АНТИГЕННЫЕ МЕНИНГОКОККОВЫЕ ПЕПТИДЫ (ВАРИАНТЫ) Российский патент 2005 года по МПК C12N15/31 C07K2/00 C07K14/195 A61K38/02 A61K38/40 A61P31/04 

Все цитируемые здесь документы включены в качестве ссылки во всей полноте. В частности, в данное описание включено в качестве ссылки содержимое международной заявки на патент W099/36544.

Область изобретения

Данное изобретение относится к антигенным пептидным последовательностям из бактерии Neisseria meningitidis.

На основе капсулярного полисахарида данного организма были идентифицированы 12 серологических групп N. meningitidis. Группа А является патогеном, наиболее часто причастным к эпидемическому заболеванию расположенной южнее Сахары части Африки. Серологические группы В и С являются ответственными за обширное большинство случаев в Соединенных Штатах и в большинстве развитых стран. Серологические группы W135 и Y являются ответственными за остальные случаи в Соединенных Штатах и развитых странах.

Менингококковая вакцина, используемая в настоящее время, является четырехвалентной полисахаридной вакциной, состоящей из серологических групп А, С, Y и W135. Однако менингококк В остается проблемой. Полисахаридный подход не может быть использован, так как капсулярный полисахарид menB является полимером α(2-8)-связанной N-ацетилнейраминовой кислоты, которая присутствует также в ткани млекопитающих. Один подход к вакцине menB использует смеси белков наружной мембраны (ОМР). Для преодоления разнообразия антигенных свойств были сконструированы поливалентные вакцины, содержащие до девяти различных поринов [например, Poolman JT (1992) Infect. Agents Dis. 4:13-28]. Дополнительными белками для применения в вакцинах наружной мембраны были белки ора и орс, но ни один из этих подходов не смог преодолеть разнообразие антигенных свойств [например, Ala'Aldeen and Borriello (1996) Vaccine 14(1):49-53].

Изобретение

Данное изобретение относится к фрагментам белков, описанным в международной патентной заявке WO99/36544, причем данные фрагменты содержат по меньшей мере одну антигенную детерминанту.

Таким образом, если длина любой конкретной последовательности белка, описанной в WO99/36544, равна х аминокислотам (см. таблицу II), то данное изобретение относится к фрагментам самое большее х-1 аминокислот данного белка. Фрагмент может быть более коротким, чем эта длина (например, х-2, х-3, х-4,...) и содержит предпочтительно 100 аминокислот или менее (например, 90 аминокислот, 80 аминокислот и т.д.). Данный фрагмент может быть таким коротким, как 3 аминокислоты, но предпочтительно является более длинным (например, до 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75 или 100 аминокислот).

Предпочтительные фрагменты содержат менингококковые пептидные последовательности, приведенные в таблице I, или их субпоследовательности. Данные фрагменты могут быть более длинными, чем фрагменты, представленные в таблице I, например, если фрагмент в таблице I простирается от аминокислотного остатка р до остатка q белка, то данное изобретение относится также к фрагментам от остатка (р-1), (р-2) или (р-3) до остатка (q+1), (q+2) или (q+3).

Данное изобретение также относится к полипептидам, которые являются гомологичными (т.е. имеют идентичность последовательности) данным фрагментам. В зависимости от конкретного фрагмента степень идентичности является предпочтительно более высокой, чем 50% (например, 60, 70, 80, 90, 95, 99% или более). Эти гомологичные полипептиды включают мутанты и аллельные варианты данных фрагментов. Идентичность между двумя последовательностями предпочтительно определяют при помощи алгоритма поиска гомологии Smith-Waterman, осуществленного в программе MPSRCH (Oxford Molecular), использующего поиск аффинного пропуска с параметрами штраф за открытие пропуска = 12 и штраф за удлинение пропуска = 1.

Данное изобретение также относится к белкам, содержащим один или более описанных выше фрагментов.

Данное изобретение подчиняется условию, что оно не включает в его объем белки, содержащие какую-либо из 45 белковых последовательностей, описанных в WO99/36544 (т.е. четных последовательностей SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10,..., 86, 88, 90 WO99/36544).

Белки данного изобретения могут быть, конечно, получены различными способами (например рекомбинантной экспрессией, очисткой из культуры клеток, химическим синтезом и т.д.) и в различных формах (например, нативные, С-концевые и/или N-концевые слитые белки и т.д.). Их предпочтительно получают по существу в чистом виде (т.е. по существу не содержащие других белков Neisseria или белков клетки-хозяина). Короткие белки предпочтительно получают с использованием химического пептидного синтеза.

Согласно другому аспекту, данное изобретение относится к антителам, которые узнают фрагменты данного изобретения, при условии, что данное изобретение не включает в его объеме антитела, которые узнают одну из 45 полных белковых последовательностей в WO99/36544. Данные антитела могут быть поликлональными или, предпочтительно, моноклональными и могут быть получены любыми подходящими способами.

Данное изобретение также относится к белкам, содержащим пептидные последовательности, распознаваемые данными антителами. Данные пептидные последовательности будут, конечно, включать фрагменты менингококковых белков в WO99/36544, но будут также включать пептиды, которые имитируют антигенную структуру менингококковых пептидов при связывании с иммуноглобулином.

Согласно следующему аспекту, данное изобретение относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей фрагменты и белки данного изобретения, при условии, что данное изобретение не включает в его объеме нуклеиновую кислоту, кодирующую одну из 45 белковых последовательностей в WO99/36544.

Кроме того, данное изобретение относится к нуклеиновой кислоте, содержащей последовательности, гомологичные (т.е. имеющие идентичность последовательности) данным последовательностям. Далее, данное изобретение относится к нуклеиновой кислоте, которая может гибридизоваться с этими последовательностями, предпочтительно в условиях "высокой жесткости" (например, при 65°С в растворе 0,1xSSC, 0,5% ДСН).

Должно быть понятно, что данное изобретение относится к нуклеиновой кислоте, содержащей последовательности, комплементарные последовательностям, описанным выше (например, для целей получения антисмысловых последовательностей или зондирования).

Нуклеиновая кислота данного изобретения может быть, конечно, получена многочисленными путями (например, химическим синтезом, из библиотек геномных ДНК или кДНК, из самого организма и т.д.) и может иметь различные формы (например, одноцепочечную форму, двухцепочечную форму, форму векторов, зондов и т.д.). Кроме того, термин "нуклеиновая кислота" включает в себя ДНК и РНК, а также их аналоги, такие как аналоги, содержащие модифицированные каркасные структуры, а также пептиднуклеиновые кислоты (ПНК) и т.д.

Согласно следующему аспекту, данное изобретение относится к векторам, содержащим нуклеотидные последовательности данного изобретения (например, экспрессирующие векторы), и клетки-хозяева, трансформированные такими векторами.

Согласно следующему аспекту, данное изобретение относится к композициям, содержащим белок, антитело и/или нуклеиновую кислоту данного изобретения. Данные композиции могут быть применимы, например, в качестве вакцин, или в качестве диагностических реагентов, или в качестве иммуногенных композиций.

Данное изобретение также относится к нуклеиновой кислоте, белку или антителу в соответствии с данным изобретением для применения в качестве лекарственных средств (например, в качестве вакцин или в качестве иммуногенных композиций) или в качестве диагностических реагентов. Оно также относится к применению нуклеиновой кислоты, белка или антитела в соответствии с данным изобретением в приготовлении: (i) лекарственного средства для лечения или профилактики инфекции, вызываемой бактериями Neisseria; (ii) диагностического реагента для обнаружения присутствия бактерий Neisseria или антител, индуцированных против бактерий Neisseria; и/или (iii) реагента, который может индуцировать антитела против бактерий Neisseria. Указанные бактерии Neisseria могут относиться к любому виду или штамму (например, N. gonorrhoeae), но предпочтительно являются N. meningitidis, в частности штаммом А или штаммом В.

Данное изобретение также относится к способу лечения пациента, предусматривающему введение пациенту терапевтически эффективного количества нуклеиновой кислоты, белка и/или антитела в соответствии с данным изобретением.

Согласно следующим аспектам, данное изобретение относится к различным способам.

Относится к способу получения белков данного изобретения, предусматривающему стадию культивирования клетки-хозяина в соответствии с данным изобретением в условиях, обеспечивающих экспрессию белка.

Относится к способу получения белка или нуклеиновой кислоты данного изобретения, в котором белок или нуклеиновую кислоту синтезируют отчасти или полностью химическими средствами.

Относится к способу обнаружения полинуклеотидов данного изобретения, предусматривающему стадии: (а) контактирования зонда нуклеиновой кислоты данного изобретения с биологическим образцом в условиях гибридизации для образования дуплексов и (b) детектирования указанных дуплексов.

Относится к способу обнаружения белков данного изобретения, предусматривающему стадии: (а) контактирования антитела данного изобретения с биологическим образцом в условиях, подходящих для образования комплексов антитело-антиген; и (b) детектирования указанных комплексов.

Краткое изложение стандартных способов и процедур, которые могут быть использованы для осуществления данного изобретения (например, для использования описанных последовательностей для вакцинации или диагностических целей), следует далее. Это краткое изложение не является ограничением данного изобретения, а скорее дает примеры, которые могут быть использованы, но не являются обязательными.

Общая часть

Практика данного изобретения будет предусматривать, если нет иных указаний, общепринятые способы молекулярной биологии, микробиологии, рекомбинантных ДНК и иммунологии, которые находятся в пределах квалификации в данной области. Такие способы полностью объяснены в литературе, например, Sambrook Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Second Edition (1989); DNA Cloning. Volumes I and ii (D.N Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait ed, 1984); Nucleic Acid Hybridization (B.D.Hames & S.J.Higgins eds. 1984); Transcription and Translation (B.D.Hames & S.J.Higgins eds. 1984); Animal Cell Culture (R.I.Freshney ed. 1986); Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, 1986); В. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); the Methods in Enzymology series (Academic Press, Inc.), especially volumes 154 & 155; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.H.Miller and M.P.Calos eds. 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Mayer and Walker, eds. (1987), Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, London); Scopes, (1987) Protein Purification; Principles and Practice, Second Edition (Springer-Verlag, N.Y.), and Handbook of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D.M.Weir and C.C.Blackwell eds 1986).

В данном описании используются стандартные аббревиатуры для нуклеотидов и аминокислот.

Все публикации, патенты и заявки на выдачу патента, цитируемые здесь, включены в данное описание во всей полноте в качестве ссылки.

Определения

Композиция, содержащая X, является "по существу не содержащей" Y, когда по меньшей мере 85% по весу общей суммы Х+Y в данной композиции составляет X. Предпочтительно, Х составляет по меньшей мере приблизительно 90% по весу общего Х+Y в данной композиции, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 95% или даже 99% по весу.

Термин “содержащий” обозначает “включающий в себя”, а также “составляющий”, например, композиция, “содержащая” Х может состоять исключительно из Х или может включать что-либо дополнительно к X, например, X+Y.

Термин “антигенная детерминанта” включает в себя В-клеточные и Т-клеточные эпитопы.

Термин “гетерологичные” относится к двум биологическим компонентам, которые не обнаруживаются вместе в природе. Данные компоненты могут быть клетками-хозяевами, генами или регуляторными областями, такими как промоторы. Хотя гетерологичные компоненты не обнаруживаются вместе в природе, они могут функционировать вместе, например, когда промотор, гетерологичный гену, функционально связан с данным геном. Другим примером является случай, когда менингококковая последовательность является гетерологичной мышиной клетке-хозяина. Следующим примером могли бы быть два эпитопа из одного и того же или из различных белков, которые были собраны в единый белок в расположении, неприродного происхождения.

“Сайт инициации репликации” является полинуклеотидной последовательностью, которая инициирует и регулирует репликацию полинуклеотидов, таких как экспрессирующий вектор. Сайт инициации репликации ведет себя как автономная единица репликации полинуклеотидов в клетке, способная к репликации под ее собственным контролем. Сайт инициации репликации может нуждаться в векторе для репликации в конкретной клетке-хозяине. В случае некоторых сайтов инициации репликации экспрессирующий вектор может высокопродуктивно воспроизводиться в присутствии подходящих белков в клетке. Примерами сайтов инициации репликации являются автономно реплицирующие последовательности, эффективные в дрожжах, и вирусный Т-антиген, эффективный в клетках COS-7.

Экспрессирующие системы

Менингококковые нуклеотидные последовательности могут экспрессироваться во многих различных экспрессирующих системах; например в системах, используемых с клетками млекопитающих, бакуловирусами, растениями, бактериями и дрожжами.

i. Системы млекопитающих

Экспрессирующие системы млекопитающих известны в данной области. Промотором млекопитающих является любая последовательность ДНК, способная связывать РНК-полимеразу млекопитающих и инициировать транскрипцию в направлении 3' кодирующей последовательности (например, структурного гена) в мРНК. Промотор будет иметь область инициации транскрипции, которая обычно помещена проксимально к 5'-концу кодирующей последовательности, и ТАТА-бокс, обычно расположенный на 25-30 пар оснований (п.н.) левее от сайта инициации транскрипции. Считают, что ТАТА-бокс управляет РНК-полимеразой II для начала синтеза РНК в правильном сайте. Промотор млекопитающих будет содержать также левый элемент промотора, обычно расположенный на 100-200 п.н. левее от ТАТА-бокса. Левый элемент промотора определяет скорость, с которой инициируется транскрипция, и может действовать в любой ориентации [Sambrook et al. (1989) "Expression of Cloned Genes in Mammalian Cells". In Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd ed.].

Гены вирусов млекопитающих часто высокопродуктивно экспрессируются и имеют широкий круг хозяев; таким образом, последовательности, кодирующие гены вирусов млекопитающих, обеспечивают особенно применимые промоторные последовательности. Примеры включают ранний промотор SV40, LTR-промотор вируса опухоли молочной железы мышей, большой поздний промотор аденовируса (AdMLP) и промотор вируса простого герпеса. Кроме того, последовательности, полученные не из вирусных генов, такие как мышиный ген металлотионеина, также обеспечивают применимые промоторные последовательности. Экспрессия может быть либо конститутивной, либо регулируемой (индуцибельной) в зависимости от промотора, который может индуцироваться глюкокортикоидом в гормон-чувствительных клетках.

Присутствие энхансерного элемента (энхансера), объединенного с описанными выше промоторными элементами, будет обычно увеличивать уровни экспрессии. Энхансер представляет собой регуляторную последовательность ДНК, которая может стимулировать транскрипцию до 1000-кратного уровня при связывании с гомологичными или гетерологичными промоторами, причем синтез начинается в нормальном инициирующем сайте РНК. Энхансеры являются также активными, когда они помещены левее или правее от сайта инициации транскрипции, в нормальной или обратной ориентации, или на расстоянии более 1000 нуклеотидов от промотора [Maniatis et al. (1987) Science 236:1237; Alberts et al. (1989) Molecular Biology of the Cell, 2^nd ed.]. Энхансерные элементы, происходящие из вирусов, могут быть особенно применимы, так как они обычно имеют более широкий круг хозяев. Примеры включают энхансер раннего гена SV40 [Dijkema et al (1985 EMBO J. 4:761] и энхансер/промоторы, полученные из длинного концевого повтора (LTR) вируса саркомы Рауса [Gorman et al.(1989b) Proc. Natl. Acad. Sci. 79:6777] и из цитомегаловируса человека [Boshart et al. (1985) Cell 41:521]. Кроме того, некоторые энхансеры являются регулируемыми и становятся активными только в присутствии индуктора, такого как гормон или ион металла [Sassone-Corsi and Borelli (1986) Trends Genet. 2:215; Maniatis et al. (1987) Science 236:1237].

Молекула ДНК может экспрессироваться внутриклеточно в клетках млекопитающих. Промоторная последовательность может быть связана непосредственно с данной молекулой ДНК, и в этом случае первой аминокислотой на N-конце рекомбинантного белка всегда будет метионин, который кодируется стартовым кодоном ATG. Если желательно, N-конец может быть отщеплен от данного белка инкубированием in vitro с цианогенбромидом.

Альтернативно, чужеродные промоторы могут также секретироваться из клетки в среду для выращивания посредством образования химерных молекул ДНК, которые кодируют слитый (гибридный) белок, состоящий из фрагмента лидерной последовательности, которая относится к секреции чужеродного белка в клетках млекопитающих. Предпочтительно, имеются сайты процессинга, кодируемые между лидерным фрагментом и чужеродным геном, которые могут расщепляться in vivo или in vitro. Фрагмент лидерной последовательности обычно кодирует сигнальный пептид, состоящий из гидрофобных аминокислот, которые управляют секрецией данного белка из клетки. Состоящий из трех частей лидер аденовируса является примером лидерной последовательности, которая относится к секреции чужеродного белка в клетках млекопитающих.

Обычно последовательности терминации транскрипции и полиаденилирования, распознаваемые клетками млекопитающих, являются регуляторными областями, расположенными 3' относительно стоп-кодона трансляции, и, следовательно, вместе с промоторными элементами фланкируют кодирующую последовательность. 3'-конец зрелой молекулы мРНК образуется сайт-специфическим посттранскриционным расщеплением и полиаденилированием [Birnstiel et al. (1985) Cell 41:349; Proudfoot and Whitelaw (1988) "Termination and 3' end processing of eukariotic RNA. In Transcription and splicing (ed. B.D.Hames and D.M.Glover); Proudfoot (1989) Trends Biochem. Sci. 14:105]. Такие последовательности управляют транскрипцией мРНК, которая может транслироваться в полипептид, кодируемый данной ДНК. Примеры сигналов терминации транскрипции/полиаденилирования включают сигналы, полученные из SV40 [Sambrook et al. (1989) "Expression of cloned genes in cultured mammalian cells." In Molecular Cloning: A Laboratory Manual].

Обычно описанные выше компоненты, содержащие промотор, сигнал полиаденилирования и последовательность терминации транскрипции, помещают вместе в экспрессирующие конструкции. Энхансеры, интроны с функциональными донорным и акцепторным свитами сплайсинга и лидерные последовательности могут быть также включены в экспрессирующую конструкцию, если желательно. Экспрессирующие конструкции часто сохраняются в репликоне, таком как в нехромосомный элемент (например, плазмиды), способном к стабильному сохранению в хозяине, таком как клетки млекопитающих или бактерии. Реплицирующие системы млекопитающих включают системы, произведенные из вирусов животных, которые требуют транс-действующих факторов для репликации. Например, плазммды, содержащие реплицирующие системы паповавирусов, таких как SV40 [Gluzman (1981) Cell 23:175], или полиомавирусов, реплицируются чрезвычайно высокопродуктивно в присутствии подходящего вирусного Т-антигена. Дополнительные примеры репликонов млекопитающих включают репликоны, полученные из папилломавируса крупнорогатого скота и вируса Эпштейна-Барр. Кроме того, репликон может иметь две системы репликации, что позволяет ему сохраняться, например, в клетках млекопитающих для экспрессии и в прокариотическом хозяине для клонирования и амплификации. Примеры таких челночных векторов млекопитающих-бактерий включают pMT2 [Kaufman et al. (1989) Mol. Cell. Biol. 9:946] и рНЕВО [Shimizu et al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6:1074].

Используемая процедура трансформации зависит от трансформируемого хозяина. Способы введения гетерологичных полинуклеотидов в клетки млекопитающих известны в данной области и включают опосредованную декстраном трансфекцию, осаждение фосфатом кальция, опосредованную полибреном трансфекцию, слияние протопластов, электропорацию, инкапсулирование полинуклеотида (полинуклеотидов) в липосомах и прямую микроинъекцию ДНК в ядра.

Клеточные линии млекопитающих, доступные для экспрессии, известны в данной области и включают многие иммортализованные клеточные линии, доступные из Американской Коллекции Типовых Культур (АТСС), включая, но не ограничиваясь ими, клетки яичника Китайского хомячка (СНО), клетки HeLa, клетки почек детеныша хомячка (ВНК), клетки почек обезьяны (COS), клетки печеночно-клеточной карциномы человека (например, Нер G2), и ряд других клеточных линий.

ii. Бакуловирусные системы

Полинуклеотид, кодирующий белок, может быть также встроен в подходящий экспрессирующий вектор насекомых и функционально связан с регуляторными элементами в данном векторе. Конструирование вектора использует способы, которые известны в данной области. Обычно компоненты данной экспрессирующей системы включают вектор-переносчик, обычно бактериальную плазмиду, которая содержит как фрагмент генома бакуловируса, так и подходящий сайт рестрикции для инсерции гетерологичного гена или генов, которые должны экспрессироваться; бакуловирус дикого типа с последовательностью, гомологичной бакуловирус-специфическому фрагменту в векторе-переносчике (это делает возможной гомологичную рекомбинацию гетерологичного гена в геном бакуловируса); и подходящие клетки-хозяева насекомых и среду для выращивания.

После встраивания последовательности ДНК, кодирующей данный белок, в вектор-переносчик, данный вектор и вирусный геном дикого типа трансфицируют в клетку-хозяин насекомого, где данному вектору и вирусному геному дают рекомбинироваться. Экспрессируется упакованный рекомбинантный вирус и рекомбинантные стерильные пятна идентифицируют и очищают. Материалы и способы для экспрессирующих систем бакуловирус/клетка насекомого являются коммерчески доступными в форме наборов из, inter alia, Invitrogen, San Diego CA ("MaxBac" kit). Эти способы обычно известны специалистам в данной области и во всей полноте описаны у Summers and Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555 (1987) (далее называемой "Summers and Smith").

Перед встраиванием последовательности ДНК, кодирующей данный белок, в геном бакуловируса, описанные выше компоненты, включающие в себя промотор, лидер (если желательно), представляющую интерес кодирующую последовательность и последовательность терминации транскрипции, обычно помещают в промежуточную перемещающую конструкцию (вектор-переносчик, трансдуцирующий вектор). Такая конструкция может содержать единственный ген и функционально связанные регуляторные элементы; множественные гены, каждый с его собственным набором функционально связанных регуляторных элементов; или множественные гены, регулируемые одним и тем же набором регуляторных элементов. Промежуточные перемещающие конструкции часто сохраняются в репликоне (автономной единице репликации), таком как внехромосомный элемент (например, плазмиды), способном стабильно сохраняться в хозяине, таком как бактерия. Репликон будет иметь систему репликации, что позволяет ему сохраняться в подходящем хозяине для клонирования и амплификации.

