АНТИГЕНЫ NEISSERIA MENINGITIDIS Российский патент 2009 года по МПК C07K14/22 C07K16/12 C12N15/31 A61K39/395 C12R1/36 A61P31/04 

Изобретение относится к антигенам, происходящим от бактерии Neisseria meningitidis.

Предпосылки создания изобретения

Neisseria meningitidis представляет собой неподвижный грамотрицательный диплоккоковый патоген человека. Он образует колонии в глотке, вызывая менингит, а, в некоторых случаях, сепсис при отсутствии менингита. Эта бактерия является близкородственной бактерии N. gonorrhoeae, хотя имеется один отличительный признак, который позволяет четко дифференцировать менингококк от гонококка и который заключается в том, что все патогенные менингококки имеют полисахаридную капсулу.

N. meningitidis вызывает как эндемические, так и эпидемические заболевания. В Соединенных Штатах заболеваемость составляет 0,6-1 случаев на 100000 человек в год, а во время эпидемий она может быть гораздо выше (см. Lieberman et al., (1996) Safety and Immunogenicity of a Serogroups A/C Neisseria meningitidis Oligosaccharide-Protein Conjugate Vaccine in Young Children. JAMA 275(19):1499-1503; Schuchat et al. (1997) Bacterial Meningitidis in the United States in 1995. N. Engl. J. Med. 337(14):970-976). В развивающихся странах частота эндемических заболеваний гораздо выше, а во время эпидемий заболеваемость может достигать 500 случаев на 100000 человек в год. Смертность от этого заболевания чрезвычайно высока, например, в Соединенных Штатах, она составляет 10-20%, а в развивающихся странах еще выше. После получения конъюгатной вакцины против Haemophilus influenzae, N. meningitidis является главным возбудителем бактериального менингита во всех возрастных группах в Соединенных Штатах (Schuchat et al., (1997) см.выше).

Исходя из наличия инкапсулированного полисахарида у данного микроорганизма, были идентифицированы 12 серологических групп N.meningitidis. Микроорганизм Группы А является патогеном, наиболее часто приводящим к эпидемическим заболеваниям в регионах Африки, простирающихся ниже Сахары. Серологические Группы В и С ответственны за подавляющее большинство случаев возникновения данных заболеваний в Соединенных Штатах и в большинстве развитых стран. В остальных случаях возникновения этого заболевания в Соединенных Штатах и в развитых странах ответственны серологические группы W135 и Y. Используемая в настоящее время менингококковая вакцина представляет собой тетравалентную полисахаридную вакцину, представленную серологическими группами А, С, Y и W135. Несмотря на эффективность этой вакцины для подростков и взрослых, она индуцирует недостаточный иммунный ответ и непродолжительное время действия, а поэтому, не может быть использована для детей [см., например, Morbidity and Mortality weekly report, Vol. 46, № RR-5 (1997)]. Это обусловлено тем, что полисахариды представляют собой Т-клеточно-независимые антигены, индуцирующие слабый иммунный ответ, который не может быть усилен путем проведения повторной иммунизации. После успешного проведения вакцинации от H. influenzae, были разработаны конъюгатные вакцины против серологических групп А и С, которые были использованы на заключительном этапе клинического испытания (Zollinger WD "New and Improved Vaccines Against Meningococcal Disease" in: New Generation Vaccines, supra, pp 469-488; Lieberman et al., (1996) supra; Costantino et al., (1992) Development and phase I clinical testing of a conjugate vaccine against meningococcus A и С. Vaccine 10:691-698).

Однако использование Meningococcus В связано с определенными проблемами. Этот используемый в настоящее время серотип ответственен приблизительно за 50% всех заболеваний менингита в Соединенных Штатах, в Европе и в Южной Америке. Метод на основе полисахарида не может быть использован, поскольку капсулярный полисахарид menB является полимером α(2-8)-связанной N-ацетилнейраминовой кислоты, которая также присутствует в тканях млекопитающих. Это приводит к толерантности к данному антигену; и действительно, при вырабатывании иммунного ответа, он может действовать против самого себя, а это является нежелательным фактором. Во избежание индуцирования аутоиммунного ответа и в целях индуцирования защитного иммунного ответа, капсулярный полисахарид был, например, химически модифицирован так, что в нем N-ацетильные группы были заменены N-пропионильными группами, но при этом, специфическая антигенность оставалась неизмененной (Romero & Outschoorn (1994) Current status of Meningococcal group B vaccine candidates: capsular or non-capsular? Clin. Microbiol. Rev. 7(4):559-575).

В качестве вакцин, альтернативных вакцинам на основе menB, были использованы комплексные смеси внешних мембранных белков (OMPs), содержащих один ОМР или ОМР, обогащенный поринами, либо не содержащих ОМР класса 4, которые, очевидно, индуцируют антитела, блокирующие бактерицидную активность. Этот подход позволяет продуцировать вакцины, которые еще недостаточно охарактеризованы. Они способны обеспечивать защиту от гомологичного штамма, но в основном, они не эффективны в том случае, когда присутствует множество антигенных вариантов внешних мембранных белков. Для преодоления антигенной изменчивости были сконструированы мультивалентные вакцины, содержащие вплоть до девяти различных поринов (см. например, Poolman J.T. (1992) Development of a meningococcal vaccine. Infect. Agents Dis. 4:13-28). Другими белками, используемыми в вакцинах на основе внешних мембран, были белки ора и орс, но ни один из этих вариантов не позволял преодолеть антигенную изменчивость (см. например, Ala' Aldeen & Borriello (1996) The meningococcal transferrin-binding proteins 1 and 2 are both surface exposed and generated bactericidal antibodies capable of killing homologous and heterologous strains. Vaccine 14(1):49-53).

Существуют некоторые данные о последовательностях для менингококковых и гонококковых генов и белков (например, EP-A-0467714, WO96/29412), но эти данные являются неполными. Выявление других последовательностей дает возможность идентифицировать секретированный белок или белок, экспонированный на поверхности, которые, предположительно, являются мишенями для иммунной системы и которые не являются антигенно вариабельными. Например, некоторые из этих идентифицированных белков могут быть компонентами эффективных вакцин против meningococcus B, некоторые из них могут быть компонентами вакцин против всех серотипов менингококков, а другие белки могут быть компонентами вакцин против всех патогенных Neisseriae.

Настоящее изобретение

Настоящее изобретение относится к белкам, содержащим аминокислотные последовательности N.meningitidis, описанные в примерах.

Настоящее изобретение также относится к белкам, содержащим последовательности, которые являются гомологичными (т.е., имеющие идентичные последовательности) аминокислотным последовательностям N.meningitidis, описанным в примерах. В зависимости от конкретной последовательности, степень идентичности последовательности предпочтительно выше 50% (например, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% или более). Такими гомологичными белками являются мутанты и аллельные варианты последовательностей, описанных в примерах. Обычно, считается, что идентичность двух белков, составляющая 50% или более, является показателем их функциональной эквивалентности. Идентичность белков предпочтительно определяют с помощью алгоритма поиска гомологии Smith-Waterman, выполняемого в программе MPSRCH (Oxford Molecular) с проведением поиска аффинных брешей с параметрами: "штраф на брешь-пропуск" =12 и "штраф на брешь-удлинение"=1.

Настоящее изобретение также относится к белкам, содержащим фрагменты аминокислотных последовательностей N. meningitidis, описанных в примерах. Эти фрагменты могут содержать, по крайней мере, n следующих подряд друг за другом аминокислот из этих последовательностей, и, в зависимости от конкретной последовательности, n равно 7 или более (например, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 или более). Предпочтительно, чтобы фрагменты содержали эпитоп от этой последовательности.

