной суспензии по примеру 14 и добавляют 100 мкл 0,005%-ного раствора це- тилтриметиламмоний бромида. Добавляют 100 мкл 0,25 нМ раствора ФМН в воде и остальные реагенты по примеру 1. Интенсивность свечения равна 22,8 мВ в I мин или 4,6-10 °М формиатдегидрогеназы.

Пример 16. В кювету люмино- метра помещают 2 мл клеточной суспензии по примеру 14 и добавляют 100 мкл 0,0001%-ного раствора це- тилтриметиламмоний бромида. Добавляют 100 мкл 0,25 нМ раствора 1МН в воде и остальные реагенты по примеру 1 . Интенсивность свечения равна 22 мВ в 1 мин или 4,4-10 М формиатдегидрогеназы.

Приме р 17. В кювету люмино- метра помещают 2 мл клеточной суспензии, содержащей 10 клеток в 1 мл 0,5 М калийфосфатного буфера, содержащего 15% сахарозы, и добавляют 100 мкл 0,0005%-ного раствора цетилтриметиламмоний бромида. Добавляют 100 мкл 0,25 нМ раствора ФМН в воде и остальные реагенты по примеру I. Интенсивность свечения равна 18 мВ в I мин или 3,6-10 г1 формиатдегидрогеназы.

Пример 18. В кювету люмино- метра помещают 2 мл клеточной суспензии Pf.eudomonar, sp. 101, содержа

5 0

5 О

с о

З

0

5

щей 10 клеток в 1 мл О,1 М калий- фосфатного буфера, содержащего 15% сахарозы, и добавляют 100 мкл 0,02%-ного раствора цетилэтилдиметил- аммоний бромида. Добавляют I00 мкл 0,25 нМ раствора ФМН в воде и остальные реагенты по примеру I. Интенсивность свечения I5 мВ и 1 мин, что соответствует 2,8-10 М формиатдегидрогеназы.

Пример 19. Определение фор миатдегидрогеназы в целых клетках метилотрофных дрожжей Candida methy- lica ИБФМ У-670.

В кювету люминометра помешают 2 мл клеточной суспензии Candida methylica в 0,1 М калийфосфатном буфере, содержащей 10 клеток и 15% сахарозы, и добавляют 100 мкл 0,01%-ного раствора цетилтриметиламмоний бромида. Добавляют 100 мкл 0,25 М раствора 1МН и остальные реагенты по примеру I. Интенсивность свечения 24 мВ в 1 мин или 4, формиатдегидрогеназы.

П р и М е р 20. Определение ВАД- зависимой формиатдегидрогеназы в целых клетках Escherichia coli.

В кювету люминометра Ъомещают 2 мл клеточной суспензии Е. coli, содержащей 10 клеток в 1 мл 0,1 М капийфосфатного буфера и 15% сахарозы, и добавляют 2 мг лизоцима. Добавляют 100 мкл 0,25 нМ раствора даш в воде и остальные реагенты по примеру 1. Интенсивность свечения равна О, т.е. НАД-зависнмая формиат- дегидрогеназй в клетках Е. coli отсутствует.

П р и М е р 21. Определение НАД- зависимой формиатдегидрсггеназы в целых клетках Zactobacillus casei.

В кювету люминометра помещают 2 мл клеточной суспензии, содержащей 10 клеток в 1 МП 0,1 М калийфосфат- ного буфера и 15% сахарозы, и добавляют 2 мг лизоцима. Добавляют 100 мкл 0,25 нМ раствора в воде и осталь- ные реагенты по примеру 1 . Интенсивность свечения равна 0. НАД-зависи- мая формиатдегидрогеназа в клетках Zactobacillus casei отсутствует.

П р и М е р 22. Определение НАД- зависимой формиатдегидрогеназы в растворе (бесклеточном экстракте).

В кювету люминометра помещают 2 мл раствора 0,1 М калийфосфатного буфера, содержащего формиатдегидрогеназу. Добанляют 100 мкл 0,25 нМ раствора ФМН в воде и остальные реагенты по примеру I. Интенсивность свечения (мВ в мннуту) определяют для различных концентраций фермента. В таблице дана интенсивность свечения в зависимости от концентрации формиатдегидрогеназы в растворе.

-

ПредлагаемьЕЙ способ позволяет определять нативный фермент в целых клетках бактерий и дрожжей, имеет достаточно высокую чувствительность определения НДЦ-зависимой формиа вде- гидрогеназы () и, что особенно важно для анализа генных клонотек, представленных несколькими тысячами генно-инженерных штаммов, фермент может быть обнаружен в микроколичест вах исходной биомассы (для проведения одного анализа достаточно 10 клеток). Последнее особенно важно в том плане, что осуществление процесса наращивания биомассы для опре- деления активности НАД-зависимой

0

5

0

5 0 5

формиатдегидрогеназы по методу, указанному в прототипе, может носить принципиальные сложности в связи с проблемой зкспрессии генов. Преимуществами предлагаемого метода являются также быстрота определения (2-3 мин) и возможность автоматизации процесса измерения, что также имеет принципиальное значение при . серийных анализах.

Формула изобретения

йпособ определения НАД-зависимой формиатдегидрогеназы микроорганизмов, включающий нарушение целостности клеточной оболочки, последующую детекцию НАДН, образующегося в результате ферментативной реакции, отличающийся тем, что, с целью расширения функциональных воз- можностей способа,упрощения и ускорения процесса, нарушение клеточной оболочки проводят в растворе сахарозы с концентрацией 10-20% или в растворе глицерина с концентрацией 20-30% замораживанием-размораживанием, или обработкой лизоцимом в концентрации 1-2 мг/мл, или воздействием катион- ного поверхностно-активного вещества в концентрации 0,001-0,01 мг/мл, а детекцию НАДН проводят биолюминес- центным методом в присутствии иммобилизованных НАДН:ФМН - оксидоредукта- зы и люциферазы.

Изобретение относится к биохимии, в частности к анализу формиатдегидрогеназы в клетках и растворах и может найти применение в микробиологической промышленности, медицине, а также в научных исследованиях. Цель изобретения - расширение функциональных возможностей способа, упрощение и ускорение процесса. Способ определения НАД-зависимой формиатдегидрогеназы предусматривает частичное разрушение оболочки клеток микроорганизмов замораживанием-размораживанием или обработкой лизоцимом или катионным поверхностно-активным веществом в растворе глицерина или сахарозы с последующей детекцией НАДН биолюминесцентным методом в присутствии иммобилизованных НАДН₂:ФМН-оксидоредуктазы и люциферазы BENECREA HARVEYI. Способ позволяет определять нативный фермент в целых клетках бактерий и дрожжей, имеет достаточно высокую чувствительность (10^-1°М), кроме того, формиатдегидрогеназа может быть обнаружена в микроколичествах исходной биомассы, что особенно важно при анализе генных клонотек. 1 табл.