В настоящее время наиболее часто используемым вектором-переносчиком для введения чужеродных генов в AcNPV является рАс373. Были также сконструированы многие другие векторы, известные специалистам в данной области. Они включают, например, pVL985 (который изменяет стартовый кодон полиэдрина с ATG на АТТ и который вводит клонирующий сайт BamHI 32 п.н. правее от АТТ; см. Luckow and Summers, Virology (1989) 17:31.

Данная плазмида обычно также содержит сигнал полиаденилирования полиэдрина (Miller et al. (1988) Ann. Rev. Microbiol., 42:177) и прокариотический ген устойчивости к ампициллину (аmр) и сайт инициации репликации для отбора и размножения в Е. coii.

Бакуловирусные векторы-переносчики обычно содержат промотор бакуловируса. Промотором бакуловируса является любая ДНК-последовательность, способная связывать бакуловирусную РНК-полимеразу и инициировать транскрипцию в направлении 5'→3' кодирующей последовательности (например, структурного гена) в мРНК. Промотор будет иметь область инициации транскрипции, которая обычно находится проксимально к 5'-концу кодирующей последовательности. Обычно эта область инициации транскрипции включает в себя сайт связывания РНК-полимеразы и сайт инициации транскрипции. Бакуловирусный вектор-переносчик может также иметь второй домен, называемый энхансером, который в случае его присутствия обычно расположен дистально относительно структурного гена. Экспрессия может быть регулируемой или конститутивной.

Структурные гены, обильно транскрибируемые в последние периоды вирусного инфекционного цикла, обеспечивают особенно подходящие промоторные последовательности. Примеры включают последовательности, полученные из гена, кодирующего вирусный белок полиэдрин, Friesin et al. (1986) "The Regulation of Baculovirus Gene Expression, " в: The Molecular Biology of Baculoviruses (ed. Walter Doerfler); EPO Publ. Nos. 127839 and 155476; и ген, кодирующий белок р10, Vlak et al. (1988), J.Gen. Virol. 69:765.

ДНК, кодирующие подходящие сигнальные последовательности, могут быть получены из генов для секретируемых белков насекомых или бакуловируса, таких как бакуловирусный ген полиэдрина (Carbonell et al. (1988) Gene 73:409). Альтернативно, поскольку сигналы для посттрансляционных модификаций клеток млекопитающих (такие как сигнал расщепления пептидов, протеолитического расщепления и фосфорилирования), по-видимому, узнаются клетками насекомых, и сигналы, требующиеся для секреции и ядерного накопления, также, по-видимому, сохраняются между клетками беспозвоночных и клетками позвоночных, лидерные последовательности (лидеры), не происходящие из насекомых, такие как лидеры, происходящие из генов, кодирующих α-интерферон человека, Maeda et al. (1985), Nature 315:592; гастрин-высвобождающий пептид человека, Labaeq-Verheyden et al., (1988), Molec. Cell. Biol. 8:3129; IL-2 человека. Smith et al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:8404; мышиный IL-3, Miyajima et al., (1987) Gene 58:273; и глюкоцереброзидазу человека, Martin et al. (1988) DNA, 7:99, могут быть также использованы для обеспечения секреции в насекомых.

Рекомбинантный полипептид или полипротеин может экспрессироваться внутриклеточно или, если он экспрессируется с правильными регуляторными последовательностями, он может секретироваться. Хорошая внутриклеточная экспрессия неслитых чужеродных белков обычно требует гетерологичных генов, которые в идеале имеют короткую лидерную последовательность, содержащую подходящие сигналы инициации трансляции, предшествующие стартовому сигналу ATG. Если желательно, метионин на N-конце может быть отщеплен от зрелого белка инкубированием in vitro с цианогенбромидом.

Альтернативно, рекомбинантные полипротеины или белки, которые природно не секретируются, могут секретироваться из клетки насекомого посредством создания химерных молекул ДНК, которые кодируют слитый белок, состоящий из фрагмента лидерной последовательности, которая относится к секреции чужеродного белка в насекомых. Данный фрагмент лидерной последовательности обычно кодирует сигнальный пептид, состоящий из гидрофобных аминокислот, которые управляют транслокацией данного белка в эндоплазматический ретикулум.

После инсерции ДНК-последовательности и/или гена, кодирующего продукт экспрессии, являющийся предшественником данного белка, клетку-хозяин насекомого котрансформируют гетерологичной ДНК вектора-переносчика и геномной ДНК бакуловируса дикого типа - обычно котрансфекцией. Промотор и последовательность терминации транскрипции данной конструкции обычно будут содержать участок 2-5 т.п.н. генома бакуловируса. Способы введения гетерологичной ДНК в желаемый сайт в бакуловирусном вирусе являются известными в данной области (См. Summers and Smith supra; Ju et al. (1987); Smith et al., Mol. Cell. Biol. (1983) 3:2156; и Luckow and Summers (1989)). Например, встраивание может происходить в ген, например, ген полиэдрина, гомологичной рекомбинацией с двойным кроссинговером; встраивание может происходить также в сайт рестрикционного фермента, сконструированного в желательном бакуловирусном гене. Miller et al., (1989), Bioessays 4:91. ДНК-последовательность при клонировании вместо гена полиэдрина в данном экспрессирующем векторе фланкирована как 5', так и 3'полиэдрин-специфическими последовательностями и расположена правее от промотора полиэдрина.

Новообразованный бакуловирусный экспрессирующий вектор упаковывают затем в инфекционный рекомбинантный бакуловирус. Гомологичная рекомбинация происходит при низкой частоте (между приблизительно 1% и приблизительно 5%); таким образом, большая часть данного вируса, продуцируемого после котрансфекции, все еще является вирусом дикого типа. Таким образом, требуется способ для идентификации рекомбинантных вирусов. Преимуществом данной экспрессирующей системы является визуальный скрининг, позволяющий отличать рекомбинантные вирусы. Белок полиэдрин, который продуцируется нативным вирусом, продуцируется чрезвычайно высокопродуктивно в ядрах инфицированных клеток в поздние периоды после вирусной инфекции. Накопленный белок полиэдрин образует внутриклеточные тельца включения, которые содержат заключенные в них частицы. Тельца включения размером до 15 мкм сильно преломляют свет, что придает им яркий блестящий вид, который легко визуализировать под световом микроскопом. Клетки, инфицированные рекомбинантным вирусом, не содержат телец включения. Чтобы отличить рекомбинантный вирус от вируса дикого типа, супернатант после трансфекции помещают для образования бляшек на монослой клеток насекомых способами, известными специалистам в данной области. А именно, бляшки подвергают скринингу под световым микроскопом на присутствие телец включения (являющееся признаком вируса дикого типа) или отсутствие телец включения (являющееся признаком рекомбинантного вируса). "Current Protocols in Microbiology" Vol.2 (Ausubel et al. eds) d 16.8 (Supp. 10, 1990); Summers and Smith, supra; Miller et al. (1989).

Были разработаны рекомбинантные бакуловирусные экспрессирующие векторы для инфицирования нескольких клеточных линий насекомых. Например, были сконструированы рекомбинантные бакуловирусы для, inter alia: Aedes aegypti, Autographa californica, Bombyx mori, Drosophila melanogaster, Spodoptera frugiperda и Trichoplusia ni (WO 89/046699; Carbonell et al., (1985) J. Virol. 56:153; Wright (1986) Nature 321:718; Smith et al., (1983) Mol. Cell. Biol. 3:2156 и см. в общем, Fraser, et al. (1989) In Vitro Cell. Dev. Biol. 25:225).

Клетки и среды для культивирования клеток являются комимерчески доступными как для прямой, так и для слитой экспрессии гетерологичных полипептидов в бакуловирусной системе экспрессии; технология культуры клеток обычно известна среднему специалисту в данной области. См., например. Summers and Smith supra.

Затем модифицированные клетки насекомых могут быть выращены в подходящей питательной среде, которая делает возможной стабильное сохранение плазмиды (плазмид), присутствующих в модифицированном насекомом-хозяине. Если ген продукта экспрессии находится под индуцируемым контролем, хозяин может быть выращен до высокой плотности и экспрессия может быть индуцирована. Альтернативно, если экспрессия является конститутивной, продукт будет непрерывно экспрессироваться в среду и питательная среда должна непрерывно циркулировать при удалении представляющего интерес продукта и увеличении истощаемых питательных веществ. Данный продукт может быть очищен такими способами, как хроматография, например ВЭЖХ, аффинная хроматография, ионообменная хроматография и т.д.; электрофорез; центрифугирование в градиенте плотности; экстракция растворителями или т.п. Соответствующим образом продукт может быть дополнительно очищен, если требуется, для удаления по существу любых белков насекомых, которые также секретируются в среду или возникают вследствие лизиса клеток насекомых, чтобы обеспечить продукт, который является по меньшей мере по существу не содержащим дебриса хозяина, например белков, липидов и полисахаридов.

Для получения экспрессии белка рекомбинантные клетки-хозяева, полученные из трансформантов, инкубируют в условиях, которые делают возможной экспрессию кодирующей последовательности рекомбинантного белка. Условия будут варьироваться в зависимости от выбранной клетки-хозяина. Однако данные условия могут быть легко определены средним специалистом в данной области на основе того, что известно в данной области.

iii. Растительные системы

Существуют многочисленные системы экспрессии генов, использующие культуры растительных клеток и целые растения. Примеры систем экспрессии генов растительными клетками включают системы, описанные в таких патентах, как патент США 5693506; патент США 5659122 и патент США 5608143. Дополнительные примеры экспрессии генов в культуре клеток растений были описаны Zenk, Phytochemistry 30:3861-3863 (1991). Описания сигнальных пептидов белков растений могут быть найдены, кроме описанных выше ссылок, у Vaulcombe et al., Mol. Gen. Genet. 209:33-40 (1987); Chandler et al.. Plant Molecular Biology 3:407-418 (1984); Rogers, J. Biol. Chem. 260:3731-3738 (1985); Rothstein et al.. Gene 55:353-356 (1087); Whittier et al., Nucleic Acids Research 15:2515-2535 (1987); Wirsel et al., Molecular Microbiology 3:3-14 (1989); Yu et al., Gene 122:247-253 (1992). Описание регуляции экспрессии генов растений фитогормоном, гибберелловой кислотой и секретируемыми ферментами, индуцируемыми гибберелловой кислотой, может быть найдено у R.L.Jones and J.MacMiilin, Gibberellins: в: Advanced Plant Physiology, Malcolm B.Wilkins, ed., 1984 Pitman Publishing Limited, London, pp. 21-52. Ссылки, которые описывают другие метаболически регулируемые гены: Sheen, Plant Cell, 2:1027-1038 (1990); Maas et al., EMBO J. 9:3447-3452 (1990); Benkel and Hickey, Proc. Natl. Acad. Sci. 84:1337-1339 (1987).

Обычно с использованием способов, известных в данной области, желаемую полинуклеотидную последовательность встраивают в экспрессируюшую кассету, содержащую генетические регуляторные элементы, сконструированные для функционирования в растениях. Данную экспрессирующую кассету встраивают в желательный экспрессирующий вектор с сопутствующими последовательностями левее и правее от экспрессирующей кассеты, подходящими для экспрессии в растении-хозяине. Сопутствующие последовательности имеют плазмидное или вирусное происхождение и обеспечивают необходимые свойства для вектора, чтобы данные векторы перемещали ДНК из первоначального клонирующего хозяина, такого как бактерии, в желательного хозяина-растение. Конструкция исходного бактериального/растительного вектора предпочтительно будет предусматривать прокариотический сайт инициации репликации широкого круга хозяев; прокариотический селектируемый маркер и для трансформации с использованием Agrobacterium Т-ДНК-последовательности для опосредованного Agrobacterium переноса в хромосомы растений. Если гетерологичный ген не поддается простому определению, данная конструкция будет предпочтительно содержать также ген селектируемого маркера, подходящий для установления трансформации клетки растения. Общий обзор подходящих маркеров, например, для видов семейства злаковых, может быть найден у Wilmink and Dons, 1993, Plant Mol. Biol. Reptr, 11(2):165-185.

Также рекомендуются последовательности, полезные для обеспечения интеграции гетерологичной последовательности в геном растений. Они могут включать транспозонные последовательности и тому подобные последовательности для гомологичной рекомбинации, а также Ti-последовательности, которые делают возможной случайное встраивание гетерологичной экспрессирующей кассеты в геном растения. Подходящие прокариотические селектируемые маркеры включают гены устойчивости к антибиотикам, таким как ампициллин и тетрациклин. Другие последовательности ДНК, кодирующие дополнительные функции, могут также присутствовать в данном векторе, как известно в данной области.

Молекулы нуклеиновых кислот данного изобретения могут быть включены в экспрессирующую кассету для экспрессии представляющего интерес белка (белков). Обычно это будет только одна экспрессирующая кассета, хотя возможны и две или большее количество экспрессирующих кассет. Рекомбинантная экспрессирующая кассета будет содержать кроме кодирующей последовательности гетерологичного белка следующие элементы: промоторную область, 5'-нетранслируемые последовательности растений, инициирующий кодон при наличии такового в данном структурном гене и последовательность терминации транскрипции и трансляции. Уникальные сайты ферментативной рестрикции на 5'- и 3'-концах данной кассеты делают возможным легкое встраивание в исходный вектор.

Гетерологичная последовательность может кодировать любой белок, относящийся к данному изобретению. Последовательность, кодирующая представляющий интерес белок, будет кодировать сигнальный пептид, который делает возможными процессинг и транслокацию данного белка при необходимости и обычно не будет содержать какой-либо последовательности, которая может приводить к связыванию желательного белка данного изобретения с мембраной. Поскольку в большинстве случаев область инициации транскрипции будет областью для гена, который экспрессируется и транслоцируется во время прорастания, посредством использования сигнального пептида, который относится к транслокации, можно также обеспечить транслокацию представляющего интерес белка. Таким путем представляющий интерес белок (белки) будут перемещаться из клеток, в которых они экспрессируются, и могут быть эффективно собраны. Обычно секреция в семенах происходит через алейроновый или щитковый слой в эндосперм семени. Хотя и не является обязательным, чтобы белок секретировался из клеток, в которых данный белок продуцируется, что облегчает выделение и очистку рекомбинантного белка.

Поскольку конечная экспрессия желательного генного продукта будет происходить в эукариотической клетке, желательно определить, содержит ли какая-либо часть клонированного гена последовательности, которые будут процессированы из последовательности в виде интронов аппаратом сплайсингосом хозяина. Если это так, может быть проведен сайт-направленный мутагенез “интронной” области для предотвращения потери части генетической матрицы в виде ложного интронного кода. Reed and Maniatis, Cell 41:95-105, 1985.

Данный вектор может быть введен микроинъекцией непосредственно в клетки растений с использованием микропипеток для механического переноса рекомбинантной ДНК, Crossway, Mol. Gen. Genet, 202:179-185, 1985. Генетический материал может быть также перенесен в клетку растения с использованием полиэтиленгликоля, Krens, et al., Nature, 296, 72-74, 1982. Другим способом введения сегментов нуклеиновых кислот является баллистическое введение малых частиц с нуклеиновой кислотой на высокой скорости либо в матриксе небольших гранул или частиц, либо на их поверхности, Klein, et al.. Nature, 327, 70-73, 1987 и Knudsen and Muller, 1991, Planta, 185:330-336, описывающие бомбардировку частицами эндоспрема ячменя для получения трансгенного ячменя. Еще одним способом введения является слияние протопластов с другими организмами или с мицеллами, клетками, лизосомами или другими сливаемыми имеющими липидную поверхность тельцами, Fraley, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 1859-1863, 1982.

Вектор может быть также введен в клетки растений электропорацией (Fromm et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:5824, 1985). В этом способе протопласты растений подвергают электропорации в присутствии плазмид, содержащих генную конструкцию. Электрические импульсы поля высокой напряженности обратимо делают мембрану проницаемой, делая возможным введение плазмид. Электропорированные растительные протопласты повторно образуют клеточную стенку, делятся и образуют растительный каллус.

Все растения, протопласты из которых могут быть выделены и культивированы с образованием целых регенерированных растений, могут быть трансформированы посредством данного изобретения таким образом, что получают целые растения, которые содержат перенесенный ген. Известно, что практически все растения могут быть регенерированы из культивируемых клеток или тканей, в том числе, но не только, основных видов сахарного тростника, сахарной свеклы, хлопчатника, плодовых и других деревьев, бобовых и овощей. Некоторые подходящие растения включают, например, виды из родов Fragaria, Lotus, Medicago, Onobrychis, Thifolium,

Trigonella, Vigna, Citrus, Linum, Geranium, Manihot, Daucus, Arabidopsis, Brassica, Raphanus, Sinapis, Atropa, Capsicum, Datura, Hyoscyamus, Lycopersicon, Nicotiana, Solanum, Petunia, Digitalis, Majorana, Cichorium, Helianthus, Lactuca, Bromus, Asparagus, Antirrhinum, Hererocallis, Nemesia, Pelargonium, Panicum, Pennisetum, Ranunculus, Senecio, Salpiglossis, Cucumis, Browaalia, Glycine, Lolium, Zea, Triticum, Sorghum и Datura.

Средства для регенерации варьируются от вида к виду растений, но обычно получают сначала суспензию трансформированных протопластов, содержащих копии гетерологичного гена. Образуют каллусную ткань и побеги могут быть индуцированы из каллуса и затем укоренены. Альтернативно, из суспензии протопластов может быть индуцировано образование зародышей. Эти зародыши прорастают, как природные зародыши, с образованием растений. Культуральные среды обычно содержат различные аминокислоты и гормоны, такие как ауксин и цитокинины. Предпочтительно также добавлять к среде глутаминовую кислоту и пролин, особенно для таких видов, как кукуруза и люцерна. Побеги и корни обычно развиваются одновременно. Эффективная регенерация будет зависеть от среды, генотипа и истории культуры. Если данные три переменных контролируются, то регенерация является вполне воспроизводимой и повторяемой.

В некоторых системах культуры клеток растений желаемый белок данного изобретения может экскретироваться, или альтернативно, этот белок может быть экстрагирован из целого растения. Если желаемый белок данного изобретения секретируется в среду, он может быть собран. Альтернативно, зародыши и не содержащие зародышей половинки семян или другая ткань растения может быть механически измельчена для высвобождения любого секретируемого белка между клетками и тканями. Данная смесь может быть суспендирована в буферном растворе для извлечения растворимых белков. Затем могут быть использованы общепринятые способы выделения и очистки, применяемые для очистки рекомбинантного белка. Параметры времени, температуры, рН, кислорода и объемов должны корректироваться посредством рутинных способов для оптимизации экспрессии и выделения гетерологичного белка.

iv. Бактериальные системы

Бактериальные способы экспрессии известны в данной области. Бактериальный промотор является любой последовательностью ДНК, способной связывать бактериальную РНК-полимераэу и инициировать транскрипцию в направлении 3' кодирующей последовательности (например, структурного гена) в мРНК. Промотор будет иметь область инициации транскрипции, которая обычно расположена проксимально к 5'-концу кодирующей последовательности. Эта область инициации транскрипции обычно включает в себя сайт связывания РНК-полимеразы и сайт инициации транскрипции. Бактериальный промотор может также иметь второй домен, называемый оператором, который может перекрываться с сайтом связывания РНК-полимеразы, в котором начинается синтез РНК. Оператор делает возможной негативно регулируемую (индуцируемую) транскрипцию, когда репрессорный белок гена может связывать оператор, и тем самым ингибировать транскрипцию конкретного гена. Конститутивная экспрессия может происходить в отсутствие негативных регуляторных элементов, таких как оператор. Кроме того, позитивная регуляция может быть достигнута связывающей активаторный белок последовательностью гена, которая, если она присутствует, находится обычно проксимально (5') к последовательности, связывающей РНК-полимеразу. Примером активаторного белка гена является катаболитный активаторный белок (CAP), который помогает инициировать транскрипцию lac оперона у Escherichia coli (E. coli) [Raibaud et al. (1984) Annu. Rev. Genet. 18:173]. Таким образом, регулируемая экспрессия может быть либо позитивной, либо негативной, тем самым либо усиливающей, либо уменьшающей транскрипцию.

Последовательности, кодирующие ферменты метаболического пути, обеспечивают особенно применимые промоторные последовательности. Примеры включают промоторные последовательности, происходящие из ферментов, метаболизирующих сахара, такие как галактоза, лактоза (lac) [Chang et al. (1977) Nature 198:1056] и мальтоза. Дополнительные примеры включают промоторные последовательности, происходящие из биосинтетических ферментов, таких как триптофан (trp) [Goeddel et al. (1980) Nuc. Acids Res. 8:4057; Yelverton et al. (1981) Nucl. Acids Res. 9:731; Патент США 4738921; ЕР-А-0036776 и ЕР-А-0121775]. Промоторная система g-лаотамазы (bla) [Weissmann (1981) "The cloning of interferon and other mistakes," In Interferon 3 (ed. I.Gresser)], промоторные системы бактериофага лямбда PL [Shimatake et al. (1981) Nature 292:128] и Т5 [Патент США 4689406] также обеспечивают применимые промоторные последовательности.

Кроме того, синтетические промоторы, которые не встречаются в природе, также функционируют в качестве бактериальных промоторов. Например, последовательности активации транскрипции одного бактериального промотора или промотора бактериофага могут быть соединены с последовательностями оперона другого бактериального промотора или промотора бактериофага с образованием синтетического гибридного промотора [Патент США 4551433]. Например, промотор tac является гибридным промотором trp-lac, состоящим из последовательностей как промотора trp, так и оперона lac, который регулируется репрессором lac [Amann et al. (1983) Gene 25:167; De Boer et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. 80:21]. Кроме того, бактериальный промотор может включать природные промоторы небактериального происхождения, которые способны связывать бактериальную РНК-полимеразу и инициировать транскрипцию. Природный промотор небактериального происхождения может быть также сопряжен с совместимой РНК-полимеразой для продуцирования высоких уровней экспрессии некоторых генов в прокариотах. Система РНК-полимераза бактериофага Т7/промотор является примером сопряженной промоторной системы [Studier et al. (1986) J. Mol. Biol. 189:113; Tabor et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. 82:1074]. Кроме того, гибридный промотор может также состоять из промотора бактериофага и операторной области Е. coli (ЕР-А-0267851). Кроме функционирующей промоторной последовательности эффективный сайт связывания рибосом также применим для экспрессии чужеродных генов в прокариотах. В Е. coli сайт связывания рибосом называется последовательностью Шайна-Далгарно (3D) и он включает в себя инициирующий кодон (ATG) и последовательность длиной 3-9 нуклеотидов, расположенную на 3-11 нуклеотида левее от инициирующего кодона [Shine et al. (1975) Nature 254:34]. Считают, что последовательность 3D стимулирует связывание мРНК с рибосомой посредством спаривания оснований между последовательностью 3D и 3'-концом рРНК 163 Е. coli [Steitz et al. (1979) "Genetic signals and nucleotide sequences in messenger RNA." In Biological Regulation and. Development: Gene Expression (ed. R.F. Goldberger)] для экспрессии эукариотических генов и прокариотических генов со слабым сайтом связывания рибосом [Sambrook et al. (1989) "Expression of cloned genes in Escherichia coli. In Molecular Cloning: A Laboratory Manual].