Само собой разумеется, что белки настоящего изобретения могут быть получены различными способами (например, путем экспрессии рекомбинантных последовательностей, очистки из клеточных культур, химического синтеза и т.п.) и в различных формах (например, в нативной, в гибридной форме и т.п.). Предпочтительно, эти белки получают, в основном, в чистом виде (т.е., в форме, в основном, не содержащей других белков N. meningitidis или белков клеток хозяина).

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к антителам, которые связываются с этими белками. Этими антителами могут быть поликлональные или моноклональные антитела, которые могут быть получены любыми подходящими способами.

В еще одном своем аспекте, настоящее изобретение относится к нуклеиновой кислоте, содержащей нуклеотидные последовательности N. meningitidis, описанные в примерах. Кроме того, настоящее изобретение относится к нуклеиновой кислоте, содержащей последовательности, гомологичные (т.е., имеющие идентичность в последовательности) нуклеотидным последовательностям N. meningitidis, описанным в примерах.

Кроме того, настоящее изобретение относится к нуклеиновой кислоте, которая может гибридизоваться с нуклеиновой кислотой N. meningitidis, описанной в примерах, предпочтительно, в условиях "высокой жесткости" (например, при 65°С в растворе 0,1 × SSC, 0,5% ДСН).

Настоящее изобретение также относится к нуклеиновой кислоте, содержащей фрагменты этих последовательностей. Эти фрагменты могут содержать, по крайней мере, n следующих подряд друг за другом нуклеотидов от последовательностей N. meningitidis и в зависимости от конкретной последовательности, n равно 10 или выше (например, 12, 14, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40 или более).

В еще одном своем аспекте, настоящее изобретение относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей белки и фрагменты белков настоящего изобретения.

Следует также отметить, что настоящее изобретение относится к нуклеиновой кислоте, содержащей последовательности, комплементарные последовательностям, описанным выше (например, для получения антисмысловой последовательности или для зондирования).

Нуклеиновая кислота настоящего изобретения может быть получена различными способами (например, посредством химического синтеза, из геномной или кДНК-библиотек, из самого микроорганизма и т.п.) и может иметь различные формы (например, одноцепочечную, двухцепочечную, векторы, зонды и т.п.).

Кроме того, термин "нуклеиновая кислота" означает ДНК и РНК, а также их аналоги, такие как аналоги, содержащие модифицированные остовы, а также пептидные нуклеиновые кислоты (ПНК) и т.п.

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к векторам, содержащим нуклеотидные последовательности настоящего изобретения (например, экспрессирующие векторы) и клетки-хозяева, трансформированные такими векторами.

В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к композициям, содержащим белок, антитело, и/или нуклеиновую кислоту настоящего изобретения. Эти композиции могут быть получены, например, в виде вакцин или в виде диагностических реагентов, либо в виде иммуногенных композиций.

Настоящее изобретение также относится к нуклеиновой кислоте, белку или антителу настоящего изобретения для использования в качестве лекарственных препаратов (например, в качестве вакцин) или в качестве диагностических реагентов. Настоящее изобретение также относится к использованию нуклеиновой кислоты, белка или антитела настоящего изобретения в целях изготовления (i) лекарственного средства для лечения или предупреждения инфекции, вызываемой бактериями Neisserial; (ii) диагностического реагента для обнаружения присутствия бактерии Neisserial или антител, вырабатываемых против бактерии Neisserial; и/или (iii) реагента, который может способствовать продуцированию антител против бактерии Neisserial. Указанными бактериями Neisserial могут быть бактерии любого вида или штамма (такие как, N.gonorrhoeae), а предпочтительно, N. meningitidis, в частности, штамм А, штамм В или штамм С.

Настоящее изобретение также относится к способу лечения пациента, предусматривающему введение пациенту терапевтически эффективного количества нуклеиновой кислоты, белка и/или антитела настоящего изобретения.

В соответствии с другим своим аспектом, настоящее изобретение относится к различным способам.

Настоящее изобретение относится к способу продуцирования белков, предусматривающему проведение стадии культивирования клетки-хозяина настоящего изобретения в условиях, благоприятствующих индуцированию экспрессии белка.

Настоящее изобретение относится к способу продуцирования белка или нуклеиновой кислоты, где этот белок или нуклеиновая кислота синтезируются по частям или целиком с использованием химических методов.

Настоящее изобретение относится к способу обнаружения полинуклеотидов, предусматривающему проведение стадий: (а) контактирования нуклеотидного зонда настоящего изобретения с биологическим образцом в условиях гибридизации с образованием дуплексов и (b) обнаружения этих дуплексов.

Настоящее изобретение относится к способу обнаружения белков, предусматривающему проведение стадий: (а) контактирования антитела настоящего изобретения с биологическим образцом в условиях, благоприятствующих образованию комплексов антитело-антиген; и (b) обнаружения этих комплексов.

В отличие от последовательностей, описанных в РСТ/IB98/01665, последовательности, описанные в настоящей заявке, очевидно, не имеют какой-либо значительной гомологии с последовательностями в N.gonorrhoeae. В соответствии с этим, последовательности настоящего изобретения также могут быть использованы в целях получения реагентов для дифференциации N. meningitidis от N.gonorrhoeae. Ниже приводится краткое описание стандартной техники и методов, которые могут быть использованы для осуществления настоящего изобретения (например, для использования описанных последовательностей в целях вакцинации или в диагностических целях). Это краткое описание не должно рассматриваться как ограничение изобретения и представляет собой лишь примеры, которые могут быть использованы, но которые не являются необходимыми.

Общее описание

Для осуществления настоящего изобретения, если это не оговорено особо, могут быть использованы стандартные методы молекулярной биологии, микробиологии, рекомбинантных ДНК и иммунологии, известные специалистам. Такие методы полностью описаны в литературе, например, Sambrook et al., (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second edition, (1989); DNA Cloning, Volumes I and ii (D.N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait ed, 1984); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. 1984); Transcription and Translation (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. 1984); Animal Cell Culture (R.I. Freshney ed. 1986); Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, 1986); B.Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); the Methods in Enzymology series (Academic Press, Inc.), especially volumes 154 & 155; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.H. Miller and M.P. Calos eds. 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Mayer and Walker, eds. (1987), Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, London); Scopes, (1987) Protein Purification: Principles and Practice, Second Edition (Springer-Verlag, N.Y.) and Handbook of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D.M. Weir and C.C. Blackwell eds. 1986).

В этом описании используются стандартные сокращения для нуклеотидов и аминокислот.

Все публикации, патенты и патентные заявки во всей своей полноте вводятся в настоящее описание посредством ссылки. В частности, настоящее описание включает содержание заявок на патенты Великобритании 9800760.2, 9819015.0 и 9822143.5.

Определения терминов

Термин "композиция, содержащая Х" означает "композицию, в основном, не содержащую Y", если в этой композиции, содержание Х составляет, по крайней мере, 85% по общей массе Х+Y. Предпочтительно, если в данной композиции, Х составляет, по крайней мере, около 90% по общей массе Х+Y, а более предпочтительно, по крайней мере, 95% или даже 99 мас.%.

Термин "содержащий" означает "включающий", а также "заключающий в себя", например, композиция, "содержащая" Х, может состоять исключительно из Х, либо она, помимо Х, может содержать еще какой-либо компонент, такой как, Х+Y.

Термин "гетерологичный" означает два биологических компонента, которые вместе в природе не обнаружены. Этими компонентами могут быть клетки-хозяева, гены или регуляторные области, такие как промоторы. Хотя эти гетерологичные компоненты в сочетании друг с другом не обнаруживаются в природе, однако, они могут функционировать вместе тогда, когда промотор, гетерологичный гену, функционально присоединен к этому гену. В другом примере, последовательность Neisserial является гетерологичной последовательности клетки-хозяина мыши. Другими примерами могут быть два эпитопа от одинаковых или различных белков, которые были ассоциированы в один белок с образованием такой структуры, которая не была обнаружена в природе.

Термин "сайт инициации репликации" означает полинуклеотидную последовательность, которая инициирует и регулирует репликацию полинуклеотидов, такую как, экспрессирующий вектор. Сайт инициации репликации ведет себя как автономная единица репликации полинуклеотидов внутри клетки, способной к репликации, под своим собственным контролем. Сайт инициации репликации может быть необходим вектору для его репликации в конкретной клетке-хозяине. С помощью некоторых сайтов инициации репликации, экспрессирующий вектор может быть репродуцирован с большим числом копий в присутствии соответствующих белков внутри этой клетки. Примерами сайтов инициации репликации могут служить автономно реплицирующиеся последовательности, которые являются эффективными в дрожжах; и вирусный Т-антиген, эффективный в клетках COS-7.

Термин "мутантная" последовательность означает ДНК-, РНК- или аминокислотную последовательность, отличающуюся от нативной или описанной последовательности, но имеющей идентичные с ней последовательности. В зависимости от конкретной последовательности, степень идентичности нативной или описанной последовательности и мутантной последовательности предпочтительно превышает 50% (например, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% или выше, как было вычислено с использованием алгоритма Smith-Waterman, описанного выше). Используемый в настоящем описании термин "аллельный вариант" молекулы нуклеиновной кислоты или области, для которой была получена нуклеотидная последовательность, означает молекулу нуклеиновой кислоты или область, которая находится, в основном, в том же самом локусе в геноме другого или второго изолята, и которая, вследствие природных изменений, вызванных, например, мутацией или рекомбинацией, имеет аналогичную, но не идентичную нуклеотидную последовательность. Аллельный вариант кодирующей области обычно кодирует белок, имеющий активность, аналогичную активности белка, кодируемого геном, с которым этот белок сравнивается. Аллельный вариант может также содержать альтерацию в 5′- или 3′-нетранслируемых областях гена, таких как регуляторные контрольные области (см. например, патент США № 5753235).

Экспрессирующие системы

Нуклеотидные последовательности Neisserial могут быть экспрессированы в ряде различных экспрессирующих систем; например, такими экспрессирующими системами являются клетки млекопитающих, бакуловирусы, растения, бактерии и дрожжи.

i. Системы млекопитающих:

Экспрессирующие системы млекопитающих хорошо известны специалистам. Промотором млекопитающих является любая ДНК-последовательность, способная связываться с РНК-полимеразой млекопитающих и инициировать прямую транскрипцию (в направлении 5′ → 3′) кодирующей последовательности (например, структурного гена) с образованием мРНК. Промотор может иметь сайт инициации транскрипции, который обычно расположен с 5′-конца кодирующей последовательности, и ТАТА-бокс, который обычно расположен на 25-30 пар оснований (п.о.) выше (в направлении 5′ → 3′) от сайта инициации транскрипции. ТАТА-бокс, очевидно, обеспечивает ориентацию РНК-полимеразы II, инициируя синтез РНК в нужном сайте. Промотор млекопитающих может также содержать расположенный выше промоторный элемент, обычно локализованный в области 100-200 п.о., расположенной выше ТАТА-бокса. Локализованный выше промоторный элемент определяет степень инициации транскрипции и может действовать в любой ориентации [Sambrook et al.,(1989), "Expression of Cloned Genes in Mammalian Cells." In Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 nd ed.].

Вирусные гены млекопитающих часто являются высокоэкспрессируемыми и имеют широкий круг хозяев; a поэтому, последовательности, кодирующие вирусные гены млекопитающих, имеют особенно ценные промоторные последовательности. Примерами таких последовательностей являются: ранний промотор SV40, промотор LTR вируса опухоли молочной железы мыши, главный поздний промотор аденовируса (Ad MLP) и промотор вируса простого герпеса. Кроме того, последовательности, происходящие от невирусных генов, таких как ген металлотеионеина мыши, также имеют ценные промоторные последовательности. Экспрессия может быть конститутивной или регулируемой (индуцибельной) в зависимости от промотора, который может быть индуцирован глюкокортикоидом в восприимчивых к гормону клетках.

Присутствие энхансерного элемента (энхансера), объединенного с промоторными элементами, описанными выше, обычно способствует увеличению уровней экспрессии. Энхансер представляет собой регуляторную ДНК-последовательность, которая, при присоединении с гомологичными или гетерологичными промоторами, может стимулировать транскрипцию вплоть до в 1000 раз, при этом, синтез инициируется в нормальном старт-сайте РНК. Энхансеры также являются активными в том случае, если они расположены выше или ниже от сайта инициации транскрипции, либо в нормальной или во флип-ориентации, или на расстоянии более чем 1000 нуклеотидов от промотора [Maniatis et al., (1987) Science 236:1237; Alberts et al., (1989) Molecular Biology of the Cell, 2nd ed.]. Энхансерные элементы, происходящие от вирусов, могут быть особенно ценными, поскольку они обычно имеют широкий круг хозяев. Примерами таких энхансерных элементов являются энхансер раннего гена SV40 [Dijkema et al., (1985) EMBO J. 4:761] и энхансеры/промоторы, происходящие от длинного концевого повтора (LTR) вируса саркомы Рауса [Gorman et al., (1982b) Proc. Natl. Acad. Sci. 79:6777] и от цитомегаловируса человека [Boshart et al., (1985) Cell 41:521]. Помимо этого, некоторые энхансеры являются регулируемыми и становятся активными только в присутствии индуктора, такого как, гормон или ион металла [Sassone-Corsi and Borelli (1986) Trends Genet. 2:215; Maniatis et al., (1987) Science 236:1237].

ДНК-молекула может быть экспрессирована в клетках млекопитающих. Промоторная последовательность может быть непосредственно присоединена к ДНК-молекуле; причем, в этом случае, первая аминокислота у N-конца рекомбинантного белка всегда является метионином, который кодируется старт-кодоном ATG. Если это необходимо, то N-конец может быть отщеплен от белка путем in vitro-инкубирования с бромистым цианом.

Альтернативно, чужеродные белки могут быть также секретированы из клетки в культуральную среду путем создания химерных ДНК-молекул, кодирующих гибридный белок, который состоит из фрагмента лидерной последовательности, обеспечивающий секрецию чужеродного белка в клетках млекопитающих. При этом, предпочтительно, чтобы присутствовали сайты процессинга, локализованные между фрагментом лидерной последовательности и чужеродным геном, которые могут быть расщеплены либо in vivo, либо in vitro. Фрагмент лидерной последовательности обычно кодирует сигнальный пептид, состоящий из гидрофобных аминокислот, которые обеспечивают направленную секрецию белка из клетки. Примером лидерной последовательности, которая обеспечивает секрецию чужеродного белка в клетках млекопитающих, является трехкомпонентная лидерная последовательность аденовируса.

Обычно, последовательностями терминации транскрипции и последовательностями полиаденилирования, распознаваемыми клетками млекопитающих, являются регуляторные области, расположенные с 3′-конца от кодона терминации трансляции, и, таким образом, эти области, взятые вместе с промоторными элементами, фланкируют кодирующую последовательность. 3′-конец зрелой мРНК образуется благодаря сайт-специфическому посттранкрипционному расщеплению и полиаденилированию [Birnstiel et al., (1985) Cell, 41:349; Proudfoot and Whitelaw (1988) "Termination and 3′ end processing of eucaryotic RNA" в Transcription and splicing (ed. B.D. Hames and D.M. Glover); Proudfoot (1989) Trends Biochem. Sci. 14:105). Эти последовательности обеспечивают направленную транскрипцию мРНК, которая может транслироваться с образованием полипептида, кодируемого ДНК. Примерами сигналов терминации транскрипции/полиаденилирования являются сигналы, происходящие от SV40 [Sambrook et al., (1989), "Expression of cloned genes in cultured mammalian cells." In Molecular Cloning: A Laboratory Manual].