Молекула ДНК может экспрессироваться внутриклеточно. Промоторная последовательность может быть непосредственно связана с молекулой ДНК, и в этом случае первой аминокислотой на N-конце будет всегда метионин, который кодируется стартовым кодоном ATG. Если желательно, метионин на N-конце может быть отщеплен от белка инкубированием in vitro цианогенбромидом или инкубированием in vivo или in vitro с бактериальной метионин-N-концевой пептидазой (ЕРО-А-0 219237).

Слитые белки обеспечивают альтернативу прямой экспрессии. Обычно последовательность ДНК, кодирующую N-концевую часть эндогенного бактериального белка или другого стабильного белка, сливают с 5'-концом гетерологичных кодирующих последовательностей. Например, ген клетки бактериофага лямбда может быть присоединен на 5'-конце чужеродного гена и экспрессирован в бактериях. Полученный слитый белок предпочтительно сохраняет сайт для процессирующего фермента (фактора X) для отщепления белка бактериофага от чужеродного гена [Nagai et al. (1984) Nature 309:810]. Слитые белки могут быть также получены с последовательностями из генов lacZ [Jia et al. (1987) Gene 60:197], trpE [Alien et al. (1987) J. Biotechnol. 5:93; Makoff et al. (1989) J. Gen. Micribiol. 135:11] и Chey [EP-A-0 324 647]. Данная последовательность ДНК в месте соединения данных двух аминокислотных последовательностей может кодировать или может не кодировать сайт расщепления. Другим примером является слитый белок убиквитина. Такой слитый белок получают с областью убиквитина, который предпочтительно сохраняет сайт для процессирующего фермента (например, убиквитин-специфической процессирующей протеазы) для отщепления убиквитина от чужеродного белка. Посредством этого способа может быть выделен чужеродный белок [Miller et al. (1989) Bio/Technology 7:698].

Альтернативно, чужеродные белки могут также секретироваться из клетки посредством создания химерных молекул ДНК, которые кодируют слитый белок, состоящий из фрагмента последовательности сигнального пептида, который относится к секреции чужеродного белка в бактериях [Патент США 4336336]. Фрагмент сигнальной последовательности обычно кодирует сигнальный пептид, состоящий из гидрофобных аминокислот, которые управляют секрецией данного белка из данной клетки. Данный белок может секретироваться либо в среду для выращивания (грамположительные бактерии), либо в периплазматическое пространство, расположенное между внутренней и наружной мембранами клетки (грамотрицательные бактерии). Предпочтительно, имеются сайты процессинга, которые могут расщепляться либо in vivo, либо in vitro, кодируемые между фрагментом сигнального пептида и чужеродным геном.

ДНК, кодирующая подходящие сигнальные последовательности, может быть получена из генов для секретируемых бактериальных белков, таких как ген белка наружной мембраны Е. coli (ompA) [Masui et al. (1982), в: Experimental Manipulation of Gene Expression; Ghrayeb et al. (1984) EMBO J. 3:2437] и ген сигнальной последовательности щелочной фосфатазы Е. coli (phoA) [Oka et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. 82:7212]. В качестве дополнительного примера, сигнальная последовательность гена альфа-амилазы из различных штаммов Bacillus может быть использована для секреции гетерологичных белков из В. subtilis [Palva et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:5582; EP-A-0244042].

Обычно последовательности терминации транскрипции, распознаваемые бактериями, являются регуляторными областями, расположенными 3' относительно стоп-кодона трансляции и, следовательно, вместе с промотором фланкируют данную кодирующую последовательность. Эти последовательности управляют транскрипцией мРНК, которая может быть транслирована в полипептид, кодируемый данной ДНК.

Последовательности терминации транскрипции часто включают последовательности ДНК из приблизительно 50 нуклеотидов, способные образовывать структуры петли со стеблем, которые способствуют терминации транскрипции. Примеры включают последовательности терминации транскрипции из генов с сильными промоторами, таких как ген trp в Е. coii, а также другие биосинтетические гены.

Обычно описанные выше компоненты, содержащие промотор, сигнальную последовательность (если желательно), представляющую интерес кодирующую последовательность и последовательность терминации транскрипции помещают вместе в экспрессирующие конструкции. Экспрессирующие конструкции часто поддерживают в репликоне, например, внехромосомном элементе (например, плазмидах), способном стабильно сохраняться в хозяине, таком как бактерии. Репликон имеет систему репликации, позволяющую ему сохраняться в прокариотическом хозяине для экспрессии или клонирования и амплификации. Кроме того, репликон может быть высоко- или низкопродуктивной плазмидой. Высокопродуктивная плазмида обычно будет иметь число копий в диапазоне между приблизительно 5 и приблизительно 200 и обычно приблизительно 10 - приблизительно 150. Хозяин, содержащий высокопродуктивную плазмиду, будет предпочтительно содержать по меньшей мере приблизительно 10 и более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 20 плазмид. Может быть выбран либо высокопродуктивный вектор, либо низкопродуктивный в зависимости от действия вектора и чужеродного белка на хозяина.

Альтернативно, экспрессирующие конструкции могут быть интегрированы в бактериальный геном интегрирующим вектором. Интегрирующие векторы обычно содержат по меньшей мере одну последовательность, гомологичную бактериальной хромосоме, что позволяет данному вектору интегрироваться. Интеграция, по-видимому, происходит вследствие рекомбинаций между гомологичными ДНК в векторе и бактериальной хромосоме. Например, интегрирующие векторы, сконструированные с ДНК из различных штаммов Bacillus, интегрируются в хромосому Bacillus (ЕР-А-0 127 328). Интегрирующие векторы могут состоять также из последовательности бактериофага или транспозона.

Обычно внехромосомные и интегрирующие экспрессирующие конструкции могут содержать селектируемые маркеры для отбора бактериальных штаммов, которые были трансформированы. Селектируемые маркеры могут экспрессироваться в бактериальном хозяине и могут включать гены, которые делают бактерии устойчивыми к лекарственным средствам, таким как ампициллин, хлорамфеникол, эритромицин, канамицин (неомицин) и тетрациклин [Davies et al. (1978) Annu. Rev. Microbiol. 32:469]. Селектируемые маркеры могут также включать биосинтетические гены, такие как гены в путях биосинтеза гистидина, триптофана и лейцина.

Альтернативно, некоторые из описанных выше компонентов могут быть помещены вместе в трансформирующих векторах. Трансформирующие векторы обычно состоят из селектируемого маркера, который либо поддерживается в репликоне, либо разрабатывается в интегрирующий вектор, как описано выше.

Экспрессирующие и трансформирующие векторы, либо внехромосомные репликоны, либо интегрирующие векторы, были разработаны для трансформации во многие бактерии. Например, экспрессирующие векторы были сконструированы для, inter alia, следующих бактерий: Bacillus subtilis [Palva et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:5582; EP-A-0036259 и ЕР-А-0063953; WO 94/04541], Escherichia coli [Shimatake et al. (1981) Nature 292:128; Amann et al. (1985) Gene 40:183; Studier et al. (1986) J. Mol. Biol. 189:113; EP-A-0036776, EP-A-0136829 и ЕР-А-0136907], Streptococcus cremoris [Powell et al. (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54:655]; Streptococcus lividans [Powell et al. (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54:655]; Streptococcus lividans [Патент США 4745056].

Способы введения экзогенной ДНК в бактериальных хозяев хорошо известны в данной области и обычно включают трансформацию бактерий, обработанных СаСl₂ или другими агентами, такими как двухвалентные катионы и ДМСО. ДНК может быть также введена в бактериальные клетки электропорацией. Процедуры трансформации обычно варьируются в зависимости от трансформируемого вида. См., например, [Masson et ai. (1989) FEMS Microbiol. Lett. 60:273; Palva et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:5582; EP-A-0036 259 и EP-A-0063953; WO 94/04551, Bacillus], [Miller et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:856; Wang et al. (1990) J. Bacteriol. 172:940, Campylobacter], [Cohen et al., (1973) Proc. Natl. Acad. Sci. 69:2110; Dower et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:6127; Kushner (1978) "An imprived method for transformation of Escherichia coli with ColE1-derived plasmids. В Genetic Engineering: Proceedings of the International Symposium on Genetic Engineering (eds. H.W. Boyer and S. Nicosia); Mandel et ai. (1970) J. Mol. Biol. 53:159; Taketo (1988) Biochim. Biophys. Acta 949:318; Escherichia], [Chassy et al. (1987) FEMS Microbiol. Lett. 44:173, Lactobacillus]; [Fiedler et al. (1988) Anal. Biochem. 170:38, Pseudomonas]; [Augustin et al. (1990) FEMS Microbiol. Lett. 66:203, Staphylococcus], [Barany et al. (1980) J. Bacteriol. 144:698; Harlander (1987) "Transformation of Streptococcus lactis by electroporation, в: Streptococcal Genetics (ed. J. Ferretti and R. Curtiss III); Perry et al. (1981) Infect. Immun. 32:1295; Powell et ai. (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54:655; Somkuti et al. (1987) Proc. 4^th Evr. Cong. Biotechnology 1:412, Streptococcus].

v. Экспрессия в дрожжах

Дрожжевые экспрессирующие системы также хорошо известны среднему специалисту в данной области. Дрожжевым промотором является любая последовательность ДНК, способная связывать дрожжевую РНК-полимеразу и инициировать транскрипцию в направлении 3' кодирующей последовательности (например, структурного гена) в мРНК. Промотор будет иметь область инициации транскрипции, которая обычно расположена проксимально к 5'-концу кодирующей последовательности. Эта область инициации транскрипции обычно включает в себя сайт связывания РНК-полимеразы ("ТАТА-бокс") и сайт инициации транскрипции. Дрожжевой промотор может также иметь второй домен, называемый расположенной левее активаторной последовательностью (UAS), который, если он присутствует, обычно находится дистально относительно структурного гена. UAS делает возможной регулируемую (индуцируемую) экспрессию. Конститутивная экспрессия происходит в отсутствие UAS. Регулируемая экспрессия может быть либо позитивной, либо негативной, тем самым либо усиливающей, либо уменьшающей транскрипцию.

Дрожжи представляют собой организм с активным метаболическим путем, таким образом, последовательности, кодирующие ферменты в данном метаболическом пути, обеспечивают особенно ценные промоторные последовательности. Примеры включают алкогольдегидрогеназу (ADH) (ЕР-А-0284044), глюкозо-6-фосфатизомеразу, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу (GAP или GAPDH), енолазу, глюкокиназу, гексокиназу, фосфофруктокиназу, 3-фосфоглицератмутазу и пируваткиназу (РуК) (ЕР-А-0329203). Ген РНO5, кодирующий кислую фосфатазу, также относится к ценным промоторным последовательностям [Myanohara et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:1].

Кроме того, синтетические промоторы, которые не встречаются в природе, также функционируют в качестве дрожжевых промоторов. Например, последовательности UAS одного дрожжевого промотора могут быть соединены с областью активации транскрипции другого дрожжевого промотора с образованием синтетического гибридного промотора.. Примеры таких гибридных промоторов включают регуляторную последовательность ADH, присоединенную к области активации транскрипции GAP (Патенты США №4876197 и 4880734). Другие примеры гибридных промоторов включают промоторы, которые состоят из регуляторных последовательностей генов ADH2, GAL4, GAL10 или РНO5, объединенных с областью активации транскрипции гена гликолитического фермента, такого как GAP или РуК (ЕР-А-0164556). Кроме того, дрожжевой промотор может включать природные промоторы недрожжевого происхождения, которые способны связывать дрожжевую РНК-полимеразу и инициировать транскрипцию. Примеры таких промоторов включают, inter alia, промоторы, описанные [Cohen et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:1078; Henikoff et al. (1981) Nature 283:835; Hollenberg et al. (1981) Curr. Topics Microbiol. Immunol. 96:119; Hollenberg et al. (1979) "The Expression of Bacterial Antibiotic Resistance Genes in the Yeast Saccharomyces cerevisiae," в: Plasmids of Medical, Environmental and Commercial Importance (eds. K.N. Timmis and A. Puhler); Mercerau-Puigalon et al. (1980) Gene 11:163; Panthier et al. (1980) Curr. Genet. 2:109].

Молекула ДНК может экспрессироваться внутриклеточно в дрожжах. Промоторная последовательность может быть непосредственно связана с молекулой ДНК, и в этом случае первой аминокислотой на N-конце рекомбинантного белка будет всегда метионин, который кодируется стартовым кодоном ATG. Если желательно, метионин на N-конце может быть отщеплен от белка инкубированием in vitro цианогенбромидом.

Слитые белки обеспечивают альтернативу экспрессирующимся системам дрожжей, а также системам млекопитающих, бакуловирусным и бактериальным экспрессирующимся системам. Обычно последовательность ДНК, кодирующую N-концевую часть эндогенного дрожжевого белка или другого стабильного белка, сливают с 5'-концом гетерологичных кодирующих последовательностей. При экспрессии эта конструкция будет обеспечивать слияние данных двух аминокислотных последовательностей. Например, ген супероксиддисмутазы (SOD) дрожжей или человека может быть присоединен на 5'-конце чужеродного гена и экспрессирован в дрожжах. Последовательность ДНК в месте соединения данных двух аминокислотных последовательностей может кодировать или может не кодировать сайт расщепления. См., например, ЕР-А-0196056. Другим примером является слитый белок убиквитина. Такой белок получают с областью убиквитина, который предпочтительно сохраняет сайт для процессирующего фермента (например, убиквитин-специфической процессирующей протеазы) для отщепления убиквитина от чужеродного белка. Посредством этого способа может быть выделен чужеродный белок (например, WO88/024066).

Альтернативно, чужеродные белки могут также секретироваться из клетки в среду для выращивания посредством создания химерных молекул ДНК, которые кодируют слитый белок, состоящий из фрагмента лидерной последовательности, который относится к секреции чужеродного белка в дрожжах. Предпочтительно имеются сайты процессинга, кодируемые между лидерным фрагментом и чужеродным геном, которые могут расщепляться in vivo или in vitro. Фрагмент лидерной последовательности обычно кодирует сигнальный пептид, состоящий из гидрофобных аминокислот, которые управляют секрецией данного белка из данной клетки.

ДНК, кодирующие подходящие сигнальные последовательности, могут быть получены из генов для секретируемых дрожжевых белков, таких как ген дрожжевой инвертазы (ЕР-А-0012873; JPO, 62096086) и ген А-фактора (Патент США 4588684). Альтернативно, существуют лидеры недрожжевого происхождения, такие как лидер интерферона, которые также обеспечивают секрецию в дрожжах (ЕР-А-0060057).

Предпочтительным классом лидеров секреции являются лидеры, которые используют ген альфа-фактора дрожжей, который содержит как “пре”-сигнальную последовательность, так и “про”-область. Типы фрагментов альфа-фактора, которые могут быть применены, включают полноразмерный пре-про-альфа-фактор (приблизительно 83 аминокислотных остатка), а также укороченные (процессированные) лидеры альфа-фактора (обычно приблизительно 25 - приблизительно 50 аминокислотных остатков) (Патенты США 4546083 и 4870008, ЕР-А-0324274). Дополнительные лидеры, использующие лидерный фрагмент альфа-фактора, который относится к секреции, включают гибридные лидеры альфа-фактора, изготовленные из пре-последовательности первых дрожжей, но про-области из альфа-фактора вторых дрожжей (например, см. WO 89/02463).

Обычно последовательности терминации транскрипции, распознаваемые дрожжами, являются регуляторными областями, расположенными 3' относительно стоп-кодона трансляции и, следовательно, вместе с промотором фланкируют данную кодирующую последовательность. Эти последовательности управляют транскрипцией мРНК, которая может быть транслирована в полипептид, кодируемый данной ДНК. Примерами последовательности терминации транскрипции и других распознаваемых дрожжами последовательностей терминации являются последовательности, кодирующие гликолитические ферменты.

Обычно описанные выше компоненты, содержащие промотор, лидер (если желательно), представляющую интерес кодирующую последовательность и последовательность терминации транскрипции, помещают вместе в экспрессирующие конструкции. Экспрессирующие конструкции часто поддерживают в репликоне, например, внехромосомном элементе (например, плазмидах), способном стабильно сохраняться в хозяине, таком как дрожжи или бактерии. Репликон может иметь две системы репликации, позволяющие ему сохраняться, например, в дрожжах для экспрессии и в прокариотическом хозяине для клонирования и амплификации. Примеры таких челночных векторов дрожжи-бактерии включают YEp24 [Botstein et al. (1979) Gene 8:17-24], pCl/1 [Brake et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:4642-4646] и YRpl7 [Stinchcomb et al. (1982) J. Mol. Biol. 158:157]. Кроме того, репликон может быть высоко- или низкопродуктивной плазмидой. Высокопродуктивная плазмида обычно будет иметь число копий в диапазоне между приблизительно 5 и приблизительно 200 и обычно приблизительно 10 - приблизительно 150. Хозяин, содержащий высокопродуктивную плазмиду, будет предпочтительно содержать по меньшей мере приблизительно 10 и более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 20 плазмид. Может быть выбран либо высокопродуктивный вектор, либо низкопродуктивный в зависимости от действия вектора и чужеродного белка на хозяина. См., например. Brake et al., supra.

Альтернативно, экспрессирующие конструкции могут быть интегрированы в дрожжевой геном интегрирующим вектором. Интегрирующие векторы обычно содержат по меньшей мере одну последовательность, гомологичную дрожжевой хромосоме, что позволяет данному вектору интегрироваться, и предпочтительно содержат две гомологичные последовательности, фланкирующие данную экспрессирующую конструкцию. Интеграция, по-видимому, происходит вследствие рекомбинаций между гомологичными ДНК в векторе и дрожжевой хромосоме [Orr-Weaver et al. (1983) Methods in Enzymol. 101:228-245]. Интегрирующий вектор может быть направлен в специфический локус в дрожжах посредством выбора подходящей гомологичной последовательности для включения в данный вектор. См. Orr-Weaver et al., supra. Одна или несколько экспрессирующих конструкций могут интегрироваться, возможно, влияя на уровни продуцируемого рекомбинантного белка [Rine et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:6750]. Хромосомные последовательности, включенные в данный вектор, могут встречаться либо в виде единственного сегмента в векторе, что приводит к интеграции целого вектора, либо в виде двух сегментов, гомологичных соседним сегментам в хромосоме и фланкирующим экспрессирующую конструкцию в векторе, что может приводить к стабильной интеграции только экспрессирующей конструкции.

Обычно внехромосомные и интегрирующие экспрессирующие конструкции могут содержать селектируемые маркеры для отбора дрожжевых штаммов, которые были трансформированы. Селектируемые маркеры могут включать биосинтетические гены, которые могут экспрессироваться в дрожжевом хозяине, такие как ADE2, HIS4, LEU2, TRP1, и ALG7 и ген устойчивости G418, который придает устойчивость в дрожжевых клетках к туникамицину и G418 соответственно. Кроме того, подходящий селектируемый маркер может также обеспечивать дрожжи способностью расти в присутствии токсичных соединений, таких как металл. Например, присутствие CUP1 позволяет дрожжам расти в присутствии ионов меди [Butt et al. (1987) Microbiol. Rev. 51:351].

Альтернативно, некоторые из описанных выше компонентов могут быть помещены вместе в трансформирующие векторы. Трансформирующие векторы обычно состоят из селектируемого маркера, который либо поддерживается в репликоне, либо разрабатывается в интегрирующий вектор, как описано выше.

Экспрессируюшие и трансформирующие векторы либо внехромосомные репликоны, либо интегрирующие векторы, были разработаны для трансформации во многие дрожжи. Например, экспрессирующие векторы были сконструированы для, inter alia, следующих дрожжей: Candida albicans [Kurtz, et al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6:142], Candida maltosa [Kunze, et al. (1985) J.Basic Microbiol. 25:141]. Hansenula polymorpha [Gleeson, et al. (1986) J. Gen. Microbiol. 132:3459; Roggenkamp et al. (1986) Mol. Gen. Genet. 202:302], Kluyveromyces fragilis [Das, et al. (1984) J.Bacterial. 158:1165], Kluyveromyces lactis [De Louvencourt et al. (1983) J. Bacterial. 154:737; Van den Berg et al. (1990) Bio/Technology 8:135], Pichia guillerimondii [Kunze et al. (1985) J.Basic Microbiol. 25:141], Pichia pastoris [Cregg, et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5:3376; Патент США No.4837148 и 4929555], Saccharomyces cerevisiae [Hinnen et al. (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1929; Ito et al. (1983) J.Bacteriol. 153:163], Schizosaccharomyces pombe [Beach и Nurse (1981) Nature 300:706], и Yarrowia lipolytica [Davidow, et al. (1985) Curr. Genet. 10:38047] Gaillardin, et al. (1985) Curr. Genet. 10:49].