Обычно, вышеуказанные компоненты, содержащие промотор, сигнал полиаденилирования и последовательность терминации транскрипции, помещают вместе в экспрессирующие конструкции. Если необходимо, то в экспрессирующую конструкцию могут быть также введены энхансеры, интроны с донорными и акцепторными сайтами функционального сплайсинга и лидерные последовательности. Экспрессирующие конструкции часто встраивают в репликон, такой как внехромосомный элемент (например, плазмида), который может стабильно поддерживаться в хозяине, таком как клетки млекопитающих или бактерии. Системами репликации млекопитающих являются системы, происходящие от вирусов животных, для репликации которых требуются трансдействующие факторы. Так, например, плазмиды, содержащие системы репликации паповавирусов, таких как, SV40 [Gluzman (1981) Cell, 23: 175] или полиомавирусов, реплицируются с чрезвычайно высоким числом копий в присутствии соответствующего вирусного Т-антигена. Другими примерами репликонов млекопитающих являются репликоны, происходящие от коровьих папиломавирусов и вируса Эпштейна-Барра. Кроме того, этот репликон может иметь две системы репликации, что позволяет его использовать, например, для экспрессии в клетках млекопитающих и для клонирования и амплификации в прокариотическом хозяине. Примерами таких челночных векторов, происходящих от млекопитающего и от бактерии, являются рМТ2 [Kaufman et al., (1989) Mol. Cell Biol. 9: 946] и pHEBO [Shimizu et al., (1986) Mol. Cell Biol. 6:1074].

Используемый способ трансформации зависит от трансформируемого хозяина. Методы введения гетерологичных полинуклеотидов в клетки млекопитающих известны специалистам, и такими методами являются декстран-опосредованная трансфекция, преципитация фосфатом кальция, полибрен-опосредованная трансфекция, слияние протопластов, электропорация, инкапсулирование полинуклеотида(ов) в липосомы и прямая микроинъекция ДНК в ядра клеток.

Линии клеток млекопитающих, пригодных для использования в качестве хозяев, известны специалистам, и такими клетками являются многие иммортализованные линии клеток, депонированные в Американской коллекции типовых культур (АТСС), включая, но не ограничиваясь ими, клетки яичника китайского хомячка (СНО), клетки HeLa, клетки почки детеныша хомяка (ВНК), клетки почек обезьян (COS), клетки гепатоцеллюлярной карциномы человека (например, Нер G2) и ряд других клеточных линий.

(ii) Бакуловирусные системы

Полинуклеотид, кодирующий белок, может быть также встроен в подходящий экспрессирующий вектор насекомого и функционально присоединен к регуляторным элементам, присутствующим в этом векторе. При конструировании вектора используют известные методы. В основном, компонентами экспрессирующей системы являются вектор переноса, обычно, бактериальная плазмида, которая содержит как фрагмент бакуловирусного генома, так и стандартный сайт рестрикции для встраивания гетерологичного гена или генов, предназначенных для экспрессии; бакуловирус дикого типа, имеющий последовательность, гомологичную бакуловирус-специфическому фрагменту в векторе переноса (что позволяет осуществлять гомологичную рекомбинацию гетерологичного гена в бакуловирусном геноме); а также подходящие клетки-хозяева насекомых и среда для культивирования.

После встраивания ДНК-последовательности, кодирующей белок, в вектор переноса, этот вектор и вирусный геном дикого типа трансфецируют в клетки-хозяева насекомых, где указанный вектор и вирусный геном подвергаются рекомбинации. Упакованный рекомбинантный вирус экспрессируется, после чего рекомбинантные бляшки идентифицируют и очищают. Материалы и методы для экспрессирующих систем "бакуловирус/клетка насекомого" являются коммерчески доступными в виде набора, поставляемого, среди прочих, фирмой Invitrogen, San Diego CA (набор "MaxBac"). Эти методы известны специалистам и подробно описаны в работе Summers and Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No 1555 (1987) (цитируемой далее как "Summers and Smith").

Перед встраиванием ДНК-последовательности, кодирующей белок, в бакуловирусный геном, вышеописанные компоненты, включающие промотор, лидерную последовательность (если это необходимо), нужную кодирующую последовательность и последовательность терминации транскрипции, обычно объединяют с получением промежуточной конструкции для замены генов (вектор переноса). Эта конструкция может содержать единичный ген и функционально присоединенные регуляторные элементы; множество генов, каждый из которых имеет свой собственный набор функционально присоединенных регуляторных элементов; или множество генов, регулируемых теми же самыми регуляторными элементами. Промежуточные конструкции для замены генов часто встраиваются в репликон, такой как внехромосомный элемент (например, плазмиды), который может стабильно поддерживаться в хозяине, таком как бактерия. Этот репликон имеет систему репликации, которая позволяет его использовать для клонирования и амплификации в подходящем хозяине.

В настоящее время вектором переноса, наиболее часто используемым для введения чужеродных генов в AcNPV, является рАс373. Может быть также использовано множество других векторов, известных специалистам. Такими векторами являются, например, рVL985 (который заменяет полиэдриновый старт-кодон ATG на АТТ и который вводит BamHI-сайт клонирования в положение, находящееся на 32 пары оснований ниже кодона АТТ; см., Luckow and Summers, Virology (1989) 17:31).

Эта плазмида, обычно, содержит полиэдриновый сигнал полиаденилирования (Miller et al., (1988) Ann. Rev. Microbiol. 42:177), а также прокариотический ген резистентности к ампициллину (amp) и сайт инициации репликации для осуществления отбора и размножения в E.coli. Бакуловирусные векторы переноса обычно содержат бакуловирусный промотор. Бакуловирусный промотор представляет собой любую ДНК-последовательность, способную связываться с бакуловирусной РНК-полимеразой и инициировать транскрипцию кодирующей последовательности (например, структурного гена) в прямом направлении (5′ → 3′) с образованием мРНК. Промотор может иметь область инициации транскрипции, которая обычно находится с 5′-конца от кодирующей последовательности. Эта область инициации транскрипции обычно включает сайт связывания с РНК-полимеразой и сайт инициации транскрипции. Бакуловирусный вектор переноса может также иметь второй домен, называемый энхансером, который, если он присутствует, обычно расположен далеко от структурного гена. Экспрессия может быть либо регулируемой, либо конститутивной.

Структурные гены, которые в избытке транскрибируются в заключительных стадиях инфекционного цикла вируса, имеют особенно ценные промоторные последовательности. Примерами таких последовательностей являются последовательности, происходящие от гена, кодирующего вирусный белок полиэдрон, Friesen et al., (1986) "The Regulation of Baculovirus Gene Expression", в "The Molecular Biology of Baculoviruses" (ed. Walter Doerfler); EPO Publ. Nos. 127839 and 155476; и гена, кодирующего белок р10, Vlak et al., (1988), J. Gen. Virol. 69:765.

ДНК, кодирующая подходящие сигнальные последовательности, может состоять из генов, кодирующих секретируемые белки насекомых или бакуловирусов, таких как, бакуловирусный ген полиэдрина (Carbonell et al. (1988) Gene, 73:409). Альтернативно, поскольку сигналы для посттрансляционной модификации в клетках млекопитающих (таких как отщепление сигнального пептида, протеолитическое отщепление и фосфорилирование), очевидно, распознаются клетками насекомых, а сигналы, необходимые для секреции и аккумуляции в ядрах, очевидно, также являются консервативными для клеток беспозвоночных и позвоночных, то для обеспечения секреции в клетках насекомых могут быть также использованы лидерные последовательности, не происходящие от насекомых, такие как последовательности, происходящие от генов, кодирующих α-интерферон человека, Maeda et al., (1985), Nature 315:592; гастрин-высвобождающий пептид человека, Lebacq-Verheyden et al., (1988), Molec. Cell. Biol. 8:3129; IL-2 человека, Smith et al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:8404; IL-3 мыши (Miyajima et al., (1987) Gene 58:273; и глюкоцереброзидазу человека, Martin et al., (1988) DNA, 7:99.

Рекомбинантный полипептид или полипротеин могут экспрессироваться внутриклеточно, либо, если они экспрессируются с собственными регуляторными последовательностями, то они могут быть секретированы. Для хорошей внутриклеточной экспрессии негибридных чужеродных белков, обычно, требуется присутствие гетерологичных генов, которые, в идеальном случае, имеют короткую лидерную последовательность, содержащую подходящие сигналы инициации трансляции перед старт-сигналом ATG. Если это необходимо, то метионин у N-конца может быть отщеплен от зрелого белка путем in vitro-инкубирования с бромцианом.

Альтернативно, рекомбинантные полипротеины или белки, которые не секретируются в природных условиях, могут быть секретированы из клеток насекомых путем создания химерных ДНК-молекул, кодирующих гибридный белок, состоящий из фрагмента лидерной последовательности, которая обеспечивает секрецию чужеродного белка у насекомых. Фрагмент лидерной последовательности обычно кодирует сигнальный пептид, состоящий из гидрофобных аминокислот, которые способствуют транспорту белка в эндоплазматический ретикулум.

После введения ДНК-последовательности и/или гена, кодирующего предшественник продукта экспрессии белка, клетка-хозяин насекомого ко-трансформируется гетерологичной ДНК вектора переноса и геномной ДНК бакуловируса дикого типа, обычно, посредством ко-трансфекции. Промоторная последовательность и последовательность терминации транскрипции этой конструкции обычно содержит 2-5 т.п.о.-область генома бакуловируса. Методы встраивания гетерологичной ДНК в нужный сайт бакуловируса известны специалистам (См. Summers and Smith, см. выше; Ju et al., (1987); Smith et al., Mol. Cell. Biol. (1983) 3:2156; и Luckow and Summers (1989)). Например, такая инсерция может быть введена в ген, такой как ген полиэдрина, путем гомологичной рекомбинации посредством двойного кроссинговера; эта инсерция может быть также введена в рестрикционный сайт, сконструированный в нужном бакуловирусном гене. Miller et al., (1989), Bioessays 4:91. ДНК-последовательность, при ее клонировании в экспрессирующий вектор вместо гена полиэдрина, фланкирована по обоим 5′- и 3′-концам полиэдрин-специфическими последовательностями и расположена ниже промотора полиэдрина. Затем, вновь сконструированный бакуловирусный экспрессирующий вектор упаковывают в инфекционный рекомбинантный бакуловирус. Гомологичная рекомбинация происходит при низкой частоте (в пределах от около 1% до около 5%), а поэтому, большинство вирусов, продуцированных после ко-трансфекции, все еще являются вирусами дикого типа. Следовательно, необходимо разработать метод для идентификации рекомбинантных вирусов. Преимущество данной экспрессирующей системы заключается в том, что она позволяет идентифицировать рекомбинантные вирусы методом визуального скрининга. Белок полиэдрина, продуцируемый нативным вирусом, продуцируется в ядрах инфицированных клеток в очень больших количествах на поздних стадиях после инфекционного цикла вируса. Аккумулированный белок полиэдрина образует тельца включения, которые также содержат встроенные частицы. Эти тельца включения размером вплоть до 15 мкм обладают в высокой степени преломляющими свойствами, что придает им блестящий яркий вид, который легко визуализируется с помощью оптического микроскопа. Клетки, инфицированные рекомбинантными вирусами, не обнаруживают телец включения. Для дифференциации рекомбинантного вируса от вируса дикого типа, трансфекционный супернатант наносят пятнами на монослой клеток насекомых с помощью техники, известной специалистам. А именно, бляшки скринируют с помощью оптического микроскопа на присутствие (указывающее на вирус дикого типа) или отсутствие (указывающее на рекомбинантный вирус) телец включения. "Current Protocols in Microbiology" Vol.2 (Ausubel et al., eds) at 16,8 (Supp. 10, 1990); Summers and Smith, см. выше; Miller et al., (1989). Рекомбинантные бакуловирусные экспрессирующие векторы были сконструированы для инфицирования некоторых клеток насекомых. Например, рекомбинантные бакуловирусы были сконструированы, inter alia, для: Aedes aegypti, Autographa californica, Bombyx mori, Drosophila melanogaster, Spodoptera frugiperda и Trichoplusiani (WO 89/046699; Carbonell et al., (1985) J. Virol. 56: 153; Wright (1986) Nature 321:718; Smith et al., (1983) Mol. Cell Biol. 3:2156; и, в общих чертах, см. Fraser et al., (1989) In Vitro Cell. Dev. Biol. 25:225).

Клетки и среды для культивирования клеток являются коммерчески доступными материалами, используемыми для прямой экспрессии и экспрессии гетерологичных полипептидов в виде гибридов в бакуловирусных/экспрессионных системах; метод культивирования клеток, в основном, известен специалистам. См. например, Summers and Smith, см. выше.

Затем, модифицированные клетки насекомых могут быть культивированы в соответствующей питательной среде, которая обеспечивает стабильность плазмиды (плазмид), присутствующей в модифицированном насекомом-хозяине. Если ген экспрессируемого продукта находится под индуцибельным контролем, то клетки-хозяева могут быть культивированы до высокой плотности и экспрессия является индуцируемой. Альтернативно, если экспрессия является конститутивной, то данный продукт будет непрерывно экспрессироваться в среду, а поэтому питательная среда должна непрерывно циркулировать с удалением нужного продукта и с восполнением истощающихся питательных веществ. Этот продукт может быть очищен с помощью такой техники, как хроматография, например, ВЭЖХ, аффинная хроматография, ионообменная хроматография и т.п.; электрофорез; центрифугирование в градиенте плотности; экстракция растворителем или т.п. При необходимости, этот продукт может быть дополнительно очищен, например, для удаления, в основном, любых белков насекомых, которые также секретируются в этой среде или высвобождаются в нее в результате лизиса клеток насекомых, с получением, в итоге, продукта, который не содержит, по крайней мере, значительного количества клеточного дебриса хозяина, например, белков, липидов и полисахаридов.

Для получения экспрессии белка, рекомбинантные клетки-хозяева, происходящие от трансформантов, инкубируют в условиях, которые позволяют осуществлять экспрессию последовательности, кодирующей рекомбинантный белок. Эти условия могут варьироваться в зависимости от выбранной клетки-хозяина. Однако эти условия легко могут быть установлены каждым специалистом на основе имеющегося опыта.

iii. Растительные системы:

Существует множество растительных клеточных культур и цельных систем генной экспрессии в растениях. Примерами систем генной экспрессии в клетках растений являются системы, описанные в патентах, таких как: патенты США №№ 5693506; 5659122 и 5608143. Другие примеры экспрессии генов в клеточных культурах растений описаны Zenk, Phytochemistry 30:3861-3863 (1991). Описания сигнальных пептидов растительных белков могут быть найдены, кроме работ, указанных выше, в Vaulcombe et al., Mol. Gen. Genet. 209:33-40 (1987); Chandler et al., Plant Molecular Biology 3:407-418 (1984); Rogers, J. Biol. Chem. 260:3731-3738 (1985); Rothstein et al., Gene 55:353-356 (1987); Whittier et al., Nucleic Acids Research 15:2515-2535 (1987); Wirsel et al., Molecular Microbiology 3:3-14 (1989); Yu et al., Gene 122:247-253 (1992). Описание регуляции экспрессии генов растений под действием фитогормона, гибберелловой кислоты и секретированных ферментов, индуцированных гибберелловой кислотой, может быть найдено в работах R.L. Jones and J. MacMillin, Gibberellins, в Advanced Plant Physiology, Malcolm B. Wilkins, ed., 1984 Pitman Publishing Limited, London, pp. 21-52. Описание других метаболически регулируемых генов можно найти в работах: Sheen, Plant Cell, 2: 1027-1038 (1990); Maas et al., EMBO J. 9:3447-3452 (1990); Benkel and Hickey, Proc. Natl. Acad. Sci. 84:1337-1339 (1987).