Способы введения экзогенной ДНК в дрожжевые хозяева хорошо известны в данной области и обычно включают трансформацию либо сферопластов, либо интактных дрожжевых клеток, обработанных щелочными катионами. Процедуры трансформации обычно варьируются в зависимости от трансформируемых видов дрожжей. См., например, [Kurtz et al. (1986) Mol. Cell. Blol. 6:142; Kunze et al. (1985) J.Basic Microbiol. 25:141; Candida]; [Gleeson et al. (1986) J. Gen. Microbiol. 132:3459; Roggenkamp et al. (1986) No2. Gen. Genet. 202:302; Hansenula]; [Das et al. (1984) J.Bacterial. 158:1165; De Louvencourt et al. (1983) J. Bacteriol. 754:1165; Van den Berg et al. (1990) Bio/Technology 8:135; Kluyveromyces]; [Cregg et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5:3376; Kunze et al. (1985) J. Basic Microbiol. 25:141; Патент США Nos. 4837148 and 4929555; Pichia]; [Hinnen et al. (1978) Proc. Natl.Acad. Sci. USA 75; 1929; Ito et al. (1983) J. Bacteriol. 153-163 Saccharomyces]; [Beach и Nurse (1981) Nature 300:706; Schizosaccharomyces]; [Davidow et al. (1985) Curr. Genet. 10:39; Gaillardin et al. (1985) Curr. Genet. 10:49; Yarrowia].

Антитела

В применении здесь термин “антитело” относится к полипептиду или группе полипептидов, состоящих из по меньшей мере одного антигенсвязывающего (активного) центра. “Антигенсвязывающий сайт” представляет собой трехмерное связывающее пространство с формой внутренней поверхности и распределением заряда, комплементарными свойствам эпитопа антигена, что позволяет связывание данного антитела с данным антигеном. “Антитело” включает в себя, например, антитела позвоночных, гибридные антитела, химерные антитела, гуманизированные антитела, измененные антитела, одновалентные антитела, Fab-белки и антитела с единственным доменом.

Антитела против белков данного изобретения применимы для аффинной хроматографии, иммуноанализов и различения / идентификации менингококковых белков.

Антитела к белкам данного изобретения, как поликлональные, так и моноклональные, могут быть получены общепринятыми способами. Обычно белок используют сначала для иммунизации подходящего животного, предпочтительно мыши, крысы, кролика или козы. Кролики и козы являются предпочтительными для получения поликлональных сывороток вследствие получаемого объема сыворотки и доступности меченых антител против иммуноглобулинов кролика и козы. Иммунизацию обычно выполняют смешиванием или эмульгированием белка в солевом растворе, предпочтительно в адъюванте, таком как полный адъювант Фройнда, и инъекцией данной смеси или эмульсии парентерально (обычно подкожно или внутримышечно). Доза 50-200 мкг/инъекция является обычно достаточной. Иммунизацию обычно повторяют (бустер-иммунизация) спустя 2-6 недель посредством одной или нескольких инъекций данного белка в солевом растворе, предпочтительно с использованием неполного адъюванта Фройнда. Альтернативно можно генерировать антитела иммунизацией in vitro с использованием известных в данной области способов, что для целей данного изобретения считается эквивалентным иммунизации in vivo. Поликлональные антисыворотки получают отбором крови у иммунизированного животного в стеклянный или пластиковый резервуар, инкубированием крови при 25°С в течение одного часа с последующим инкубированием при 4°С в течение 2-18 часов. Сыворотку извлекают центрифугированием (например, при 1000 g в течение 10 минут). Из кроликов может быть получено 20-50 мл за один отбор крови.

Моноклональные антитела получают с использованием стандартного способа Kohler and Milstein [Nature (1975) 256:495-96] или его модификации. Обычно мышь или кролика иммунизируют, как описано выше. Однако другим, отличным от отбора крови у животного для экстракции сыворотки, является извлечение селезенки (и необязательно несколько больших лимфатических узлов) и диссоциирование ее на отдельные клетки. Если желательно, клетки селезенки могут быть подвергнуты скринингу (после удаления неспецифически прилипших клеток) нанесением клеточной суспензии в чашку или лунку, покрытую белковым антигеном. В-клетки, экспрессирующие мембраносвязанный иммуноглобулин, специфический для данного антигена, связываются с данной чашкой и не вымываются с остатком суспензии. Затем полученные В-клетки или все диссоциированные клетки селезенки индуцируют для слияния с миеломными клетками с получением гибридом и культивируют в селективной среде (например, среде с гипоксантином, аминоптерином, тимидином, “HAT”). Полученные гибридомы высевают с использованием лимитирующего разведения и анализируют на продуцирование антител, которые связываются специфически с иммунизирующим антигеном (и которые не связываются с посторонними антигенами). Затем отобранные mAb-секретирующие гибридомы культивируют либо in vitro (например, во флаконах для культуры ткани или в реакторах с полыми волокнами) или in vivo (в виде асцитов мышей).

Если желательно, антитела (поликлональные или моноклональные) могут быть помечены с использованием общепринятых способов. Подходящие метки включают флуорофоры, хромофоры, радиоактивные атомы (в частности, ³²P и ¹²⁵I), электроноплотные реагенты, ферменты и лиганды, имеющие партнеров специфического связывания. Ферменты обычно детектируют по их активности. Например, пероксидазу хрена обычно детектируют по ее способности превращать 3,3', 5,5'-тетраметилбензидин (ТМВ) в синий пигмент, количественно определяемый при помощи спектрофотометра. Термин "партнер специфического связывания" относится к белку, способному связывать молекулу лиганда с высокой специфичностью, как, например, в случае антигена и специфического для него моноклонального антитела. Другие партнеры специфического связывания включают биотин и авидин или стрептавидин, IgG и белок А и многочисленные пары рецептор-лиганд, известные в данной области. Должно быть понятно, что приведенное выше описание не предназначено для распределения различных меток по категориям на отличающиеся классы, так как одна и та же метка может служить меткой в нескольких различных режимах. Например, ¹²⁵I может служить в качестве радиоактивной метки или в качестве электроноплотного реагента. HRP может служить в качестве фермента или в качестве антигена для mAb. Далее, можно комбинировать различные метки для желаемого эффекта. Например, mAb и авидин также необходим для метки при практическом использовании данного изобретения: таким образом, один может метить mAb биотином и детектировать его присутствие авидином, меченным ¹²⁵I, или использовать mAb анти-авидином, меченным HRP. Другие перестановки и возможности будут вполне очевидными для среднего специалиста в данной области и рассматриваться как эквивалентные объему данного изобретения.

Фармацевтические композиции

Фармацевтические композиции могут содержать либо полипептиды, антитела, либо нуклеиновые кислоты данного изобретения. Фармацевтические композиции будут содержать терапевтически эффективное количество либо полипептидов, антител, либо полинуклеотидов заявляемого изобретения.

Термин "терапевтически эффективное количество" в применении здесь относится к количеству терапевтического агента, достаточного для лечения, ослабления или профилактики рассматриваемого заболевания или состояния или для выявления поддающегося обнаружению терапевтического или профилактического действия. Это действие может быть обнаружено, например, с использованием химических маркеров или уровней антигена. Терапевтические эффекты включают также ослабление физических симптомов, например понижение температуры тела. Точное эффективное количество для субъекта будет зависеть от размера и состояния здоровья субъекта, природы и степени тяжести состояния и терапевтических средств или комбинации терапевтических средств, выбранных для введения. Таким образом, не имеет смысла указывать заранее точное эффективное количество. Однако эффективное количество для конкретной ситуации может быть определено в ходе рутинных экспериментов и определяется лечащим врачом.

Для целей данного изобретения эффективная доза будет составлять от приблизительно 0,01 до 50 мг/кг или от 0,05 до приблизительно 10 мг/кг ДНК-конструкции для индивидуума, которому ее вводят.

Фармацевтическая композиция может также содержать фармацевтически приемлемый носитель. Термин "фармацевтически приемлемый носитель" относится к носителю для введения терапевтического агента, такого как антитела или полипептид, гены и другие терапевтические агенты. Этот термин относится к любому фармацевтическому носителю, который сам не индуцирует продуцирование антител, вредных для индивидуума, получающего данную композицию, и который может вводиться без чрезмерной токсичности. Подходящими носителями могут быть большие медленно метаболизирующиеся макромолекулы, такие как белки, полисахариды, полимолочные кислоты, полигликолевые кислоты, полимерные аминокислоты, сополимеры аминокислот и неактивные вирусные частицы. Такие носители хорошо известны среднему специалисту в данной области.

Могут быть использованы фармацевтически приемлемые соли, например соли минеральных кислот, такие как гидрохлориды, гидробромиды, фосфаты, сульфаты и т.п.; и соли органических кислот, такие как ацетаты, пропионаты, малонаты, бензоаты и т.п. Подробное обсуждение фармацевтически приемлемых наполнителей можно найти в Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co., N.J. 1991).

Фармацевтически приемлемые носители в терапевтических композициях могут содержать жидкости, такие как вода, солевой раствор, глицерин и этанол. Кроме того, в таких носителях могут присутствовать вспомогательные вещества, например увлажняющее средства или эмульгирующие агенты, буферные вещества и т.п. Обычно терапевтические композиции готовят в виде инъекционных растворов, либо в виде жидких растворов, либо в виде суспензий; могут быть также приготовлены твердые формы, пригодные для растворения или для суспендирования в жидких носителях перед инъекцией. В определение фармацевтически приемлемый носитель включены также липосомы.

Способы доставки

После приготовления, композиции данного изобретения могут быть непосредственно введены субъекту. Данными субъектами, подвергающимися лечению, могут быть животные; в частности человек.

Прямая доставка данных композиций обычно выполняется инъекцией, подкожной, внутрибрюшинной, внутривенной или внутримышечной, или доставкой в интерстициальное пространство ткани. Композиции могут быть также введены в очаг. Другие способы введения включают пероральное и легочное введение, суппозитории и трансдермальное, или чрескожное, введение (например, см. WO98/20734), иглы и генные пушки или гипоспреи. Схема введения доз может быть схемой применения лекарственного средства с одноразовой дозой или схемой применения лекарственного средства со множественными дозами.

Вакцины

Рассматриваемые в данном изобретении вакцины могут быть либо профилактическими (т.е. для предупрежедния инфекции), либо терапевтическими (т.е. для лечения заболевания после инфицирования).

Такие вакцины содержат иммунизирующий антиген (антигены), иммуноген (иммуногены), полипептид (полипептиды), белок (белки) или нуклеиновую кислоту, обычно в комбинации с “фармацевтически приемлемыми носителями”, которые включают любой носитель, который сам не индуцирует продуцирование антител, вредных для индивидуума, принимающего данную композицию. Подходящими носителями могут быть большие медленно метаболизирующиеся макромолекулы, такие как белки, полисахариды, полимолочные кислоты, полигликолевые кислоты, полимерные аминокислоты, сополимеры аминокислот, липидные агрегаты (такие как масляные капли или липосомы) и неактивные вирусные частицы. Такие носители хорошо известны среднему специалисту в данной области. Кроме того, эти носители могут функционировать как иммуностимулирующие агенты ("адъюванты"). Далее, антиген или иммуноген может быть конъюгирован с бактериальным токсоидом, таким как токсоид из дифтерийного, столбнячного, холерного, Н. pylori и др. патогенов.

Предпочтительные адъюванты для стимуляции эффективности композиции включают, но не ограничиваются ими: (1) соли алюминия (квасцы), такие как гидроксид алюминия, фосфат алюминия, сульфат алюминия и т.д.; (2) композиции эмульсии типа масло-в-воде (с другими специфическими иммуностимулирующими агентами, такими как мурамилпептиды (см. ниже) или компоненты бактериальной клеточной стенки, или без них), такие как, например, (a) MF59™ (WO 90/14837; Chapter 10 in Vaccine design: the subunit and adjuvant approach, eds. Powell and Newman, Plenum Press 1995), содержащий 5% сквален, 0,5% Твин 80 и 0,5% Span 85 (иногда содержащий различные количества МТР-РЕ (см. ниже), хотя и необязательно), приготовленный в виде субмикронных частиц при помощи микрофлюидизатора, такого как микрофлюидизатор Modell 110Y (Microfluidics, Newton, MA), (b) SAF, содержащий 10% сквалан, 0,4% Твин 80, 5% блокированный плуроником полимер L121 и thr-MDP (см. ниже), либо микрофлюидизированный в субмикронную эмульсию, либо перемешанный на вортексе для генерирования эмульсии частиц большего размера, и (с) система адъюванта Ribi™ (RAS), (Ribi Immunochem, Hamilton, MT), содержащая 3% сквален, 0,2% Твин 80 и один или несколько компонентов бактериальной клеточной стенки из группы, состоящей из монофосфориллипида A (MPL), трегалозодимиколата (ТDМ) и скелета клеточной стенки (CWS), предпочтительно MPL + CWS (Detox™); (3) могут быть использованы сапониновые адъюванты, такие как Стимулов™ (Cambridge Bioscience, Worcester, MA), или генерируемые из них частицы, такие как ISCOM (иммуностимулирующие комплексы); (4) полный адъювант Фройнда (CFA) и неполный адъювант Фройнда (IFA); (5) цитокины, такие как интерлейкины (например, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12 и т.д.), интерфероны (например, гамма-интерферон), макрофагальный колониестимулирующий фактор (M-CSF), фактор некроза опухолей (TNF) и т.д.; и (6) другие вещества, которые действуют как иммуностимулирующие агенты для усиления эффективности композиции. Предпочтительными являются квасцы и MF59™.

Указанные выше мурамилпептиды включают, но не ограничиваются ими, N-ацетилмурамил-L-треонил-D-изоглутамин (thr-MDP), N-ацетилмурамил-L-аланил-D-изоглутамин (nor-MDP), N-ацетилмурамил-L-аланил-D-изоглутаминил-L-аланин-2-(1’-2'-дипальмитоил-sn-глицеро-3-гидроксифосфорилокси)этиламин (МТР-РЕ) и т.д.

Иммуногенные композиции (например, иммунизирующий антиген/иммуноген/полипептид/белок/нуклеиновая кислота, фармацевтически приемлемый носитель и адъювант) обычно содержат разбавители, такие как вода, солевой раствор, глицерин, этанол и т.д. Кроме того, в таких носителях могут присутствовать вспомогательные вещества, например увлажняющее средства или эмульгирующие агенты, рН-буферящие вещества и т.п.

Обычно, терапевтические композиции готовят в виде инъекционных растворов, либо в виде жидких растворов, либо в виде суспензий; могут быть также приготовлены твердые формы, пригодные для растворения или для суспендирования в жидких носителях перед инъекцией. Препарат может быть также эмульгирован или инкапсулирован в липосомы для усиленного адъювантного эффекта, как обсуждалось выше при рассмотрении приемлемых носителей.

Иммуногенные композиции, применяемые в качестве вакцин, содержат иммунологически эффективное количество антигенного или иммуногенного полипептидов, а также любой другой из вышеуказанных компонентов по необходимости. Под "иммунологически эффективным количеством" подразумевают, что введение такого количества индивидууму в одноразовой дозе или в виде части дозы несколько раз является эффективным для лечения или профилактики. Это количество варьируется в зависимости от здоровья и физического состояния проходящего лечение индивидуума (например, примата не человека, примата и т.д.), способности иммунной системы индивидуума синтезировать антитела, степени желаемой защиты, состава вакцины, оценки лечащего врача медицинской ситуации и других имеющих отношение факторов. Ожидается, что это количество будет находиться в относительно широком диапазоне, который может быть определен рутинными испытаниями.

Иммуногенные композиции обычно вводят парентерально, например, инъекцией, либо подкожно, внутримышечно, либо трансдермально/чрескожно (например, WO98/20734). Другие композиции, пригодные для других способов введения, включают пероральные и легочные композиции, суппозитории и трансдермальные применения. Схема введения лекарственного средства может быть схемой введения с одноразовой дозой или схемой введения со множественными дозами. Вакцина может вводиться в сочетании с другими иммунорегуляторными агентами.

В качестве альтернативы вакцинам на основе белков, может быть использована ДНК-вакцинация [Robinson and Torres (1977) Seminars in Immunology 9:271-283; Donnelly et al. (1997) Annu Rev Immunol 15:617-648; см. здесь ниже].

Векторы доставки генов

Векторы генной терапии для доставки конструкций, включающих в себя кодирующую последовательность терапевтического агента данного изобретения, подлежащих доставке млекопитающему для экспрессии в данном млекопитающем, могут вводиться локально (местно) или системно. Эти конструкции могут использовать вирусные или невирусные подходы в схемах введения in vivo или ex vivo. Экспрессия такой кодирующей последовательности может быть индуцирована при помощи эндогенных промоторов млекопитающих или гетерологичных промоторов. Экспрессия кодирующей последовательности in vivo может быть конститутивной или регулируемой.

Данное изобретение включает в себя векторы доставки генов, способные экспрессировать рассматриваемые последовательности нуклеиновых кислот. Вектор доставки генов является предпочтительно вирусным вектором и, более предпочтительно, ретровирусным, аденовирусным вектором, вектором на основе аденоассоциированного вируса (AAV), вируса герпеса или на основе альфа-вируса. Вирусный вектор может быть выступающим в качестве вектора астровирусом, коронавирусом, ортомиксовирусом, паповавирусом, парамиксовирусом, парвовирусом, пикорнавирусом, поксвирусом или тогавирусом. См., в общем. Jolly (1994) Cancer Gene Therapy 1:51-64; Kimura (1994) Human Gene Therapy 5:845-852; Connelly (1995) Human Gene Therapy 6:185-193 и Kaplitt (1994) Nature Genetics 6:148-153.

Ретровирусные векторы хорошо известны в данной области, и ожидается, что любой ретровирусный вектор генной терапии является применимым в данном изобретении, в том числе ретровирусы типов В, С и D, ксенотропные ретровирусы (например, NZB-X1, NZB-X2 и NZB9-1 (см. O'Neiil (1985) J. Virol. 53:160), политропные ретровирусы, например, MCF и MCF-MLV (см. Kelly (1983) J. Virol. 45:291), спумавирусы и лентивирусы. См. RNA Tumor Viruses, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, 1985.

Части ретровирусного вектора для генной терапии могут происходить из различных ретровирусов. Например, LTR ретровектора могут происходить из вируса мышиной саркомы, сайт связывания тРНК из вируса саркомы Рауса, сигнал упаковки из вируса мышиного лейкоза и сайт инициации синтеза второй цепи из вируса птичьего лейкоза.

Эти рекомбинантные ретровирусные векторы могут быть использованы для генерирования компетентных в трансдукции частиц ретровирусного вектора посредством введения их в подходящие пакующие клеточные линии (см. патент США 5591624). Ретровирусные векторы могут быть сконструированы для сайт-специфической интеграции в ДНК клетки-хозяина посредством включения химерного фермента интегразы в ретровирусную частицу (см. WO96/37626). Предпочтительно рекомбинантный вирусный вектор является дефектным по репликации рекомбинантным вирусом.

Пакующие клеточные линии, пригодные для применения с описанными выше ретровирусными векторами, хорошо известны в данной области, их легко получить (см. WO95/30763 и WO92/05266), и они могут быть использованы для создания клеточных линий-продуцентов (также называемых векторными клеточными линиями или "VCL") для получения рекомбинантных векторных частиц. Предпочтительно, пакующие клеточные линии получают из исходных клеток человека (например, клеток НТ1080) или исходных клеток норки, что исключает инактивацию в сыворотке человека.

Предпочтительные ретровирусы для конструирования ретровирусных векторов для генной терапии включают вирус птичьего лейкоза, вирус бычьего лейкоза, вирус мышиного лейкоза, индуцирующий клеточный центр (фокус) инфекции вирус норки, вирус мышиной саркомы, вирус ретикулоэндотелиоза и вирус саркомы Рауса. Особенно предпочтительные вирусы мышиного лейкоза включают 4070А и 1504 (Hartley and Rowe (1976) J. Virol 19:19-25), Abelson (ATCC No. VR-999), Friend (ATCC No. VR-245), Graffi, Gross (ATCC No. VR-590), Kirsten,

Harvey вирус саркомы и Rauscher (ATCC No. VR-998) и вирус мышиного лейкоза Молони (ATCC No. VR-190). Такие ретровирусы могут быть получены из депозитариев или коллекций, таких как Американская Коллекция Типовых культур ("ATCC") в Rockville, Maryland, или выделены из известных источников с использованием обычных доступных способов.

Примеры известных ретровирусных векторов генной терапии, применимые в данном изобретении, включают векторы, описанные в патентных заявках GB2200651, ЕР0415731, ЕР0345242, ЕР0334301, WO89/02468; WO89/05349, WO89/09271, WO90/02806, WO90/07936, WO94/03622, WO93/25698, WO93/25234, WO93/11230, WO93/10218, WO91/02805, WO91/02825, WO95/07994, US 5219740, US 4405712, US 4861719, US 4980289, US 4777127, US 5591624. См. также Vile (1993) Cancer Res 53:3860-3864; Vile (1993) Cancer Res 53:962-967; Ram (1993) Cancer Res 53 (1993) 83-88; Takamiya (1992) J Neurosci Res 33:493-503; Baba (1993) J Neurosurg - 79:729-735; Mann (1983) Cel-Z 33:153; Cane (1984) Proc Naki Acad Sci 81:6349; и Miller (1990) Human Gene Therapy 1.

Аденовирусные векторы генной терапии человека также известны в данной области и применимы в данном изобретении. См., например, Berkner (1988) Biotechniques 6:616 и Rosenfeid (1991) Science 252:431 и WO93/07283, WO93/06223 и WO93/07282. Примеры известных аденовирусных векторов генной терапии, применимые в данном изобретении, включают векторы, которые описаны в цитируемых выше ссылках и в WO94/12649, WO93/03769, WO93/19191, WO94/28938, WO95/11984, WO94/28938, WO95/11984, WO/00655, WO95/27071, WO95/29993, WO95/34671, WO96/05320, WO94/08026, WO94/11506, WO93/06223, WO94/24299, WO95/14102, WO95/24297, WO95/02697, WO94/28152, WO94/24299, WO95/09241, WO95/25807, WO95/05835, WO94/18922 и WO95/09654. Альтернативно, может быть использовано введение ДНК, связанной с убитым аденовирусом, как описано у Curiel (1992) Hum. Gene Ther. 3:147-154. Векторы доставки генов данного изобретения включают также векторы на основе аденоассоциированного вируса (AAV). Основными и предпочтительными примерами таких векторов для применения в данном изобретении являются векторы на основе AAV-2, описанные у Srivastava, WO93/09239. Наиболее предпочтительные AAV-векторы содержат два инвертированных концевых повтора AAV, в которых нативные D-последовательности модифицированы заменой нуклеотидов, так что по меньшей мере 5 нативных нуклеотидов и вплоть до 18 нативных нуклеотидов, предпочтительно по меньшей мере 10 нативных нуклеотидов и вплоть до 18 нативных нуклеотидов, наиболее предпочтительно 10 нативных нуклеотидов сохраняются, а остальные нуклеотиды D-последовательности делегированы или заменены ненативными нуклеотидами. Нативные D-последовательности инвертированных концевых повторов AAV являются последовательностями из 20 последовательных нуклеотидов в каждом инвертированном концевом повторе AAV (т.е. имеется одна последовательность на каждом конце), которые не участвуют в образовании HP. Ненативный замененный нуклеотид может быть любым нуклеотидом, иным, чем нуклеотид, обнаруживаемый в нативной D-последовательности в том же положении. Другими примерами используемых векторов AAV являются pWP-19, pWN-1, оба из которых описаны у Nahreini (1993) Gene 124:257-262. Другим примером такого вектора AAV является psub201 (см. Samulski (1987) J. Virol. 61:3096). Следующим примером вектора AAV является двойной-D ITR-вектор. Конструирование двойного-D ITR-вектора описано в патенте США 5478745. Другими векторами являются векторы, описанные Carter в Патенте США 4797368 и Muzyczka в Патенте США 5139941, Chartejee в Патенте США 5474935 и Kotin WO94/288157. Еще одним примером вектора AAV, применимого в данном изобретении, является SSV9AFABTKneo, который содержит энхансер AFP и промотор альбумина и управляет экспрессией преимущественно в печени. Его структура и конструкция описаны у Su (1996) Human Gene Therapy 7:463-470. Дополнительные векторы AAV генной терапии описаны в патенте США 5354678, патенте США 5173414, патенте США 5139941 и патенте США 5252479.