Обычно, с использованием техники, известной специалистам, нужную полинуклеотидную последовательность встраивают в экспрессирующую кассету, содержащую генные регуляторные элементы, сконструированные для проведения манипуляций в растениях. Эту экспрессирующую кассету встраивают в нужный экспрессирующий вектор вместе с сопровождающими последовательностями, расположенными выше и ниже от экспрессирующей кассеты, подходящей для экспрессии в растительной клетке-хозяине. Эти сопровождающие последовательности происходят от плазмиды или вируса и наделяют вектор необходимыми свойствами, позволяющими переносить ДНК из первоначального клонирующего хозяина, такого как бактерия, в нужную растительную клетку-хозяина. Предпочтительно, чтобы основная конструкция бактериального/растительного вектора имела сайт инициации репликации для широкого круга хозяев-прокариотов; селективный маркер прокариота; а для трансформации Agrobacterium, Т-ДНК-последовательности для Agrobacterium-опосредованного переноса в хромосомы растения. Если гетерологичный ген трудно поддается обнаружению, то, предпочтительно, чтобы эта конструкция также содержала селективный маркерный ген, который позволил бы определить, является ли растительная клетка трансформированной. Общий обзор подходящих маркеров, например, для членов семейства злаковых, можно найти у Wilmink and Dons, 1993, Plant Mol. Biol. Reptr, 11(2):165-185.

Рекомендуется также использовать последовательности, подходящие для интеграции гетерологичных последовательностей в геном растения. Такими последовательностями могут быть последовательности транспозона и т.п. для гомологичной рекомбинации, а также Ti-последовательности, которые позволяют осуществлять рандомизированную инсерцию экспрессирующей кассеты гетерологичных последовательностей в геном растения. Подходящими прокариотическими селективными маркерами являются последовательности резистентности к антибиотикам, таким как ампициллин или тетрациклин. В векторе могут также присутствовать другие ДНК-последовательности, кодирующие дополнительные функциональные элементы и хорошо известные специалистам.

Молекула нуклеиновной кислоты настоящего изобретения может быть включена в экспрессирующую кассету для экспрессии нужного(ных) белка(ов). В основном, используется лишь одна экспрессирующая кассета, хотя, в некоторых случаях, могут быть использованы две или более кассет. Помимо последовательности, кодирующей гетерологичный белок, рекомбинантная экспрессирующая кассета содержит следующие элементы: промоторную область; 5′-нетранслируемые последовательности растения; старт-кодон, в зависимости от того, имеет ли структурный ген этот кодон или нет; и последовательность терминации транскрипции и трансляции. Присутствие уникальных сайтов рестрикции на 5′- и 3′-концах этой кассеты позволяет легко осуществлять инсерцию в уже имеющийся вектор.

Гетерологичная кодирующая последовательность может быть получена для любого белка, имеющего отношение к настоящему изобретению. Последовательность, кодирующая нужный белок, будет кодировать сигнальный пептид, который обеспечивает процессинг и транслокацию белка, если это необходимо, и, как правило, не будет содержать какой-либо последовательности, которая может приводить к связыванию нужного белка настоящего изобретения с мембраной. Поскольку, по большей части, область инициации транскрипции предназначена для гена, который экспрессируется и транслоцируется во время прорастания семян, то благодаря использованию сигнального пептида, который обеспечивает транслокацию, можно также индуцировать транслокацию нужного белка. Таким образом, нужный белок (или белки) будет транспортирован из клеток, в которых он был экспрессирован, и может быть эффективно собран. Обычно, секреция в семенах растения происходит через алейроновый слой или эпителиальный слой щитка в эндосперм семени. Хотя секреция белка из клеток, в которых этот белок был продуцирован, не является необходимой, однако, она облегчает выделение и очистку рекомбинантного белка.

Поскольку окончательная экспрессия нужного генного продукта будет происходить в эукариотической клетке, то желательно определить, содержит ли какая-либо часть клонированного гена последовательности, которые будут вырезаться как интроны под действием сплайсингосомного аппарата клетки. Если это так, то для предупреждения потери части генетической информации в виде ложного интронного кода может быть проведен сайт-направленный мутагенез "интронной" области. Reed and Maniatis, Cell, 41: 95-105, 1985.

Для механического переноса рекомбинантной ДНК, данный вектор может быть непосредственно введен в растительные клетки путем микроинъекции с использованием микропипеток. Crossway, Mol. Gen. Genet. 202:179-185, 1985. Генетический материал может быть также перенесен в растительную клетку с использованием полиэтиленгликоля; Krens et al., Nature, 296, 72-74, 1982. Другим методом введения сегментов нуклеиновых кислот является высокоскоростное баллистическое внедрение с использованием мелких частиц с нуклеиновой кислотой, находящейся либо в матрице мелких гранул или частиц, либо на их поверхности; см. Klein et al., Nature, 327, 70-73, 1987 и Knudsen and Muller, 1991, Planta, 185:330-336, где описана бомбардировка эндосперма ячменя этими частицами для получения трансгенного ячменя. Другим методом введения генов является слияние протопластов с другими частицами, либо миниклетками, клетками, липосомами, либо другими поддающимися слиянию тельцами с липидами на поверхности, Fraley et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 79, 1859-1863, 1982.

Этот вектор может быть также введен в клетки растений путем электропорации (Fromm et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82: 5824, 1985). В этом методе, протопласты растения подвергают электропорации в присутствии плазмид, содержащих генную конструкцию. Электрические импульсы поля высокой напряженности делают биомембраны обратимо проницаемыми, что позволяет вводить через них плазмиды. Протопласты растений, подвергнутые электропорации, снова создают клеточную стенку, делятся и образуют растительные каллюсы.

Все растения, из которых протопласты могут быть выделены и культивированы с получением целых регенерированных растений, могут быть трансформированы методами настоящего изобретения с получением целых растений, содержащих перенесенный ген. Известно, что практически все растения могут быть регенерированы из культивированных клеток или тканей, включая, но не ограничиваясь ими: все основные виды сахарного тростника, сахарную свеклу, хлопчатник, плодовые и другие деревья, бобовые и овощные культуры. Некоторыми подходящими растениями являются, например, виды растений рода Fragaria, Lotus, Medicago, Onobrychis, Trifolium, Trigonella, Vigna, Citrus, Linum, Geranium, Manihot, Daucus, Arabidopsis, Brassica, Raphanus, Sinapis, Atropa, Capsicum, Datura, Hyoscyamus, Lycopersion, Nicotiana, Solanum, Petunia, Digitalis, Majorana, Cichorium, Helianthus, Lactuca, Bromus, Asparagus, Antirrhinum, Hererocallis, Nemesia, Pelargonium, Panicum, Pennisetum, Ranunculus, Senecio, Salpiglossis, Cucumis, Browaalia, Glycine, Lolium, Zea, Triticum, Sorghum и Datura.