Векторы генной терапии данного изобретения включают также герпес-векторы. Основными и предпочтительными примерами являются векторы на основе вируса простого герпеса, содержащие последовательность, кодирующую полипептид тимидинкиназы, такой как полипептиды, описанные в патенте США 5288641 и в патенте ЕР0176170 (Roizman). Следующие примеры векторов на основе вируса простого герпеса включают HFEM/ICP6-LacZ, описанный в WO95/04139 (Wistar Institute), pHSVlac, описанный у Geller (1988) Science 241:1667-1669 и в WO90/09441 и WO92/07945, HSV Us3::pgC-lacZ, описанный у Fink (1992) Human Gene Therapy 3:11-19 и HSV 7134, 2 RH 105 и GAL4, описанные в ЕР 0453242 (Breakefield.), и векторы, депонированные АТСС в виде номеров доступа АТСС VR-977 и АТСС VR-260. Рассматриваются также векторы генной терапии на основе альфа-вируса, которые могут быть применены в данном изобретении. Предпочтительными векторами на основе альфа-вируса являются векторы, являющиеся вирусами Синдбиса (возбудителями лихорадки Синдбис), тогавирусы, вирусы лесов Семлики (АТСС VR-67; АТСС VR-1247), вирус Миддельбурга (АТСС VR-370), вирус реки Росс (АТСС VR-373; АТСС VR-1246), вирус Венесуэльского лошадиного энцефалита (АТСС VR923); АТСС VR-1250; АТСС VR1249; АТСС VR-532) и вирусы, описанные в патентах США 5091309, 5217879 и WO92/10578. Более конкретно, применимыми являются векторы на основе альфа-вирусов, описанные в заявке США с регистрационным номером 08/405627, поданной 15 марта 1995 года, WO94/21792, WO92/10578, WO95/07994, патенте США 5091309 и патенте США 5217879. Такие альфа-вирусы могут быть получены из депозитариев или коллекций, таких как АТСС в Rockville, Maryland, или выделены из известных источников с использованием обычных доступных способов. Предпочтительно используют альфа-вирусы с пониженной токсичностью (см. USSN 08/679640).

Системы ДНК-векторов, такие как эукариотические слоистые экспрессирующие системы, также применимы для экспрессии нуклеиновых кислот данного изобретения. См. WO95/07994 в отношении подробного описания эукариотических слоистых экспрессирующих систем. Предпочтительно эукариотические слоистые экспрессирующие системы данного изобретения произведены из векторов на основе альфа-вируса и наиболее предпочтительно из векторов на основе вируса Синдбис.

Другие вирусные векторы для применения в данном изобретении включают векторы, произведенные из полиовируса, например, АТСС VR-58 и вирусов, описанных у Evans, Nature 339 (1989) 385 и Sabin (1973) J. Biol. Standardization 1:115; риновируса, например, АТСС VR-1110 и вирусов, описанных у Arnold (1990) J. Ceil Biochem L401; поксвирусов, таких как поксвирус канареек или вирус коровьей оспы, например, АТСС VR-111 и АТСС VR-2010 и вирусов, описанных у Fisher-Hoch (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. 86:317; Flexner (1989) Ann NY Acad Sci 569:86, Flexner (1990) Vaccine 8:17; в патенте США 4603112 и патенте США 4769330 и WO89/01973; вируса SV40, например, АТСС VR-305 и вирусов, описанных у Mulligan (1979) Nature 277:109 и Madzak (1992) J Gen Virol 73:1533; вируса гриппа, например, АТСС VR-797 и рекомбинантных вирусов гриппа, полученных с использованием способов обратной генетики, как описано в патенте США 5166057 и у Enami (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. 87:3802-3805; Enami and Palese (1991) J Virol 65:2711-2713 и Luytjes (1989) Cell 59:110, (см. также McMichael (1963) NEJ Med 309:13 и Yap (1978) Nature 273:238 и Nature (1979) 277:108); вируса иммунодефицита человека, как описано в ЕР-0386882 и у Buchschacher (1992) J. Virol. 66:2731; вируса кори, например, АТСС VR-67 и АТСС VR-1247 и вирусов, описанных в ЕР-0440219; вируса Aura, например, АТСС VR-368; вируса Bebaru, например, АТСС VR-600 и АТСС VR-1240; вируса Cabassou, например, например, АТСС VR-922; вируса Chikungunya, например АТСС VR-64 и АТСС VR-1241; вируса форта Morgan, например, АТСС VR-924; вируса Getah, например, АТСС VR-369 и АТСС VR-1243; вируса Kyzylagach, например, АТСС VR-927; вируса Мауаго, например, АТСС VR-66; вируса Mucambo, например, АТСС VR-580 и АТСС VR-1244; вируса Ndumu, например, АТСС VR-371; вируса Pixuna, например, АТСС VR-372 и АТСС VR-1245; вируса Tonate, например, АТСС VR-925; вируса Triniti, например, АТСС VR-469; вируса Una, например, АТСС VR-374; вируса Whataroa, например, АТСС VR-926; вируса Y-62-33, например, АТСС VR-375; вируса O'Nyong, Eastern encephalitis, например, АТСС VR-65 и АТСС VR-1242; вируса Weastern encephalitis, например, АТСС VR-70, АТСС VR-1251, АТСС VR-622 и АТСС VR-1252; и коронавируса, например, АТСС VR-740, и вирусов, описанных у Нагпге (1966) Proc Soc Exp Biol Med. 121:190.

Доставка композиций данного изобретения в клетки не ограничивается указанными выше вирусными векторами. Могут применяться другие способы и среды доставки, такие как, например, экспрессирующие векторы нуклеиновых кислот, поликатионная конденсированная ДНК, связанная или не связанная только с убитым аденовирусом, например, см. заявку на патент США с регистрационным номером 08/366787, поданную 30 декабря 1994 года, и Curiel (1992) Hum Gene Ther 3:147-154, связанная с лигандом ДНК, например, см. Wu (1989) J Biol Chem 264:16985-16987, клетки-носители для доставки эукариотических клеток, например, см. заявку на патент США с регистрационным номером 08/240030, поданную 9 мая 1994 года, и заявку на патент США с номером 08/404796, депонирование фотополимеризованных материалов гидрогелей, ручной пистолет для переноса генов на частицах, как описано в патенте США 5149655, ионизирующая радиация, как описано в патенте США 5206152 и в WO92/11033, нейтрализация заряда нуклеиновых кислот или слияние с клеточными мембранами. Дополнительные подходы описаны у Philip (1994) Mol Cell Biol 14:2411-2418 и в Woffendin (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. 91:1581-1585.

Может быть использован опосредованный частицами перенос генов, например, см. заявку США с регистрационным номером 60/023867. Кратко, последовательность может быть встроена в общепринятые векторы, которые содержат общепринятые регуляторные последовательности для экспрессии высокого уровня, и затем инкубируют с молекулами переноса синтетических генов, такими как полимерные ДНК-связывающие катионы, такие как полилизин, протамин и альбумин, связанные с нацеливающими на клетки лигандами, такими как асиалоорозомукоид, как описано у Wu and Wu (1987) J. Biol. CHem. 262:4429-4432, инсулин, как описано у Hucked (1990) Biochem Pharmacol 40:253-263, галактоза, как описано у Plank (1992) Bioconjugate Chem 3:533-539, лактоза или трансферрин.

Может быть также использована депротеинизированная ДНК. Примеры способов введения депротеинизированной ДНК описаны в WO 90/11092 и патенте США 5580859. Эффективность поглощения может быть улучшена с использованием биодеградируемых гранул из латекса. Покрытые ДНК гранулы из латекса эффективно транспортируются в клетки после инициации эндоцитоза данными гранулами. Данный способ может быть улучшен дополнительно обработкой гранул для увеличения гидрофобности и тем самым облегчения разрушения эндосомы и высвобождения ДНК в цитоплазму.

Липосомы, которые могут действовать в качестве векторов доставки генов, описаны в патенте США 5422120, WO95/13796, WO94/23697, WO91/14445 и ЕР-524968. Как описано в USSN.60/023867, при невирусной доставке последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие полипептид, могут быть встроены в общепринятые векторы, которые содержат общепринятые регуляторные последовательности для экспрессии высокого уровня, и затем инкубированы с молекулами переноса синтетических генов, такими как полимерные ДНК-связывающие катионы, такие как полилизин, протамин и альбумин, связанные с нацеливающими на клетки лигандами, такими как асиалоорозомукоид, инсулин, галактоза, лактоза или трансферрин. Другие системы доставки включают применение липосом для инкапсулирования ДНК, содержащей ген под контролем различных тканеспецифических или повсеместно активных промоторов. Кроме того, невирусная доставка, пригодная для использования, включает в себя механические системы доставки, такие как подход, описанный у Woffendin et al., (1944) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (24):11581-11585. Кроме того, кодирующая последовательность и ее продукт экспрессии могут быть доставлены через депонирование фотополимеризованных материалов-гидрогелей. Другие общепринятые способы доставки генов, которые могут быть использованы для доставки кодирующей последовательности, включают, например, применение ручного пистолета для переноса генов на частицах, описанного в патенте США 5149655; применение ионизирующей радиации для активации перенесенного гена, как описано в патенте США 5206152 и WO92/11033.

Примерами липосомных и поликатионных векторов доставки генов являются векторы, описанные в патенте США 5422120 и 4162915; в WO 95/13796; WO94/23697 и WO91/14445; в ЕР-0524968; и в Stryer, Biochemistry, pages 236-240 (1975) W.H.Freeman, Sab Francisko; Szoka (1980) Biochem Biophys Acta 600:1; Bayer (1979) Biochem Biophys Acta 550:464; Rivnay (1987) Meth Enzymol 149:119; Wang (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7851; Plant (1989) Anal Biochem 176:420.

Полинуклеотидная композиция может содержать терапевтически эффективное количество вектора генной терапии согласно определенному выше термину. Для целей данного изобретения эффективная доза будет от приблизительно 0,01 до 50 мг/кг или 0,05 мг/кг - приблизительно 10 мг/кг ДНК-конструкций для индивидуума, которому их вводят.

Способы доставки

После приготовления полинуклеотидные композиции данного изобретения могут быть введены (1) непосредственно субъекту; (2) доставлены ex vivo к клеткам, полученным от данного субъекта; или (3) in vitro для экспрессии рекомбинантных белков. Субъектами для лечения могут быть млекопитающие или птицы. Субъектом для лечения может быть также человек.

Прямая доставка данных композиций обычно выполняется инъекцией, подкожной, внутрибрюшинной, внутривенной или внутримышечной, или доставкой в интерстициальное пространство ткани. Композиции могут быть также введены в повреждение. Другие способы введения включают пероральное и легочное введение, суппозитории и трансдермальные или чрескожные применения (например, см. WO98/20734), иглы и генные пистолеты или гипоспреи. Режим введения доз может быть схемой применения лекарственного средства с одноразовой дозой или схемой применения лекарственного средства со множественными дозами.

Способы для доставки ex vivo и повторной имплантации трансформированных клеток субъекту известны в данной области и описаны, например, в WO93/14778. Примеры клеток, используемых в применениях ех vivo, включают, например, стволовые клетки, в частности гемопоэтические клетки, клетки лимфы, макрофаги, дендритные клетки или опухолевые клетки.

Обычно доставка нуклеиновых кислот как для ех vivo, так и для in vitro применений может выполняться посредством следующих процедур, например, опосредованной декстраном трансфекции, осаждения фосфатом кальция, опосредованной полибреном трансфекции, слияния протопластов, электропорации, инкапсулирования полинуклеотида (полинуклеотидов) в липосомах и прямой микроинъекции ДНК в ядра, как хорошо известно в данной области.

Полинуклеотидные и полипептидные фармацевтические композиции

Кроме фармацевтически приемлемых носителей и солей, описанных выше, следующие дополнительные агенты могут быть использованы с полинуклеотидными и/или полипептидными композициями.

А. Полипептиды

Одним примером являются полипептиды, которые включают, без ограничения: асиалооромукоид (ASOR); трансферрин; асиалогликопротеиды; антитела; фрагменты антител; ферритин; интерлейкины; интерфероны; гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF), макрофагальный колониестимулирующий фактор (M-CSF), фактор стволовых клеток и эритропоэтин. Вирусные антигены, такие как белки оболочки, также могут быть использованы, а также белки из других инвазивных организмов, такие как пептид из 17 аминокислот из циркумспорозоитного белка Plasmodium falciparum, известный как RII.

В. Гормоны, витамины и т.д.

Другими группами, которые могут быть включены, являются, например: гормоны, стероиды, андрогены, эстрогены, тиреоидный гормон или витамины, фолиевая кислота.

С. Полиалкилены, полисахариды и т.д.

Полиалкиленгликоль может также включаться с желательными полинуклеотидами/полипептидами. В предпочтительном варианте полиалкиленгликолем является полиэтиленгликоль. Кроме того, могут быть включены моно-, ди- и полисахариды. В предпочтительном варианте полисахаридом является декстран или DEAE-декстран, а также хитозан и поли(сополимер лактида и гликолида).

D. Липиды и липосомы

Желательные полинуклеотиды/полипептиды могут быть также инкапсулированы в липиды или упакованы в липсомы перед доставкой субъекту или к клеткам, полученным из него.

Инкапсулирование в липиды обычно выполняют с использованием липосом, которые способны стабильно связывать или улавливать и удерживать нуклеиновую кислоту. Отношение конденсированного полинуклеотида к препарату липида может варьироваться, но обычно будет около 1:1 (мг ДНК:микромоль липида) или липида может быть больше. В отношении обзора применения липосом в качестве носителей для доставки нуклеиновых кислот см. Hug and Sleight (1991) Biochim. Biophys. Acta. 1097:1-17; Straubinger (1983) Meth. Enzymol. 101:512-527.

Липосомные препараты для применения в данном изобретении включают катионогенные (положительно заряженные), анионогенные (отрицательно заряженные) и нейтральные препараты. Было показано, что катионогенные липосомы опосредуют внутриклеточную доставку плазмидной ДНК (Felgner (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7416); мРНК (Malone (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6077-6081); и очищенные факторы транскрипции (Debs (1990) J. Biol. Chem. 265:10189-10192), в функциональной форме.

Катионогенные липосомы являются легкодоступными. Например, содержащие N-[1-2,3-диолеилокси)пропил]-N,N,N-триэтиламмоний (DOTMA) липосомы доступны под товарным названием Липофектин от Gibco BRL, Grand Island, NY. (См. также Felgner supra). Другие коммерчески доступные липосомы включают трансфектасу (DDAB/DOPE) и DOTAP/DOPE (Boehringer). Другие катионогенные липосомы могут быть получены из легкодоступных материалов с использованием способов, хорошо известных в данной области. См., например, Szoka (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:4194-4198; WO90/11092, в отношении описания синтеза содержащих DOTAP (1,2-бис(олеилокси)-3-триметиламмонио)пропан)липосом.

Подобным образом, анионогенные и нейтральные липосомы являются легкодоступными, например, из Avani Polar Lipids (Birmingham, AL), или могут быть легко получены с использованием легкодоступных материалов. Такие материалы включают среди прочих фосфатидилхолин, холестерин, фосфатидилэтаноламин, диолеоилфосфатидилхолин (DOPC), диолеоилфосфатидилглицерин (DOPG), диолеоилфосфатидилэтаноламин (DOPE). Указанные материалы также могут быть смешаны с DOTMA и DOTAP в качестве исходных материалов в подходящих соотношениях. Способы получения липосом с использованием этих материалов хорошо известны в данной области.

Липосомы могут содержать мультиламеллярные везикулы (MLV), небольшие одноламеллярные везикулы (SUV) или большие одноламеллярные везикулы (LUV). Различные комплексы липосома-нуклеиновая кислота получают с использованием известных в данной области способов. См., например, Straubinger (1983) Meth. Iinmunol. 101:512-527; Szoka (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:4194-4198; Papahadjopoulos (1975) Biochim. Biophys. Acta 394:483; Wilson (1979) Cell 17:77); Deamer and Bangham (1976) Biochim. Biophys. Acta 443:629; Ostro (1977) Biochim. Biophys. Res. Commun. 76:836; Fraiey (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:3348; Enoch and Strittmatter (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:145; Fraley (1980) J. Biol. Chem. (1980) 255:10431; Szoka and Papahadjopoulos (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:145; и Schaefer-Ridder (1982) Science 215:166.

E. Липопротеиды

Кроме того, липопротеиды могут включаться с доставляемым полинуклеотидом/полипептидом. Примеры используемых липопротеидов включают: хиломикроны, HDL, IDL, LDL и VLDL. Могут быть также использованы мутанты, фрагменты или слияния этих белков. Могут быть также использованы модификации природных липопротеидов, такие как ацетилированный LDL. Данные липопротеиды могут нацеливать доставку полинуклеотидов в клетки, экспрессирующие рецепторы липопротеидов. Предпочтительно, если липопротеиды включаются с доставляемым полинуклеотидом, то другой нацеливающий лиганд не включают в эту композицию.

Природные липопротеиды содержат липидную и белковую часть. Белковую часть называют апопротеином. В настоящее время были выделены и идентифицированы апопротеины А, В, С, D и E. По меньшей мере два из них содержат несколько белков, обозначенных римскими цифрами AI, AII, AIV; CI, СII, CIII.

Липопротеид может содержать более одного апопротеина. Например, природные хиломикроны содержат А, В, С и E, на протяжении времени эти липопротеиды теряют А и приобретают С и Е апопротеины. VLDL содержит апопротеины А, В, С и E, LDL содержит апопротеин В; HDL содержит апопротеины А, С и Е. Аминокислотный состав этих апопротеинов известен и описан, например, у Breslow (1985) Annu Rev. Biochem. 54:699; Law (1986) Adv. Exp. Med. Biol. 151:162; Chen (1986) J. Biol. Chem. 261:12918; Kane (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:2465 и Utermann (1984) Hum Genet 65:232.

Липопротеиды содержат различные липиды, в том числе триглицериды, холестерин (свободный и в виде сложных эфиров) и фосфолипиды. Состав липидов варьируется в природных липопротеидах. Например, хиломикроны содержат в основном триглицериды. Более подробное описание липидного содержимого природных липопротеидов может быть найдено, например, в Meth. Enzymol. 128 (1986). Состав липидов выбирают для придания апопротеину конформации, удобной для рецептор-связывающей активности. Состав липидов может быть также выбран для облегчения гидрофобного взаимодействия и ассоциации с полинуклеотид-связывающей молекулой.

Природные липопротеиды могут быть выделены из сыворотки, например, ультрацентрифугированием. Такие способы описаны в Meth. Enzymol. (supra); Pitas (1980) J. Biochem. 255:5454-5460 и Mahey (1979) J Clin. Invest 64:743-750. Липопротеиды могут быть также получены in vitro или рекомбинантными способами экспрессией генов апопротеинов в желательной клетке-хозяине. См, например, Atkinson (1986) Annu Rev Biophys Chem 15:403 и Radding (1958) Biochim. Biophys. Acta 30:443. Липопротеиды могут быть также приобретены у коммерческих поставщиков, таких как Biomedical Technologies, Inc., Stoughton, Massachusetts, USA. Дополнительное описание липопротеидов можно найти у Zuckermann et al. WO98/06437.

F. Подикатионные агенты

Поликатионные агенты могут включаться с или без липопротеида в композицию с доставляемым полинуклеотидом/ полипептидом.

Поликатионные агенты обычно проявляют положительный заряд при физиологическом рН и способны нейтрализовать электрический заряд нуклеиновых кислот для облегчения доставки в желаемое местоположение. Эти агенты находят применение как in vitro, ex vivo, так и in vivo. Поликатионные агенты могут быть использованы для доставки нуклеиновых кислот в живой субъект внутримышечно, подкожно и т.д.

Далее приводятся примеры применимых в качестве поликатионных агентов полипептидов: полилизин, полиаргинин, полиорнитин и протамин. Другие примеры включают гистоны, протамины, человеческий сывороточный альбумин, ДНК-связывающие белки, негистоновые белки хромосом, белки оболочки из ДНК-вирусов, таких как Х174, факторы транскрипции также содержат домены, которые связывают ДНК и, следовательно, могут быть использованы в качестве конденсирующих нуклеиновые кислоты агентов. Кратко, факторы транскрипции, такие как С/СЕВР, c-jun, c-fos, АР-1, АР-2, АР-3, CPF, Prot-i, Sp-i, Oct-1, Oct-2, CREP и TFIID, содержат основные домены, которые связывают ДНК-последовательности.

Органические поликатионные агенты включают: спермин, спермидин и путресцин.

Размеры и физические свойства поликатионного агента могут быть экстраполированы из перечисленного выше для конструирования других полипептидных поликатионных агентов для получения синтетических поликатионных агентов.

Синтетические поликатионные агенты, которые являются применимыми, например, DEAE-декстран, полибрен, Липофектин™ и липофектАМИН™, являются мономерами, которые образуют поликатионные комплексы при объединении с полинуклеотидами/полипептидами.

Иммунодиагностические анализы

Менингококковые антигены данного изобретения могут быть использованы в иммуноанализах для обнаружения уровней антител (или, наооборот, анти-менингококковые антитела могут быть использованы для обнаружения уровней антигена). Иммуноанализы на основе хорошо определенных рекомбинантных антигенов могут быть разработаны для замены инвазивных диагностических способов. Антитела к менингококковым белкам могут быть обнаружены в биологических образцах, в том числе, например, образцах крови или сыворотки. Построение иммуноанализов является предметом огромного числа вариаций, и многие из них известны в данной области. Протоколы для иммуноанализа могут быть основаны, например, на конкуренции или на прямой реакции или на анализах типа сэндвич-анализов. Протоколы могут также использовать, например, твердые носители или могут выполняться с использованием иммунопреципитации. Большинство анализов включают применение меченого антитела или полипептида; метки могут быть, например, флуоресцентными, хемилюминесцентными, радиоактивными молекулами или молекулами-красителя. Известны также анализы, которые усиливают сигналы из образца; примерами являются анализы, которые используют биотин и авидин, и меченые и опосредованные ферментами иммуноанализы, такие как анализы ELISA.

Наборы, пригодные для иммунодиагностики и содержащие подходящие меченые реагенты, созданы упаковкой подходящих материалов, в том числе композиций данного изобретения, в подходящие контейнеры вместе с остальными реагентами и материалами (например, подходящими буферами, солевыми растворами и т.д.), необходимыми для проведения анализа, а также с соответствующим набором инструкцией по проведению анализа.

Гибридизация нуклеиновых кислот

"Гибридизация" обозначает ассоциацию двух последовательностей нуклеиновых кислот друг с другом посредством образования водородных связей. Обычно, одну последовательность фиксируют на твердом носителе, а другая находится в свободном виде в растворе. Затем две данные последовательности помещают для связывания друг с другом в условия, благоприятствующие образованию водородной связи. Факторы, которые влияют на образование водородных связей, включают: тип и объем растворителя; температуру реакции; время гибридизации; перемешивание; агенты для блокирования неспецифического присоединения последовательности жидкой фазы к твердому носителю (реагент Denhardt или BLOTTO); концентрацию последовательностей; применение соединений для увеличения скорости ассоциации последовательностей (декстрансульфат или полиэтиленгликоль); и жесткость условий промывок после гибридизации. См. Sambrook et al. [supra] Volume 2, chapter 9, pages 9.47-9.57.

“Жесткость” обозначает условия в реакции гибридизаци, которые будут способствовать связи очень сходных последовательностей в сравнении с последовательностями, которые отличаются. Например, должна быть выбрана комбинация температуры и концентрации солей, которая является на приблизительно 120-200°С ниже рассчитанной Тm исследуемого гибрида. Температура и солевые условия часто могут быть определены эмпирически в предварительных экспериментах, в которых образцы геномной ДНК, иммобилизованные на фильтрах, гибридизуют с представляющей интерес последовательностью и затем промывают в условиях различной жесткости. См. Sambrook et al. на странице 9.50.

Переменными, которые должны учитываться при проведении, например, блоттинга по Саузерну, являются (1) сложность подвергаемой блоттингу ДНК и (2) гомология между зондом и детектируемыми последовательностями. Общее количество исследуемых фрагментов может варьироваться с размахом в 10 раз, от 0,1-1 мкг для плазмиды или продукта расщепления фага до 10^-9-10^-8 г на однокопийный ген в высокосложном эукариотическом геноме. Для полинуклеотидов меньшей сложности могут быть использованы существенно более короткие периоды блоттинга, гибридизации и экспозиции, меньшее количество исходных полинуклеотидов и меньшая удельная активность зондов. Например, однокопийный дрожжевой ген может быть детектирован со временем экспозиции всего лишь 1 час с 1 мкг дрожжевой ДНК в качестве исходного материала, блоттингом в течение 2 часов и гибридизацией в течение 4-8 часов с зондом 10⁸ имп/мин/мкг. Для однокопийного гена млекопитающего консервативный подход начинался бы с 10 мкг ДНК, блоттинга в течение ночи и гибридизации в течение ночи в присутствии 10% декстрансульфата с использованием зонда более 10⁸ имп/мин/мкг при времени экспозиции ~24 часа.

Несколько факторов могут влиять на температуру плавления (Тm) ДНК-ДНК-гибрида между зондом и представляющим интерес фрагментом и вследствие этого на подходящие условия для гибридизации и промывки. Во многих случаях зонд не является на 100% гомологичным фрагменту. Другие обычно встречающиеся переменные включают длину и общее содержание G+C гибридизующихся последовательностей и ионную силу и содержание формамида в буфере для гибридизации. Действия всех этих факторов могут быть тождественны одному уравнению:

Тm=81+16,6(log₁₀Сi)+0,4[%(G+С)]-0,6(%формамида)-600/n-1,5(%ошибочных спаривании),

где Ci обозначает концентрацию соли (одновалентных ионов), а п обозначает длину гибрида в п.н. (слегка модифицировано в сравнении с Meinkoth and Wahl (1984) Anal. Biochem. 138:267-284).

В построении эксперимента гибридизации некоторые факторы, влияющие на гибридизацию нуклеиновых кислот, могут быть изменены подходящим образом. Проще всего корректировать температуру гибридизации и промывок и концентрацию соли во время промывок. Когда температура гибридизации увеличивается (т.е. увеличивается жесткость), становится менее вероятной гибридизация между цепями, которые являются негомологичными, и в результате снижается фон. Если радиоактивно меченный зонд является не полностью гомологичным иммобилизованному фрагменту (как это часто имеет место в экспериментах с семейством генов и экспериментах с межвидовой гибридизацией), то температура гибридизации должна быть уменьшена, и фон будет увеличиваться. Температура промывок влияет на интенсивность полосы гибридизации и уровень фона таким же образом. Жесткость промывок также увеличивается с уменьшением концентраций соли.

Обычно подходящими температурами гибридизации в присутствии 50% формамида являются 42°С для зонда, который на 95-100% гомологичен фрагменту-мишени, 37°С для гомологии 90-95% и 32°С для гомологии 85-90%. Для более низких гомологий содержание формамида должно быть снижено и температура должна быть скорректирована соответственно с использованием приведенного выше уравнения. Если гомология между зондом и фрагментом-мишенью является неизвестной, то самый простой подход состоит в том, чтобы начать с гибридизации и условий промывки, которые не являются жесткими. Если после авторадиографии наблюдаются неспецифические полосы или высокий фон, фильтр можно промыть при высокой жесткости и повторно экспонировать. Если время, требуемое для экспонирования, делает этот подход непрактичным, несколько жесткостей гибридизации и/или промывки должны испытываться параллельно.

Анализы с зондами нуклеиновых кислот

Способы, такие как ПЦР, анализы с разветвленным ДНК-зондом или способы блоттинга, использующие зонды нуклеиновых кислот в соответствии с данным изобретением, могут определять присутствие кДНК или мРНК. Говорят, что зонд “гибридизуется” с последовательностью данного изобретения, если он может образовать дуплекс или двухцепочечный комплекс, который является достаточно стабильным для детектирования.

Зонды нуклеиновых кислот будут гибридизоваться с менингококковыми нуклеотидными последовательностями данного изобретения (в том числе как со смысловыми, так и с антисмысловыми цепями). Хотя многие различные нуклеотидные последовательности будут кодировать конкретную аминокислотную последовательность, нативная менингококковая последовательность является предпочтительной, так как она является истинной последовательностью, присутствующей в клетках. мРНК представляет кодирующую последовательность, и таким образом, зонд должен быть комплементарным данной кодирующей последовательности; одноцепочечная кДНК является комплементарной мРНК, и таким образом, кДНК-зонд должен быть комплементарным данной некодирующей последовательности.

Последовательность зонда не должна быть обязательно идентичной менингококковой последовательности (или ее комплементу) - некоторая вариация в данной последовательности и длине может приводить к повышенной чувствительности анализа, если зонд нуклеиновой кислоты может образовывать дуплекс с нуклеотидами мишени, который может быть детектирован. Зонд нуклеиновой кислоты может также включать дополнительные нуклеотиды для стабилизации образовавшегося дуплекса. Дополнительная менингококковая последовательность может быть также полезной в качестве метки для детектирования образованного комплекса. Например, некомплементарная нуклеотидная последовательность может быть присоединена к 5'-концу зонда, причем остальная последовательность данного зонда является комплементарной менингококковой последовательности. Альтернативно, в зонд могут быть вставлены в разных местах некомплементарные основания или более длинные последовательности, при условии, что последовательность зонда является достаточно комплементарной менингококковой последовательности, чтобы гибридизоваться с ней и посредством этого образовывать дуплекс, который может быть детектирован.

Точная длина и последовательность зонда будет зависеть от условий гибридизации, таких как температура, солевые условия и т.п. Например, для диагностических применений в зависимости от сложности анализируемой последовательности зонд нуклеиновой кислоты обычно содержит по меньшей мере 10-20 нуклеотидов, предпочтительно 15-25 и более предпочтительно по меньшей мере 30 нуклеотидов, хотя он может быть короче, чем здесь указано. Короткие праймеры обычно требуют более низких температур для образования достаточно стабильных гибридных комплексов с матрицей.

Зонды могут быть получены синтетическими процедурами, такими как триэфирный способ Matteucci et al. [J. Am. Chem. Soc. (1981) 103:3185], или согласно Urdea et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80:7461], или с использованием коммерчески доступных автоматических олигонуклеотидных синтезаторов.

Химическая природа зонда может быть выбрана согласно предпочтению. Для некоторых целей удобны ДНК или РНК. Для других целей могут быть включены модификации, например, модификации скелета, такие как фосфоротиоаты или метилфосфонаты, могут быть использованы для увеличения периода полужизни in vivo, изменения РНК-аффинности, увеличения устойчивости к нуклеазам и т.д. [например, см. Agrawal and lyer (1995) Curr Opin Biotechnol 6:12-19; Agrawal (1996) TIBTECH 14:376-387]; аналоги, такие как пептиднуклеиновые кислоты, также могут быть использованы [например, см. Соrеу (1997) TIBTECH 15:224-229; Buchardt et ai. (1993) TIBTECH 11:384-386].

Альтернативно, полимеразная цепная реакция (ПЦР) является другим хорошо известным способом для обнаружения небольших количеств нуклеиновых кислот-мишеней. Этот анализ описан у Mullis et al. [Meth. Enzymol. (1987) 155:335-350]; в патентах США 4683195 и 4683202. Два “праймерных” нуклеотида гибридизуются с нуклеиновыми кислотами-мишенями и используются для праймирования реакции. Праймеры могут содержать последовательность, которая не гибридизуется с последовательностью амплифицируемой мишени (или не является ее комплементом) для увеличения стабильности дуплекса или, например, для включения удобного сайта рестрикции. Обычно такая последовательность будет фланкировать желаемую менингококковую последовательность.

Термостабильная полимераза создает копии нуклеиновых кислот-мишеней из данных праймеров с использованием исходных нуклеиновых кислот-мишеней в качестве матрицы. После того как пороговое количество нуклеиновых кислот-мишеней генерируется полимеразой, они могут быть детектированы более традиционными способами, такими как Саузерн-блоты. При использовании способа блоттинга по Саузерну меченый зонд будет гибридизоваться с менингококковой последовательностью (или ее комплементом).

мРНК или кДНК могут быть также детектированы традиционными способами блоттинга, описанными у Sambrook et al. [supra]. мРНК или кДНК, генерируемая из мРНК с использованием полимеразного фермента, могут быть очищены и разделены с использованием гель-электрофореза. Затем нуклеиновые кислоты на геле подвергают блоттингу на твердую подложку, такую как нитроцеллюлоза. Твердую подложку подвергают действию меченого зонда и затем промывают для удаления негибридизованного зонда. Затем детектируют дуплексы, содержащие меченый зонд. Обычно зонд метят радиоактивной частью молекулы.

ПРИМЕРЫ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫХ ФРАГМЕНТОВ

Белковые последовательности, описанные в WO99/36544, подвергали компьютерному анализу для прогнозирования антигенных пептидных фрагментов в полноразмерных белках. В этом анализе использовали три алгоритма:

- AMPHI (АМФИ) Эту программу использовали для предсказания Т-клеточных эпитопов [Gao et al. (1989) J. Immunol. 143:3007; Roberts et al. (1996) AIDS Res Hum Retrovir 12:593; Quakyi et al. (1992) Scand J Immunol suppl. 11:9], и она доступна в Protean package of DNASTAR, Inc. (1228 South Park Street, Madison, Wisconsin 53715 USA).

- антигенный ИНДЕКС, как описано Jameson and Wolf (1988) The antigenic index: a novel algorithm for predicting antigenic determinants. CABIOS 4:181-186.

- ГИДРОФИЛЬНОСТЬ, как описано Норр and Woods (1981) Prediction of protein antigenic determinants from amino acid sequences. PNAS USA 78:3824-3828.

Таблица I показывает предпочтительные фрагменты белков, описанных в WO99/36544. Три алгоритма часто идентифицируют одни и те же фрагменты (например, ORF38-1 - фрагменты из остатков 37-42 и 143-146 оба идентифицированы дважды). Такие множественно-идентифицированные фрагменты являются особенно предпочтительными. Данные алгоритмы часто идентифицируют перекрывающиеся фрагменты (например, ORF40-1 - АМФИ идентифицирует остатки 161-165, а Гидрофильность идентифицировала остатки 163-175). Данное изобретение специально включает фрагменты, происходящие из комбинации этих перекрывающихся фрагментов (например, фрагмент от остатка 161 до остатка 175 в случае ORF40-1). Фрагменты, разделенные единственной аминокислотой, также часто идентифицируются (например, ORF40-1 Антигенный Индекс 423-426 и 428-438). Данное изобретение также включает в себя фрагменты, соединяющие два края таких “смежных” фрагментов (например, 423-438 для ORF40-1).

ТАБЛИЦА I - 1769 фрагментов белков, описанных в WO99/36544

Код: фрагмент #1 данной заявки является аминокислотами 6-14 ORF38-1, описанного в WO99/36544, фрагмент #2 данной заявки является аминокислотами 57-59 ORF38-1, описанного в WO99/36544, и т.д.

Фрагмент #ORF W099/36544АлгоритмАминокислоты1.38-1АМФИ6-142.38-1АМФИ57-593.38-1АМФИ67-764.38-1АМФИ92-1005.38-1АМФИ127-1376.38-1АМФИ149-1667.38-1АМФИ210-2158.38-1АМФИ231-2369.38-1АМФИ270-27210.38-1АМФИ303-320

 
11.38-1Антигенный индекс16-3412.38-1Антигенный индекс37-4213.38-1Антигенный индекс46-6414.38-1Антигенный индекс72-9115.38-1Антигенный индекс94-11216.38-1Антигенный индекс114-11717.38-1Антигенный индекс124-13618.38-1Антигенный индекс143-14619.38-1Антигенный индекс148-16020.38-1Антигенный индекс167-19521.38-1Антигенный индекс201-21622.38-1Антигенный индекс218-24023.38-1Антигенный индекс244-25224.38-1Антигенный индекс257-27825.38-1Антигенный индекс282-29026.38-1Антигенный индекс308-31427.38-1Гидрофильность21-3428.38-1Гидрофильность37-4229.38-1Гидрофильность47-5530.38-1Гидрофильность57-6131.38-1Гидрофильность72-7432.38-1Гидрофильность76-7833.38-1Гидрофильность82-9134.38-1Гидрофильность94-10135.38-1Гидрофильность108-11236.38-1Гидрофильность126-13637.38-1Гидрофильность143-14638.38-1Гидрофильность148-16039.38-1Гидрофильность167-19540.38-1Гидрофильность221-22341.38-1Гидрофильность226-23642.38-1Гидрофильность244-25043.38-1Гидрофильность257-274

44.38-1Гидрофильность282-28645.38-1Гидрофильность311-31446.38аАМФИ6-1447.38аАМФИ57-5948.38аАМФИ67-7649.38аАМФИ92-10050.38аАМФИ127-13751.38аАМФИ149-16652.38аАМФИ210-21553.38аАМФИ223-22554.38аАМФИ231-23655.38аАМФИ270-27256.38аАМФИ303-32057.38аАнтигенный индекс16-3458.38аАнтигенный индекс37-4259.38аАнтигенный индекс46-6460.38аАнтигенный индекс72-9161.38аАнтигенный индекс94-11262.38аАнтигенный индекс114-11763.38аАнтигенный индекс124-13664.38аАнтигенный индекс143-14665.38аАнтигенный индекс148-16066.38аАнтигенный индекс165-19567.38аАнтигенный индекс201-21668.38аАнтигенный индекс218-24069.38аАнтигенный индекс244-25270.38аАнтигенный индекс257-27871.38аАнтигенный индекс282-29072.38аАнтигенный индекс308-31473.38аГидрофильность21-3474.38аГидрофильность37-4275.38аГидрофильность47-5576.38аГидрофильность57-61

77.38аГидрофильность72-7478.38аГидрофильность76-7879.38аГидрофильность82-9180.38аГидрофильность94-10181.38аГидрофильность108-11282.38аГидрофильность126-13683.38аГидрофильность143-14684.38аГидрофильность148-16085.38аГидрофильность165-19586.38аГидрофильность221-22387.38аГидрофильность226-23688.38аГидрофильность244-25089.38аГидрофильность257-27390.38аГидрофильность282-28691.38аГидрофильность311-31492.39-1АМФИ6-1393.39-1АМФИ21-2494.39-1АМФИ37-4095.39-1АМФИ60-7596.39-1АМФИ118-12297.39-1АМФИ134-13998.39-1АМФИ165-18399.39-1АМФИ192-195100.39-1АМФИ233-241101.39-1АМФИ247-267102.39-1АМФИ273-275103.39-1АМФИ299-308104.39-1АМФИ310-319105.39-1АМФИ322-330106.39-1АМФИ338-347107.39-1АМФИ358-364108.39-1АМФИ366-368109.39-1АМФИ376-378

110.39-1АМФИ385-392111.39-1АМФИ413-416112.39-1АМФИ421-424113.39-1АМФИ429-438114.39-1АМФИ445-454115.39-1АМФИ456-458116.39-1АМФИ498-500117.39-1АМФИ512-519118.39-1АМФИ576-587119.39-1АМФИ589-600120.39-1АМФИ650-652121.39-1АМФИ670-674122.39-1Антигенный индекс26-32123.39-1Антигенный индекс35-45124.39-1Антигенный индекс54-69125.39-1Антигенный индекс79-84126.39-1Антигенный индекс88-96127.39-1Антигенный индекс105-110128.39-1Антигенный индекс117-124129.39-1Антигенный индекс152-154130.39-1Антигенный индекс190-192131.39-1Антигенный индекс222-231132.39-1Антигенный индекс246-265133.39-1Антигенный индекс292-295134.39-1Антигенный индекс318-335135.39-1Антигенный индекс353-362136.39-1Антигенный индекс370-372137.39-1Антигенный индекс402-404138.39-1Антигенный индекс406-408139.39-1Антигенный индекс419-421140.39-1Антигенный индекс446-449141.39-1Антигенный индекс453-460142.39-1Антигенный индекс465-469

143.39-1Антигенный индекс476-487144.39-1Антигенный индекс491-499145.39-1Антигенный индекс505-514146.39-1Антигенный индекс522-536147.39-1Антигенный индекс557-567148.39-1Антигенный индекс569-575149.39-1Антигенный индекс577-580150.39-1Антигенный индекс593-599151.39-1Антигенный индекс603-619152.39-1Антигенный индекс626-628153.39-1Антигенный индекс634-637154.39-1Антигенный индекс639-647155.39-1Антигенный индекс655-658156.39-1Антигенный индекс672-674157.39-1Антигенный индекс677-686158.39-1Антигенный индекс688-691159.39-1Антигенный индекс693-699160.39-1Антигенный индекс707-710161.39-1Гидрофильность28-32162.39-1Гидрофильность38-44163.39-1Гидрофильность54-69164.39-1Гидрофильность80-83165.39-1Гидрофильность89-96166.39-1Гидрофильность117-119167.39-1Гидрофильность121-123168.39-1Гидрофильность152-154169.39-1Гидрофильность224-231170.39-1Гидрофильность247-265171.39-1Гидрофильность318-332172.39-1Гидрофильность357-361173.39-1Гидрофильность402-404174.39-1Гидрофильность406-408175.39-1Гидрофильность446-449

176.39-1Гидрофильность454-459177.39-1Гидрофильность465-469178.39-1Гидрофильность476-487179.39-1Гидрофильность491-499180.39-1Гидрофильность506-514181.39-1Гидрофильность525-535182.39-1Гидрофильность560-567183.39-1Гидрофильность573-575184.39-1Гидрофильность577-580185.39-1Гидрофильность594-596186.39-1Гидрофильность605-607187.39-1Гидрофильность611-619188.39-1Гидрофильность634-637189.39-1Гидрофильность639-647190.39-1Гидрофильность672-674191.39-1Гидрофильность677-686192.39-1Гидрофильность688-690193.39-1Гидрофильность693-695194.39аАМФИ6-13195.39аАМФИ21-24196.39аАМФИ37-40197.39аАМФИ60-75198.39аАМФИ118-122199.39аАМФИ134-139200.39аАМФИ165-183201.39аАМФИ192-195202.39аАМФИ233-241203.39аАМФИ247-267204.39аАМФИ273-275205.39аАМФИ299-308206.39аАМФИ310-319207.39аАМФИ322-330208.39аАМФИ338-347

209.39аАМФИ358-364210.39аАМФИ366-368211.39аАМФИ376-378212.39аАМФИ385-392213.39аАМФИ413-416214.39аАМФИ421-424215.39аАМФИ429-438216.39аАМФИ445-454217.39аАМФИ456-458218.39аАМФИ498-500219.39аАМФИ512-520220.39аАМФИ576-587221.39аАМФИ589-600222.39аАМФИ650-652223.39аАМФИ670-674224.39аАнтигенный индекс26-32225.39аАнтигенный индекс35-45226.39аАнтигенный индекс54-69227.39аАнтигенный индекс79-84228.39аАнтигенный индекс89-96229.39аАнтигенный индекс103-110230.39аАнтигенный индекс117-124231.39аАнтигенный индекс152-154232.39аАнтигенный индекс190-192233.39аАнтигенный индекс222-231234.39аАнтигенный индекс246-265235.39аАнтигенный индекс292-295236.39аАнтигенный индекс318-335237.39аАнтигенный индекс353-362238.39аАнтигенный индекс370-372239.39аАнтигенный индекс402-404240.39аАнтигенный индекс406-408241.39аАнтигенный индекс419-421