Способы регенерации варьируются в зависимости от вида растения, но, обычно, сначала получают суспензию трансформированных протопластов, содержащих копии гетерологичных генов. Сначала формируется ткань каллюса, и из этого каллюса может быть индуцирован рост побегов, которые затем укореняются. Альтернативно, образование эмбрионов может быть индуцировано из суспензии протопластов. Эти эмбрионы прорастают как природные эмбрионы и из них образуются растения. Культуральные среды, в основном, содержат различные аминокислоты и гормоны, такие как ауксин и цитокины. В эту среду также предпочтительно добавить глутаминовую кислоту и пролин, особенно для таких видов растений, как кукуруза и люцерна. Побеги и корни обычно развиваются одновременно. Эффективная регенерация зависит от среды, генотипа и от развития культуры. При регулировании этих трех параметров, процесс регенерации может быть полностью воспроизводимым и повторяемым.

В некоторых системах культур растительных клеток, нужный белок настоящего изобретения может быть эксретирован, или, альтернативно, этот белок может быть экстрагирован из целого растения. В случае, когда нужный белок настоящего изобретения секретируется в среду, он может быть собран. Альтернативно, половина семян с эмбрионами и половина семян без эмбрионов, или другие ткани растений могут быть механически разрушены с высвобождением любого белка, секретированного в межклеточную и межтканевую области. Эта смесь может быть суспендирована в буферном растворе с получением растворимых белков. Для очистки рекомбинантного белка могут быть затем использованы стандартные методы выделения и очистки белков. Для оптимизации экспрессии и выделения гетерологичного белка, такие параметры, как время, температура, рН, содержание кислорода и объем могут быть скорректированы рутинными методами.

iv. Бактериальные системы

Техника экспрессии в бактериях известна специалистам. Бактериальным промотором является любая ДНК-последовательность, способная связываться с бактериальной РНК-полимеразой и инициировать транскрипцию кодирующей последовательности (например, структурного гена) в направлении 5′ → 3′ с образованием мРНК. Промотор имеет область инициации транскрипции, которая обычно локализована с 5′-конца по отношению к кодирующей последовательности. Эта область инициации транскрипции обычно включает сайт связывания с РНК-полимеразой и сайт инициации транскрипции. Бактериальный промотор может также иметь второй домен, называемый оператором, который может перекрываться со смежным сайтом связывания с РНК-полимеразой, инициирующей синтез РНК. Этот оператор позволяет осуществлять негативную (индуцибельную) регуляцию транскрипции, поскольку белок-репрессор гена может связываться с оператором и, тем самым, ингибировать транскрипцию специфического гена. Конститутивная экспрессия может происходить в отсутствие элементов негативной регуляции, таких как оператор. Кроме того, позитивная регуляция может быть достигнута с помощью последовательности, связывающейся с белком-активатором гена, которая, если она присутствует, обычно расположена с 5′-конца по отношению к последовательности связывания с РНК-полимеразой. Примером белка-активатора гена является белок-активатор катаболического гена (САР), который способствует инициации транскрипции lac-оперона в Escherichia coli (E.coli) [Raibaud et al., (1984) Annu. Rev. Genet. 18:173]. Таким образом, регулируемая экспрессия может быть либо положительной, либо отрицательной, а следовательно, либо усиливающей, либо ослабляющей транскрипцию.

Особенно ценные промоторные последовательности имеют последовательности, кодирующие ферменты пути метаболизма. В качестве примеров могут служить промоторные последовательности, происходящие от ферментов метаболизма сахаров, таких как галактоза, лактоза (lac) [Chang et al., (1977) Nature 198: 1056] и мальтоза. В качестве других примеров могут служить промоторные последовательности, происходящие от ферментов биосинтеза, таких как триптофан (trp) [Goeddel et al., (1980) Nucl. Acids Res. 8:4057; Yelverton et al., (1981) Nucl. Acids Res. 9:731; патент США 4738921; ЕР-А-0036776 и ЕР-А-0121775]. Промоторная система g-лактамазы (bla) [Weissmann (1981) "The clonning of interferon and other mistakes" в Interferon 3 (ed. I. Gresser)], бактериофага лямбда PL [Shimatake et al., (1981) Nature 292:128] и Т5 [патент США 4689406] также имеют ценные промоторные последовательности.

Кроме того, не встречающиеся в природе синтетические промоторы также являются функциональными, как и бактериальные промоторы. Так, например, последовательности активации транскрипции одного бактериального или бактериофагового промотора могут быть присоединены к последовательностям оперона другого бактериального или бактериофагового промотора с образованием синтетического гибридного промотора [патент США 4551433]. Например, tac-промотор представляет собой гибридный trp-tac-промотор, который состоит из последовательностей trp-промотора и lac-оперона и регулируется lac-репрессором [Amann et al., (1983) Gene 25:167; de Boer et al., (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. 80:21]. Кроме того, бактериальным промотором могут быть природные промоторы, не происходящие от бактерий и обладающие способностью связываться с бактериальной РНК-полимеразой и инициировать транскрипцию. Такой природный не происходящий от бактерии промотор может также связываться с совместимой РНК-полимеразой с продуцированием высоких уровней экспрессии некоторых генов в прокариотах. Примером сопряженной промоторной системы является система "РНК-полимераза/промотор бактериофага Т7" [Studier et al., (1986) J. Mol. Biol. 189:113; Tabor et al., (1985), Proc. Natl. Acad. Sci. 82:1074]. Кроме того, гибридный промотор может также состоять из бактериофагового промотора и области оператора E.coli (ЕРО-А-0267851).

Помимо функционирующей промоторной последовательности, для экспрессии чужеродных генов в прокариотах может быть также использован эффективный сайт связывания с рибосомой. В E.coli, такой сайт связывания с рибосомой называют последовательностью Шайна-Дальгарно (SD), и этот сайт включает инициирующий кодон (ATG) и последовательность длиной в 3-9 нуклеотидов, расположенную на 3-11 нуклеотидов выше от инициирующего кодона [Shine et al., (1975) Nature 254:34]. Очевидно, последовательность SD стимулирует связывание мРНК с рибосомой путем спаривания оснований между последовательностью SD и 3′-концом и рРНК E. coli 16S [Steitz et al., (1979) "Genetic signals and nucleotide sequences in messenger RNA" в Biological Regulation and Development: Gene Expression (ed. R.F. Goldberger)]. Экспрессия эукариотических генов и прокариотических генов со слабым сайтом связывания с рибосомой описана [Sambrook et al., (1989) в "Expression of cloned genes in Esherichia coli" в Molecular Cloning: A Laboratory Manual].

ДНК-молекула может быть экспрессирована внутриклеточно. Промоторная последовательность может быть непосредственно присоединена к ДНК-молекуле, где первой аминокислотой у N-конца всегда является метионин, который кодируется старт-кодоном ATG. Если это необходимо, то метионин у N-конца может быть отщеплен от белка путем in vitro-инкубирования с бромцианом, либо путем in vivo- или in vitro-инкубирования с бактериальной пептидазой, отщепляющий N-концевой метионин (ЕРО-А-0219237).