242.39аАнтигенный индекс446-449243.39аАнтигенный индекс453-460244.39аАнтигенный индекс465-469245.39аАнтигенный индекс476-487246.39аАнтигенный индекс491-499247.39аАнтигенный индекс505-514248.39аАнтигенный индекс529-535249.39аАнтигенный индекс557-567250.39аАнтигенный индекс569-575251.39аАнтигенный индекс577-580252.39аАнтигенный индекс593-599253.39аАнтигенный индекс603-619254.39аАнтигенный индекс626-628255.39аАнтигенный индекс634-637256.39аАнтигенный индекс639-647257.39аАнтигенный индекс655-658258.39аАнтигенный индекс672-674259.39аАнтигенный индекс677-686260.39аАнтигенный индекс688-691261.39аАнтигенный индекс693-699262.39аАнтигенный индекс707-710263.39аГидрофильность28-32264.39аГидрофильность38-44265.39аГидрофильность54-69266.39аГидрофильность80-83267.39аГидрофильность89-95268.39аГидрофильность105-108269.39аГидрофильность117-119270.39аГидрофильность121-123271.39аГидрофильность152-154272.39аГидрофильность224-231273.39аГидрофильность247-265274.39аГидрофильность318-332

275.39аГидрофилы-юсть357-361276.39аГидрофильность402-404277.39аГидрофильность406-408278.39аГидрофильность446-449279.39аГидрофильность454-459280.39аГидрофильность465-469281.39аГидрофильность476-487282.39аГидрофильность491-499283.39аГидрофильность506-514284.39аГидрофильность525-535285.39аГидрофильность560-567286.39аГидрофильность573-575287.39аГидрофильность577-580288.39аГидрофильность594-596289.39аГидрофильность605-607290.39аГидрофильность611-619291.39аГидрофильность634-637292.39аГид рофил ьность639-647293.39аГидрофильность672-674294.39аГид рофил ьность677-686295.39аГидрофильность688-690296.39аГидрофильность693-695297.40-1АМФИ6-14298.40-1АМФИ16-19299.40-1АМФИ22-27300.40-1АМФИ30-33301.40-1АМФИ41-44302.40-1АМФИ62-68303.40-1АМФИ129-139304.40-1АМФИ161-165305.40-1АМФИ181-191306.40-1АМФИ199-202307.40-1АМФИ215-220

308.40-1АМФИ237-249309.40-1АМФИ298-302310.40-1АМФИ313-318311.40-1АМФИ335-342312.40-1АМФИ376-383313.40-1АМФИ399-402314.40-1АМФИ426-428315.40-1АМФИ430-433316.40-1АМФИ435-437317.40-1АМФИ479-482318.40-1АМФИ491-511319.40-1АМФИ523-525320.40-1АМФИ560-563321.40-1Антигенный индекс21-32322.40-1Антигенный индекс49-61323.40-1Антигенный индекс64-66324.40-1Антигенный индекс74-92325.40-1Антигенный индекс98-123326.40-1Антигенный индекс129-135327.40-1Антигенный индекс138-176328.40-1Антигенный индекс193-195329.40-1Антигенный индекс199-219330.40-1Антигенный индекс226-240331.40-1Антигенный индекс242-245332.40-1Антигенный индекс251-257333.40-1Антигенный индекс261-276334.40-1Антигенный индекс279-306335.40-1Антигенный индекс308-346336.40-1Антигенный индекс352-367337.40-1Антигенный индекс375-378338.40-1Антигенный индекс384-406339.40-1Антигенный индекс408-420340.40-1Антигенный индекс423-426

341.40-1Антигенный индекс428-438342.40-1Антигенный индекс553-459343.40-1Антигенный индекс462-481344.40-1Антигенный индекс485-494345.40-1Антигенный индекс506-518346.40-1Антигенный индекс535-539347.40-1Антигенный индекс544-552348.40-1Антигенный индекс559-566349.40-1Антигенный индекс571-582350.40-1Гидрофильность21-32351.40-1Гидрофильность51-61352.40-1Гидрофильность64-66353.40-1Гидрофильность75-92354.40-1Гидрофильность100-122355.40-1Гидрофильность129-135356.40-1Гидрофильность140-145357.40-1Гидрофильность149-152358.40-1Гидрофильность157-161359.40-1Гидрофильность163-175360.40-1Гидрофильность199-201361.40-1Гидрофильность203-219362.40-1Гидрофильность227-240363.40-1Гидрофильность251-257364.40-1Гидрофильность261-276365.40-1Гидрофильность279-306366.40-1Гидрофильность308-318367.40-1Гидрофильность320-328368.40-1Гидрофильность334-341369.40-1Гидрофильность354-356370.40-1Гидрофильность359-366371.40-1Гидрофильность392-398372.40-1Гидрофильность400-405373.40-1Гидрофильность410-420

374.40-1Гидрофильность429-438375.40-1Гидрофильность463-467376.40-1Гидрофильность471-480377.40-1Гидрофильность487-493378.40-1Гидрофильность506-518379.40-1Гидрофильность547-552380.40-1Гидрофильность575-579381.40аАМФИ6-10382.40аАМФИ19-27383.40аАМФИ30-33384.40аАМФИ41-44385.40аАМФИ61-72386.40аАМФИ78-81387.40аАМФИ92-94388.40аАМФИ128-130389.40аАМФИ132-134390.40аАМФИ161-165391.40аАМФИ181-193392.40аАМФИ197-199393.40аАМФИ204-211394.40аАМФИ213-218395.40аАМФИ227-229396.40аАМФИ237-249397.40аАМФИ298-302398.40аАМФИ313-318399.40аАМФИ335-342400.40аАМФИ376-383401.40аАМФИ399-402402.40аАМФИ426-428403.40аАМФИ435-437404.40аАМФИ475-483405.40аАМФИ492-512406.40аАМФИ524-526

407.40аАМФИ561-564408.40аАнтигенный индекс21-34409.40аАнтигенный индекс50-64410.40аАнтигенный индекс75-83411.40аАнтигенный индекс88-97412.40аАнтигенный индекс105-122413.40аАнтигенный индекс129-134414.40аАнтигенный индекс140-176415.40аАнтигенный индекс190-207416.40аАнтигенный индекс211-217417.40аАнтигенный индекс224-240418.40аАнтигенный индекс242-245419.40аАнтигенный индекс250-255420.40аАнтигенный индекс260-276421.40аАнтигенный индекс279-306422.40аАнтигенный индекс308-346423.40аАнтигенный индекс352-367424.40аАнтигенный индекс375-378425.40аАнтигенный индекс384-406426.40аАнтигенный индекс408-420427.40аАнтигенный индекс423-438428.40аАнтигенный индекс453-468429.40аАнтигенный индекс471-481430.40аАнтигенный индекс487-493431.40аАнтигенный индекс507-519432.40аАнтигенный индекс536-540433.40аАнтигенный индекс545-553434.40аАнтигенный индекс560-567435.40аАнтигенный индекс572-583436.40аГидрофильность21-34437.40аГидрофильность50-64438.40аГидрофильность75-83439.40аГидрофильность88-96

440.40аГидрофильность105-121441.40аГидрофильность129-134442.40аГидрофильность140-145443.40аГидрофильность148-155444.40аГидрофильность157-161445.40аГидрофильность163-175446.40аГидрофильность196-202447.40аГидрофильность211-217448.40аГидрофильность225-230449.40аГидрофильность232-240450.40аГидрофильность253-255451.40аГидрофильность261-276452.40аГидрофильность279-306453.40аГидрофильность308-318454.40аГидрофильность320-328455.40аГидрофильность334-341456.40аГидрофильность354-356457.40аГидрофильность359-366458.40аГидрофильность392-398459.40аГидрофильность400-405460.40аГидрофильность410-420461.40аГидрофильность428-438462.40аГидрофильность462-468463.40аГидрофильность472-481464.40аГидрофильность489-493465.40аГидрофильность507-519466.40аГидрофильность548-553467.40аГидрофильность576-580468.41-1АМФИ30-36469.41-1АМФИ93-98470.41-1АМФИ111-122471.41-1АМФИ126-129472.41-1АМФИ136-143

473.41-1АМФИ145-150474.41-1АМФИ156-158475.41-1АМФИ186-195476.41-1АМФИ201-208477.41-1АМФИ213-223478.41-1АМФИ236-247479.41-1АМФИ250-255480.41-1АМФИ273-282481.41-1АМФИ303-309482.41-1АМФИ311-314483.41-1АМФИ329-338484.41-1АМФИ344-362-485.41-1АМФИ372-377486.41-1АМФИ385-39248741-1АМФИ409-412488.41-1АМФИ419-426489.41-1АМФИ458-463490.41-1АМФИ470-474491.41-1АМФИ486-489492.41-1АМФИ512-518493.41-1АМФИ527-551494.41-1АМФИ564-579495.41-1АМФИ593-597496.41-1Антигенный индекс13-22497.41-1Антигенный индекс30-38498.41-1Антигенный индекс43-55499.41-1Антигенный индекс73-75500.41-1Антигенный индекс87-89501.41-1Антигенный индекс105-112502.41-1Антигенный индекс114-124503.41-1Антигенный индекс136-141504.41-1Антигенный индекс147-153505.41-1Антигенный индекс163-166

506.41-1Антигенный индекс174-184507.41-1Антигенный индекс195-207508.41-1Антигенный индекс226-236509.41-1Антигенный индекс244-246510.41-1Антигенный индекс249-265511.41-1Антигенный индекс281-287512.41-1Антигенный индекс294-313513.41-1Антигенный индекс317-342514.41-1Антигенный индекс350-375515.41-1Антигенный индекс379-386516.41-1Антигенный индекс390-396517.41-1Антигенный индекс413-422518.41-1Антигенный индекс425-430519.41-1Антигенный индекс436-440520.41-1Антигенный индекс446-465521.41-1Антигенный индекс468-495522.41-1Антигенный индекс498-518523.41-1Антигенный индекс520-522524.41-1Антигенный индекс525-542525.41-1Антигенный индекс547-558526.41-1Антигенный индекс565-590527.41-1Антигенный индекс595-602528.41-1Антигенный индекс608-619529.41-1Гидрофильность14-21530.41-1Гидрофильность30-33531.41-1Гидрофильность45-55532.41-1Гидрофильность87-89533.41-1Гидрофильность106-111534.41-1Гидрофильность114-120535.41-1Гидрофильность122-124536.41-1Гидрофильность136-141537.41-1Гидрофильность148-150538.41-1Гидрофильность177-184

539.41-1Гидрофильность195-207540.41-1Гидрофильность226-234541.41-1Гидрофильность249-265542.41-1Гидрофильность285-287543.41-1Гидрофильность294-297544.41-1Гидрофильность299-313545.41-1Гидрофильность317-321546.41-1Гидрофильность323-342547.41-1Гидрофильность350-371548.41-1Гидрофильность379-386549.41-1Гидрофильность417-422550.41-1Гидрофильность425-427551.41-1Гидрофильность447-449552.41-1Гидрофильность459-462553.41-1Гидрофильность468-475554.41-1Гидрофильность479-482555.41-1Гидрофильность484-491556.41-1Гидрофильность499-518557.41-1Гидрофильность520-522558.41-1Гидрофильность526-542559.41-1Гидрофильность550-558560.41-1Гидрофильность568-590561.41-1Гидрофильность595-598562.41-1Гидрофильность617-619563.41аАМФИ6-12564.41аАМФИ32-34565.41аАМФИ69-74566.41аАМФИ86-98567.41аАМФИ111-119568.41аАМФИ121-126569.41аАМФИ132-134570.41аАМФИ155-160571.41аАМФИ162-171

572.41аАМФИ177-184573.41аАМФИ189-199574.41аАМФИ212-223575.41аАМФИ226-231576.41аАМФИ249-258577.41аАМФИ287-290578.41аАМФИ305-314579.41аАМФИ320-338580.41аАМФИ348-353581.41аАМФИ361-368582.41аАМФИ385-388583.41аАМФИ395-402584.41аАМФИ434-439585.41аАМФИ446-450586.41аАМФИ462-467587.41аАМФИ470-475588.41аАМФИ488-494589.41аАМФИ503-525590.41аАМФИ540-555591.41аАМФИ569-573592.41аАМФИ578-594593.41аАнтигенный индекс10-13594.41аАнтигенный индекс19-31595.41аАнтигенный индекс48-50596.41аАнтигенный индекс63-65597.41аАнтигенный индекс82-101598.41аАнтигенный индекс112-117599.41аАнтигенный индекс123-129600.41аАнтигенный индекс139-142601.41аАнтигенный индекс150-160602.41аАнтигенный индекс171-183603.41аАнтигенный индекс202-212604.41аАнтигенный индекс220-222

605.41аАнтигенный индекс225-241606.41аАнтигенный индекс257-263607.41аАнтигенный индекс270-289608.41аАнтигенный индекс293-318609.41аАнтигенный индекс326-351610.41аАнтигенный индекс355-362611.41аАнтигенный индекс366-372612.41аАнтигенный индекс389-398613.41аАнтигенный индекс401-406614.41аАнтигенный индекс412-416615.41аАнтигенный индекс422-441616.41аАнтигенный индекс444-446617.41аАнтигенный индекс451-471618.41аАнтигенный индекс475-494619.41аАнтигенный индекс496-498620.41аАнтигенный индекс501-518621.41аАнтигенный индекс523-534622.41аАнтигенный индекс540-566623.41аАнтигенный индекс571-578624.41аАнтигенный индекс582-595625.41аГидрофильность21-31626.41аГидрофильность63-65627.41аГидрофильность83-96628.41аГидрофильность98-100629.41аГидрофильность112-117630.41аГидрофильность124-126631.41аГидрофильность153-160632.41аГидрофильность171-183633.41аГидрофильность202-210634.41аГидрофильность220-222635.41аГидрофильность225-241636.41аГидрофильность261-263637.41аГидрофильность270-273

638.41аГидрофильность275-289639.41аГидрофильность293-297640.41аГидрофильность299-318641.41аГидрофильность326-347642.41аГидрофильность355-362643.41аГидрофильность393-398644.41аГидрофильность401-403645.41аГидрофильность423-425646.41аГидрофильность435-438647.41аГидрофильность454-458648.41аГидрофильность460-471649.41аГидрофильность475-494650.41аГидрофильность496-498651.41аГидрофильность502-518652.41аГидрофильность527-534653.41аГидрофильность544-566654.41аГидрофильность571-574655.41аГидрофильность593-595656.44-1АМФИ57-60657.44-1АМФИ76-79658.44-1Антигенный индекс22-34659.44-1Антигенный индекс38-46660.44-1Антигенный индекс50-55661.44-1Антигенный индекс64-70662.44-1Антигенный индекс72-80663.44-1Антигенный индекс83-89664.44-1Антигенный индекс96-106665.44-1Антигенный индекс110-124666.44-1Гидрофильность22-34667.44-1Гидрофильность40-46668.44-1Гидрофильность64-69669.44-1Гидрофильность73-80670.44-1Гидрофильность84-89

671.44-1Гидрофильность97-106672.44-1Гидрофильность120-124673.44аАМФИ57-60674.44аАМФИ76-79675.44аАнтигенный индекс23-34676.44аАнтигенный индекс38-46677.44аАнтигенный индекс50-55678.44аАнтигенный индекс64-70679.44аАнтигенный индекс72-80680.44аАнтигенный индекс83-89681.44аАнтигенный индекс96-106682.44аАнтигенный индекс110-124683.44аГидрофильность28-34684.44аГидрофильность40-46685.44аГидрофильность64-69686.44аГидрофильность73-80687.44аГидрофильность84-89688.44аГидрофильность97-106689.44аГидрофильность120-124690.49-1АМФИ16-21691.49-1АМФИ44-48692.49-1АМФИ56-61693.49-1АМФИ92-97694.49-1АМФИ118-127695.49-1АМФИ130-149696.49-1АМФИ156-178697.49-1АМФИ235-240698.49-1АМФИ253-264699.49-1АМФИ268-271700.49-1АМФИ278-285701.49-1АМФИ287-292702.49-1АМФИ298-300703.49-1АМФИ328-337

704.49-1АМФИ343-350705.49-1АМФИ355-365706.49-1АМФИ378-389707.49-1АМФИ422-424708.49-1АМФИ442-450709.49-1АМФИ464-481710.49-1АМФИ486-496711.49-1АМФИ514-521712.49-1АМФИ548-551713.49-1АМФИ553-557714.49-1АМФИ562-568715.49-1АМФИ573-575716.49-1АМФИ588-590717.49-1АМФИ603-605718.49-1АМФИ614-618719.49-1Антигенный индекс15-21720.49-1Антигенный индекс26-43721.49-1Антигенный индекс50-59722.49-1Антигенный индекс61-75723.49-1Антигенный индекс79-87724.49-1Антигенный индекс98-108725.49-1Антигенный индекс110-120726.49-1Антигенный индекс122-139727.49-1Антигенный индекс147-164728.49-1Антигенный индекс171-179729.49-1Антигенный индекс185-197730.49-1Антигенный индекс214-216731.49-1Антигенный индекс229-231732.49-1Антигенный индекс248-266733.49-1Антигенный индекс278-283734.49-1Антигенный индекс289-295735.49-1Антигенный индекс316-326736.49-1Антигенный индекс337-349

737.49-1Антигенный индекс368-378738.49-1Антигенный индекс386-388739.49-1Антигенный индекс390-410740.49-1Антигенный индекс412-414741.49-1Антигенный индекс423-429742.49-1Антигенный индекс438-454743.49-1Антигенный индекс462-475744.49-1Антигенный индекс482-500745.49-1Антигенный индекс503-509746.49-1Антигенный индекс521-528747.49-1Антигенный индекс540-562748.49-1Антигенный индекс572-579749.49-1Антигенный индекс590-606750.49-1Антигенный индекс610-612751.49-1Антигенный индекс617-619752.49-1Антигенный индекс626-634753.49-1Антигенный индекс637-640754.49-1Гидрофильность18-21755.49-1Гидрофильность26-29756.49-1Гидрофильность31-43757.49-1Гидрофильность51-57758.49-1Гидрофильность64-68759.49-1Гидрофильность79-87760.49-1Гидрофильность98-107761.49-1Гидрофильность122-125762.49-1Гидрофильность147-164763.49-1Гидрофильность172-175764.49-1Гидрофильность187-197765.49-1Гидрофильность229-231766.49-1Гидрофильность256-262767.49-1Гидрофильность264-266768.49-1Гидрофильность278-283769.49-1Гидрофильность290-292

770.49-1Гидрофильность319-326771.49-1Гидрофильность337-349772.49-1Гидрофильность368-376773.49-1Гидрофильность386-388774.49-1Гидрофильность390-410775.49-1Гидрофильность412-414776.49-1Гидрофильность423-429777.49-1Гидрофильность441-451778.49-1Гидрофильность446-472779.49-1Гидрофильность484-490780.49-1Гидрофильность492-494781.49-1Гидрофильность496-498782.49-1Гидрофильность522-528783,49-1Гидрофильность543-562784.49-1Гидрофильность591-606785.49-1Гидрофильность617-619786.49-1Гидрофильность626-632787.49-1Гидрофильность637-640788.49аАМФИ55-61789.49аАМФИ92-97790.49аАМФИ118-127791.49аАМФИ129-135792.49аАМФИ137-145793.49аАМФИ156-178794.49аАМФИ198-200795.49аАМФИ235-240796.49аАМФИ252-264797.49аАМФИ277-285,798.49аАМФИ287-292799.49аАМФИ298-300800.49аАМФИ321-326801.49аАМФИ328-337802.49аАМФИ343-350

803.49аАМФИ355-365804.49аАМФИ378-389805.49аАМФИ392-397806.49аАМФИ415-424807.49аАМФИ453-456808.49аАМФИ471-480809.49аАМФИ486-504810.49аАМФИ514-519811.49аАМФИ527-534812.49аАМФИ551-554813.49аАМФИ561-568814.49аАМФИ600-605815.49аАМФИ612-616816.49аАМФИ628-633817.49аАМФИ636-641818.49аАМФИ654-660819.49аАМФИ669-691820.49аАМФИ706-721821.49аАМФИ735-739822.49аАМФИ744-760823.49аАнтигенный индекс4-23824.49аАнтигенный индекс27-43825.49аАнтигенный индекс51-62826.49аАнтигенный индекс64-68827.49аАнтигенный индекс72-75828.49аАнтигенный индекс79-87829.49аАнтигенный индекс98-108830.49аАнтигенный индекс110-120831.49аАнтигенный индекс124-139832.49аАнтигенный индекс147-164833.49аАнтигенный индекс176-179834.49аАнтигенный индекс185-197835.49аАнтигенный индекс214-216

836.49аАнтигенный индекс229-231837.49аАнтигенный индекс248-267838.49аАнтигенный индекс278-283839.49аАнтигенный индекс289-295840.49аАнтигенный индекс305-308841.49аАнтигенный индекс316-326842.49аАнтигенный индекс337-349843.49аАнтигенный индекс368-378844.49аАнтигенный индекс386-388845.49аАнтигенный индекс391-407846.49аАнтигенный индекс423-429847.49аАнтигенный индекс436-455848.49аАнтигенный индекс459-484849.49аАнтигенный индекс492-517850.49аАнтигенный индекс521-528851.49аАнтигенный индекс532-539852.49аАнтигенный индекс555-564853.49аАнтигенный индекс567-572854.49аАнтигенный индекс578-582855.49аАнтигенный индекс588-607856.49аАнтигенный индекс610-612857.49аАнтигенный индекс617-637858.49аАнтигенный индекс641-660859.49аАнтигенный индекс662-664860.49аАнтигенный индекс667-684861.49аАнтигенный индекс689-700862.49аАнтигенный индекс706-732863.49аАнтигенный индекс737-744864.49аАнтигенный индекс748-761865.49аГидрофильность4-23866.49аГидрофильность31-43867.49аГидрофильность51-53868.49аГидрофильность55-57

869.49аГидрофильность64-68870.49аГидрофильность79-87871.49аГидрофильность98-106872.49аГидрофильность114-120873.49аГидрофильность130-139874.49аГидрофильность147-164875.49аГидрофильность187-197876.49аГидрофильность229-231877.49аГидрофильность249-262878.49аГидрофильность264-266879.49аГидрофильность278-283880.49аГидрофильность290-292881.49аГидрофильность319-326882.49аГидрофильность337-349883.49аГидрофильность368-376884.49аГидрофильность386-388885.49аГидрофильность391-407886.49аГидрофильность427-429887.49аГидрофильность436-439888.49аГидрофильность441-455889.49аГидрофильность459-463890.49аГидрофильность465-484891.49аГидрофильность492-513892.49аГидрофильность521-528893.49аГидрофильность559-564894.49аГидрофильность567-569895.49аГидрофильность589-591896.49аГидрофильность601-604897.49аГидрофильность620-624898.49аГидрофильность626-637899.49аГидрофильность641-660900.49аГидрофильность662-664901.49аГидрофильность668-684

902.49аГидрофильность693-700903.49аГидрофильность710-732904.49аГидрофильность737-740905.49аГидрофильность759-761906.51-1АМФИ15-21907.51-1АМФИ40-54908.51-1АМФИ75-86909.51-1АМФИ108-110910.51-1АМФИ112-124911.51-1АМФИ141-148912.51-1АМФИ184-189913.51-1АМФИ211-216914.51-1Антигенный индекс58-65915.51-1Антигенный индекс123-127916.51-1Антигенный индекс132-137917.51-1Антигенный индекс149-153918.51-1Антигенный индекс165-177919.51-1Антигенный индекс198-204920.51-1Антигенный индекс222-231921.51-1Гидрофильность60-65922.51-1Гидрофильность123-127923.51-1Гидрофильность132-135924.51-1Гидрофильность165-174925.51-1Гидрофильность200-203926.51-1Гидрофильность222-227927.51аАМФИ15-21928.51 аАМФИ40-54929.51аАМФИ75-86930.51аАМФИ108-110931.51 аАМФИ112-124932.51аАМФИ141-148933.51аАМФИ184-189934.51аАМФИ211-216

935.51аГидрофильность60-65936.51аГидрофильность123-127937.51аГидрофильность132-135938.51аГидрофильность165-174939.51аГидрофильность200-203940.51аГидрофильность222-227941.52-1АМФИ48-50942.52-1АМФИ64-73943.52-1Антигенный индекс19-26944.52-1Антигенный индекс30-35945.52-1Антигенный индекс42-52946.52-1Антигенный индекс57-86947.52-1Гидрофильность22-26948.52-1Гидрофильность30-35949.52-1Гидрофильность42-52950.52-1Гидрофильность57-71951.52-1Гидрофильность78-86952.69-1АМФИ25-27953.69-1АМФИ46-66954.69-1Антигенный индекс32-41955.69-1Антигенный индекс43-45956.69-1Антигенный индекс71-78957.69-1Гидрофильность32-38958.69-1Гидрофильность71-78959.69аАМФИ25-27960.б9аАМФИ46-66961.69аАнтигенный индекс32-41962.69аАнтигенный индекс43-46963.69аАнтигенный индекс71-78964.69аГидрофильность32-38965.69аГидрофильность71-78966.77-1АМФИ12-16967.77-1АМФИ23-33

968.77-1АМФИ35-42969.77-1АМФИ51-57970.77-1АМФИ67-70971.77-1АМФИ73-79972.77-1АМФИ122-124973.77-1АМФИ130-134974.77-1АМФИ165-178975.77-1АМФИ191-211976.77-1Антигенный индекс22-31977.77-1Антигенный индекс34-44978.77-1Антигенный индекс80-94979.77-1Антигенный индекс101-104980.77-1Антигенный индекс155-158981.77-1Антигенный индекс167-181982.77-1Гидрофильность22-28983.77-1Гидрофильность38-44984.77-1Гидрофильность80-92985.77-1Гидрофильность171-178986.77аАМФИ8-15987.77аАМФИ24-30988.77аАМФИ40-43989.77аАМФИ46-52990.77аАМФИ95-97991.77аАМФИ103-107992.77аАМФИ114-125993.77аАМФИ144-151994.77аАМФИ154-156995.77аАМФИ166-184996.77аАнтигенный индекс7-17997.77аАнтигенный индекс53-67998.77аАнтигенный индекс74-77999.77аАнтигенный индекс128-1311000.77аАнтигенный индекс140-154

1001.77аГидрофильность11-171002.77аГидрофильность53-651003.77аГидрофильность141-1511004.81-1АМФИ30-401005.81-1АМФИ54-561006.81-1АМФИ60-631007.81-1АМФИ76-931008.81-1АМФИ96-1011009.81-1АМФИ104-4061010.81-1АМФИ118-1261011.81-1АМФИ190-2051012.81-1АМФИ230-2331013.81-1АМФИ239-2421014.81-1АМФИ256-2581015.81-1АМФИ264-2841016.81-1АМФИ290-2971017.81-1АМФИ317-3261018.81-1АМФИ388-3961019.81-1АМФИ403-4141020.81-1АМФИ458-4631021.81-1АМФИ476-4801022.81-1Антигенный индекс1-41023.81-1Антигенный индекс35-381024.81-1Антигенный индекс86-891025.81-1Антигенный индекс95-981026.81-1Антигенный индекс100-1031027.81-1Антигенный индекс128-1361028.81-1Антигенный индекс154-1741029.81-1Антигенный индекс197-2111030.81-1Антигенный индекс220-2261031.81-1Антигенный индекс232-2401032.81-1Антигенный индекс244-2491033.81-1Антигенный индекс251-253

1034.81-1Антигенный индекс255-2581035.81-1Антигенный индекс276-2901036.81-1Антигенный индекс292-3011037.81-1Антигенный индекс307-3121038.81-1Антигенный индекс318-3231039.81-1Антигенный индекс334-3451040.81-1Антигенный индекс352-3581041.81-1Антигенный индекс364-3721042.81-1Антигенный индекс376-3841043.81-1Антигенный индекс387-4011044.81-1Антигенный индекс409-4171045.81-1Антигенный индекс423-4441046.81-1Антигенный индекс452-4591047.81-1Антигенный индекс486-4881048.81-1Антигенный индекс490-4991049.81-1Антигенный индекс507-5201050.81-1Гидрофильность1-41051.81-1Гидрофильность35-381052.81-1Гидрофильность95-981053.81-1Гидрофильность128-1361054.81-1Гидрофильность154-1641055.81-1Гидрофильность166-1721056.81-1Гидрофильность202-2091057.81-1Гидрофильность220-2261058.81-1Гидрофильность234-2381059.81-1Гидрофильность245-2491060.81-1Гидрофильность251-2531061.81-1Гидрофильность284-2871062.81-1Гидрофильность292-2991063.81-1Гидрофильность307-3121064.81-1Гидрофильность321-3231065.81-1Гидрофильность338-3451066.81-1Гидрофильность366-368

1067.81-1Гидрофильность378-3841068.81-1Гидрофильность387-4011069.81-1Гидрофильность409-4151070.81-1Гидрофильность453-4591071.81-1Гидрофильность493-4991072.81-1Гидрофильность507-5091073.81-1Гидрофильность512-5181074..82аАМФИ36-401075.82аАМФИ95-1111076.82аАМФИ117-1321077.82аАМФИ135-1371078.82аАМФИ160-1741079.82аАМФИ183-1871080.82аАнтигенный индекс2-81081.82аАнтигенный индекс56-601082.82аАнтигенный индекс90-971083.82аАнтигенный индекс104-1111084.82аАнтигенный индекс114-1371085.82аАнтигенный индекс141-1511086.82аАнтигенный индекс170-1751087.82аАнтигенный индекс180-1881088.82аАнтигенный индекс194-2011089.82аАнтигенный индекс206-2091090.82аАнтигенный индекс216-2181091.82аГидрофильность2-81092.82аГидрофильность56-601093.82аГидрофильность90-971094.82аГидрофильность105-1081095.82аГидрофильность120-1281096.82аГидрофильность130-1341097.82аГидрофильность141-1511098.82аГидрофильность170-1751099.82аГидрофильность186-188

1100.82аГидрофильность195-2011101.82аГидрофильность206-2091102.112-1АМФИ6-81103.112-1АМФИ12-341104.112-1АМФИ45-531105.112-1АМФИ63-651106.112-1АМФИ70-821107.112-1АМФИ84-861108.112-1АМФИ107-1091109.112-1АМФИ116-1231110.112-1АМФИ183-1861111.112-1АМФИ244-2461112.112-1АМФИ248-2581113.112-1АМФИ280-2821114.112-1АМФИ302-3131115.112-1Антигенный индекс35-441116.112-1Антигенный индекс57-611117.112-1Антигенный индекс81-841118.112-1Антигенный индекс91-981119.112-1Антигенный индекс125-1331120.112-1Антигенный индекс140-1471121.112-1Антигенный индекс149-1591122.112-1Антигенный индекс161-1651123.112-1Антигенный индекс174-1901124.112-1Антигенный индекс192-2001125.112-1Антигенный индекс202-2161126.112-1Антигенный индекс218-2241127.112-1Антигенный индекс228-2321128.112-1Антигенный индекс239-2441129.112-1Антигенный индекс255-2631130.112-1Антигенный индекс290-3001131.112-1Гидрофильность38-401132.112-1Гидрофильность57-61

1133.112-1Гидрофильность92-981134.112-1Гидрофильность125-1331135.112-1Гидрофильность141-1431136.112-1Гидрофильность150-1591137.112-1Гидрофильность161-1641138.112-1Гидрофильность175-1901139.112-1Гидрофильность203-2161140.112-1Гидрофильность218-2241141.112-1Гидрофильность228-2321142.112-1Гидрофильность239-2441143.112-1Гидрофильность259-2611144.112-1Гидрофильность293-2971145.112аАМФИ6-81146.112аАМФИ12-341147.112аАМФИ47-541148.112аАМФИ63-651149.112аАМФИ69-721150.112аАМФИ84-861151.112аАМФИ89-911152.112аАМФИ107-1091153.112аАМФИ116-1231154.112аАМФИ183-1861155.112аАМФИ244-2461156.112аАМФИ248-2581157.112аАМФИ280-2821158.112аАМФИ302-3101159.112аАМФИ321-3361160.112аАнтигенный индекс35-441161.112аАнтигенный индекс57-611162.112аАнтигенный индекс81-841163.112аАнтигенный индекс91-981164.112аАнтигенный индекс125-1331165.112аАнтигенный индекс140-147

1166.112аАнтигенный индекс150-1581167.112аАнтигенный индекс161-1641168.112аАнтигенный индекс174-1901169.112аАнтигенный индекс194-2001170.112аАнтигенный индекс202-2161171.112аАнтигенный индекс218-2201172.112аАнтигенный индекс222-2241173.112аАнтигенный индекс228-2321174.112аАнтигенный индекс239-2441175.112аАнтигенный индекс256-2631176.112аАнтигенный индекс290-3011177.112аАнтигенный индекс351-3561178.112аГидрофильность38-401179.112аГидрофильность57-611180.112аГидрофильность93-981181.112аГидрофильность125-1331182.112аГидрофильность141-1431183.112аГидрофильность150-1551184.112аГидрофильность161-1641185.112аГидрофильность175-1901186.112аГидрофильность203-2161187.112аГидрофильность218-2201188.112аГидрофильность222-2241189.112аГидрофильность228-2321190.112аГидрофильность239-2441191.112аГидрофильность259-2611192.112аГидрофильность293-2971193.112аГидрофильность351-3561194.114-1АМФИ45-541195.114-1АМФИ154-1601196.114-1АМФИ182-1901197.114-1АМФИ224-2261198.114-1АМФИ229-233

1199.114-1АМФИ285-2871200.114-1АМФИ303-3101201.114-1АМФИ321-3321202.114-1АМФИ392-3981203.114-1АМФИ413-4161204.114-1АМФИ450-4521205.114-1АМФИ477-4871206.114-1АМФИ506-5091207.114-1АМФИ525-5291208.114-1АМФИ565-5671209.114-1АМФИ614-6211210.114-1АМФИ631-6351211.114-1АМФИ770-7741212.114-1АМФИ810-8131213.114-1АМФИ847-8491214.114-1АМФИ851-8531215.114-1АМФИ875-8791216.114-1АМФИ951-9561217.114-1АМФИ975-9801218.114-1АМФИ1034-10361219.114-1АМФИ1048-10511220.114-1АМФИ1073-10811221.114-1АМФИ1086-10901222.114-1АМФИ1095-11021223.114-1АМФИ1111-11151224.114-1АМФИ1163-11671225.114-1АМФИ1242-12451226.114-1АМФИ1275-12811227.114-1АМФИ1312-13171228.114-1АМФИ1338-13471229.114-1АМФИ1349-13551230.114-1АМФИ1357-13601231.114-1АМФИ1362-1365

1232.114-1АМФИ1376-13981233.114-1АМФИ1418-14211234.114-1АМФИ1425-14291235.114-1АМФИ1468-14731236.114-1АМФИ1476-14851237.114-1АМФИ1495-15151238.114-1АМФИ1518-15261239.114-1АМФИ1546-15551240.114-1АМФИ1557-15591241.114-1АМФИ1580-15831242.114-1АМФИ1585-15971243.114-1АМФИ1604-16061244.114-1АМФИ1613-16241245.114-1АМФИ1626-16301246.114-1АМФИ1638-16441247.114-1АМФИ1655-16601248.114-1АМФИ1662-16641249.114-1АМФИ1672-16741250.114-1АМФИ1677-16791251.114-1АМФИ1691-16941252.114-1АМФИ1713-17161253.114-1АМФИ1719-17291254.114-1АМФИ1735-17381255.114-1АМФИ1753-17571256.114-1АМФИ1772-17781257.114-1АМФИ1790-17921258.114-1АМФИ1817-18261259.114-1АМФИ1828-18321260.114-1АМФИ1840-18511261.114-1АМФИ1854-18561262.114-1АМФИ1871-18811263.114-1АМФИ1883-18961264.114-1АМФИ1922-1927

1265.114-1АМФИ1934-19461266.114-1АМФИ1950-19551267.114-1АМФИ1957-19641268.114-1Антигенный индекс1-61269.114-1Антигенный индекс10-161270.114-1Антигенный индекс23-371271.114-1Антигенный индекс41-551272.114-1Антигенный индекс75-851273.114-1Антигенный индекс91-971274.114-1Антигенный индекс102-1401275.114-1Антигенный индекс147-1561276.114-1Антигенный индекс161-1681277.114-1Антигенный индекс172-1741278.114-1Антигенный индекс181-1891279.114-1Антигенный индекс196-2031280.114-1Антигенный индекс208-2131281.114-1Антигенный индекс220-2291282.114-1Антигенный индекс242-2481283.114-1Антигенный индекс251-2661284.114-1Антигенный индекс268-276.1285.114-1Антигенный индекс295-307,1286.114-1Антигенный индекс309-3121287.114-1Антигенный индекс318-3401288.114-1Антигенный индекс345-3511289.114-1Антигенный индекс357-3661290.114-1Антигенный индекс371-3811291.114-1Антигенный индекс385-3921292.114-1Антигенный индекс404-4171293.114-1Антигенный индекс419-4321294.114-1Антигенный индекс440-4561295.114-1Антигенный индекс464-4681296.114-1Антигенный индекс473-4801297.114-1Антигенный индекс482-488

1298.114-1Антигенный индекс496-5111299.114-1Антигенный индекс515-5301300.114-1Антигенный индекс535-5491301.114-1Антигенный индекс555-5601302.114-1Антигенный индекс564-5821303.114-1Антигенный индекс588-5961304.114-1Антигенный индекс602-6151305.114-1Антигенный индекс617-6201306.114-1Анти генный индекс622-6241307.114-1Антигенный индекс628-6321308.114-1Антигенный индекс637-6401309.114-1Антигенный индекс647-6541310.114-1Антигенный индекс660-6661311.114-1Антигенный индекс668-6881312.114-1Антигенный индекс696-7251313.114-1Антигенный индекс730-7331314.114-1Антигенный индекс738-7551315.114-1Антигенный индекс760-7661316.114-1Антигенный индекс779-7831317.114-1Антигенный индекс786-7991318.114-1Антигенный индекс807-8091319.114-1Антигенный индекс811-8191320.114-1Антигенный индекс831-8391321.114-1Антигенный индекс845-8571322.114-1Антигенный индекс860-8621323.114-1Антигенный индекс864-8681324.114-1Антигенный индекс872-8791325.114-1Антигенный индекс883-8911326.114-1Антигенный индекс893-9031327.114-1Антигенный индекс908-9161328.114-1Антигенный индекс919-9361329.114-1Антигенный индекс941-9471330.114-1Антигенный индекс950-956

1331.114-1Антигенный индекс959-9761332.114-1Антигенный индекс979-9911333.114-1Антигенный индекс993-10001334.114-1Антигенный индекс1007-10221335.114-1Антигенный индекс1041-10531336.114-1Антигенный индекс1062-10681337.114-1Антигенный индекс1075-11081338.114-1Антигенный индекс1115-11211339.114-1Антигенный индекс1126-11451340.114-1Антигенный индекс1148-11521341.114-1Антигенный индекс1156-11781342.114-1Антигенный индекс1195-12061343.114-1Антигенный индекс1208-12121344.114-1Антигенный индекс1217-12431345.114-1Антигенный индекс1246-12631346.114-1Антигенный индекс1271-12821347.114-1Антигенный индекс1284-12881348.114-1Антигенный индекс1292-12951349.114-1Антигенный индекс1299-13071350.114-1Антигенный индекс1318-13281351.114-1Антигенный индекс1330-13401352.114-1Антигенный индекс1344-13591353.114-1Антигенный индекс1367-13841354.114-1Антигенный индекс1395-13991355.114-1Антигенный индекс1405-14171356.114-1Антигенный индекс1445-14491357.114-1Антигенный индекс1491-15101358.114-1Антигенный индекс1526-15291359.114-1Антигенный индекс1532-15481360.114-1Антигенный индекс1552-15561361.114-1Антигенный индекс1560-15621362.114-1Антигенный индекс1573-15831363.114-1Антигенный индекс1594-1611

1364.114-1Антигенный индекс1627-16351365.114-1Антигенный индекс1643-16451366.114-1Антигенный индекс1647-16651367.114-1Антигенный индекс1680-16861368.114-1Антигенный индекс1700-17221369.114-1Антигенный индекс1724-17261370.114-1Антигенный индекс1739-17461371.114-1Антигенный индекс1752-17571372.114-1Антигенный индекс1780-17831373.114-1Антигенный индекс1791-17951374.114-1Антигенный индекс1804-18081375.114-1Антигенный индекс1829-18351376.114-1Антигенный индекс1841-18591377.114-1Антигенный индекс1867-18861378.114-1Антигенный индекс1897-19031379.114-1Антигенный индекс1908-19121380.114-1Антигенный индекс1917-19221381.114-1Антигенный индекс1926-19341382.114-1Антигенный индекс1938-19451383.114-1Антигенный индекс1947-19571384.114-1Антигенный индекс1961-19681385.114-1Антигенный индекс1974-19781386.114-1Гидрофильность4-61387.114-1Гидрофильность12-151388.114-1Гидрофильность23-341389.114-1Гидрофильность43-551390.114-1Гидрофильность76-851391.114-1Гидрофильность104-1101392.114-1Гидрофильность118-1231393.114-1Гидрофильность127-1321394.114-1Гидрофильность147-1541395.114-1Гидрофильность163-1671396.114-1Гидрофильность185-187

1397.114-1Гидрофильность197-2031398.114-1Гидрофильность208-2111399.114-1Гидрофильность221-2271400.114-1Гидрофильность243-2451401.114-1Гидрофильность253-2611402.114-1Гидрофильность263-2661403.114-1Гидрофильность270-2721404.114-1Гидрофильность295-3011405.114-1Гидрофильность309-3121406.114-1Гидрофильность320-3281407.114-1Гидрофильность332-3371408.114-1Гидрофильность345-3511409.114-1Гидрофильность360-3661410.114-1Гидрофильность371-3781411.114-1Гидрофильность387-3921412.114-1Гидрофильность404-4151413.114-1Гидрофильность419-4321414.114-1Гидрофильность441-4501415.114-1Гидрофильность452-4561416.114-1Гидрофильность473-4801417.114-1Гидрофильность482-4851418.114-1Гидрофильность496-5001419.114-1Гидрофильность504-5091420.114-1Гидрофильность515-5201421.114-1Гидрофильность536-5491422.114-1Гидрофильность555-5601423.114-1Гидрофильность565-5681424.114-1Гидрофильность570-5791425.114-1Гидрофильность589-5941426.114-1Гидрофильность602-6041427.114-1Гидрофильность609-6151428.114-1Гидрофильность617-6201429.114-1Гидрофильность660-666

1430.114-1Гидрофильность668-6801431.114-1Гидрофильность684-6861432.114-1Гидрофильность699-7081433.114-1Гидрофильность715-7251434.114-1Гидрофильность730-7331435.114-1Гидрофильность738-7441436.114-1Гидрофильность746-7541437.114-1Гидрофильность760-7661438.114-1Гидрофильность789-7931439.114-1Гидрофильность816-8181440.114-1Гидрофильность831-8361441.114-1Гидрофильность845-8571442.114-1Гидрофильность860-8621443.114-1Гидрофильность864-8661444.114-1Гидрофильность873-8791445.114-1Гидрофильность883-8851446.114-1Гидрофильность887-8891447.114-1Гидрофильность896-8991448.114-1Гидрофильность908-9161449.114-1Гидрофильность919-9321450.114-1Гид рофил ьность941-9471451.114-1Гидрофильность962-9751452.114-1Гидрофильность979-9891453.114-1Гидрофильность993-10001454.114-1Гидрофильность1007-10221455.114-1Гидрофильность1041-10431456.114-1Гидрофильность1045-10531457.114-1Гидрофильность1062-10681458.114-1Гидрофильность1075-10781459.114-1Гидрофильность1080-10871460.114-1Гидрофильность1089-11041461.114-1Гидрофильность1115-11211462.114-1Гидрофильность1126-1141