Гибридные белки представляют собой альтернативу прямой экспрессии. Обычно, ДНК-последовательность, кодирующую N-концевую часть эндогенного бактериального белка или другого стабильного белка, сливают с 5′-концом гетерологичных кодирующих последовательностей. После экспрессии получают конструкцию из двух слитых аминокислотных последовательностей. Так, например, ген клетки бактериофага лямбда может быть присоединен у 5′-конца чужеродного гена и экспрессирован в бактерии. Полученный гибридный белок предпочтительно сохраняет сайт процессинга фермента (фактора Ха) для отщепления бактериофагового белка от чужеродного гена [Nagai et al., (1984) Nature 309:810]. Могут быть также получены гибридные белки с использованием последовательностей генов lacZ [Jia et al., (1987) Gene 60:197], trpE [Allen et al., (1987) J. Biotechnol. 5:93; Makoff et al., (1989) J. Gen. Microbiol., 135:11] и Chey [ЕР-А-0324647]. ДНК-последовательность в стыке двух аминокислотных последовательностей может кодировать, а может и не кодировать сайт расщепления. Другим примером может служить гибридный белок убихитина. Этот гибридный белок получают с использованием убихитиновой области, которая, предпочтительно, сохраняет сайт процессинга фермента (например, убихитин-специфической процессирующей протеазы) для отщепления убихитина от чужеродного белка. С использованием этого метода, нативный чужерожный белок может быть выделен [Miller et al., (1989) Bio/Technology 7:698].

Альтернативно, чужеродные белки могут быть также секретированы из клетки путем создания химерных ДНК-молекул, которые кодируют гибридный белок, состоящий из фрагмента сигнальной пептидной последовательности, способствующей секреции чужеродного белка в бактерии [патент США 4336336]. Этот фрагмент сигнальной последовательности обычно кодирует сигнальный пептид, состоящий из гидрофобных аминокислот, которые направляют секрецию белка из клетки. Этот белок либо секретируется в культуральную среду (грамположительных бактерий), либо в периплазматическое пространство, расположенное между внутренней и внешней мембраной клетки (грамотрицательных бактерий). При этом, предпочтительно, если имеются сайты процессинга, которые могут быть расщеплены либо in vivo, либо in vitro, кодируемые между фрагментом сигнального пептида и чужеродным геном.

ДНК, кодирующая подходящие сигнальные последовательности, может быть получена от генов, ответственных за секрецию бактериальных белков, таких как ген белка внешней мембраны E.coli (ompA) [Masui et al. (1983), в Experimental Manipulation of Gene Expression; Ghrayeb et al., (1984) EMBO J., 3:2437] и сигнальной последовательности щелочной фосфатазы E.coli (phoA) [Oka et al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci., 82:7212]. В качестве дополнительного примера можно упомянуть, что для секреции гетерологичных белков от B.subtilis может быть использована сигнальная последовательность гена альфа-амилазы от различных штаммов Bacillus [Palva et al., (1982) Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 79:5582; ЕР-А-0244042].

Обычно, последовательности терминации транскрипции, распознаваемые бактериями, представляют собой регуляторные области, локализованные с 3′-конца по отношению к стоп-кодону трансляции, и таким образом, вместе с промотором, они фланкируют кодирующую последовательность. Эти последовательности направляют транскрипцию мРНК, которая может быть транслирована в полипептид, кодированный ДНК. Последовательности терминации транскрипции часто имеют ДНК-последовательности приблизительно из 50 нуклеотидов, способные образовывать структуры "петля на стебле", которые способствуют терминации транскрипции. Примерами таких последовательностей являются последовательности терминации транскрипции, происходящие от генов с сильными промоторами, таких как ген trp в E.coli, а также других генов биосинтеза.

Обычно, вышеописанные компоненты, содержащие промотор, сигнальную последовательность (если это необходимо), нужную кодирующую последовательность и последовательность терминации транскрипции, взятые вместе, образуют экспрессионные конструкции. Эти экспрессионные конструкции часто вводят в репликон, такой как внехромосомный элемент (например, плазмиды), способный стабильно поддерживаться в хозяине, таком как бактерии. Этот репликон имеет систему репликации, которая позволяет ему присутствовать в прокариотическом хозяине либо для экспрессии, либо для клонирования и амплификации. Кроме того, репликон может быть либо высококопийной, либо низкокопийной плазмидой. Высококопийная плазмида обычно имеет число копий в пределах от около 5 до около 200, а, обычно, от около 10 до около 150. Хозяин, содержащий высококопийную плазмиду, предпочтительно содержит, по крайней мере, около 10, а более предпочтительно, по крайней мере, около 20 плазмид. В зависимости от влияния вектора и чужеродного белка на хозяина, могут быть выбраны либо высококопийный, либо низкокопийный вектор.

Альтернативно, экспрессирующие конструкции могут быть интегрированы в бактериальный геном при помощи интегрирующегося вектора. Интегрирующиеся векторы обычно содержат, по крайней мере, одну последовательность, гомологичную бактериальной хромосоме, что позволяет этому вектору интегрироваться. Интеграция, очевидно, происходит вследствие рекомбинаций между гомологичной ДНК в векторе и бактериальной хромосомой. Так, например, интегрирующиеся векторы, сконструированные с использованием ДНК от различных штаммов Bacillus, интегрируются в хромосому Bacillus (EP-A-0127328). Интегрирующиеся векторы также могут состоять из последовательностей бактериофага или транспозона.

Обычно, внехромосомные и интегрирующиеся экспрессионные конструкции могут содержать селективные маркеры, позволяющие проводить отбор трансформированных бактериальных штаммов. Селективные маркеры могут экспрессироваться в бактериальном хозяине и могут иметь гены, которые наделяют бактерии резистентностью к лекарственным средствам, таким как, ампициллин, хлорамфеникол, эритромицин, канамицин (неомицин) и тетрациклин [Davies et al., (1978) Annu. Rev. Microbiol. 32:469]. Селективные маркеры могут также иметь гены биосинтеза, такие как гены, участвующие в пути биосинтеза гистидина, триптофана и лейцина.

Альтернативно, некоторые из вышеописанных компонентов вместе могут образовывать трансформирующие векторы. Трансформирующие векторы обычно состоят из селективного маркера, который либо присутствует в репликоне, либо формируется в интегрирующийся вектор, описанный выше.

Экспрессирующие и трансформирующие векторы, либо внехромосомные репликоны, либо интегрирующиеся векторы, были сконструированы для трансформации в множество бактерий. Так например, экспрессирующие векторы были сконструированы, inter alia, для следующих бактерий: Bacillus subtilis [Palva et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:5582; ЕР-А-0036259 и ЕР-А-0063953; WO84/04541], Escherichia coli [Shimatake et al. (1981) Nature 292: 128; Amann et al. (1985) Gene 40:183; Studier et al. (1986) J. Mol. Biol. 189:113; ЕР-А-0036776, ЕР-А-0136829 и ЕР-А-0136907], Streptococcus cremoris [Powell et al. (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54:655]; Streptococcus lividans [Powell et al., (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54:655], Streptomyces lividans [патент США № 4745056].

Способы введения экзогенной ДНК в бактериального хозяина хорошо известны специалистам, и такими способами обычно являются трансформация бактерий, обработанных либо CaCl_2, либо другими агентами, такими как, двухвалентные катионы и ДМСО. ДНК также может быть введена в бактериальные клетки путем электропорации. Способы трансформации обычно варьируются в зависимости от трансформируемых видов бактерий. См. например, [Masson et al., (1989) FEMS Microbiol. Lett. 60:273; Palva et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:5582; ЕР-А-0036259 и ЕР-А-0063953; WO 84/04541, Bacillus], [Miller et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:856; Wang et al. (1990) J. Bacteriol. 172:949, Campylobacter], [Cohen et al. (1973) Proc. Natl. Acad. Sci. 69:2110; Dower et al., (1988) Nucleic Acids Res. 16:6127; Kushner (1978) "An improved method for transformation of Escherichia coli with ColE1-derived plasmids. In Genetic Engineering: Proceedings of the International Symposium on Genetic Engineering (eds, H.W. Boyer and S. Nicosia); Mandel et al. (1970) J. Mol. Biol. 53:159; Taketo (1988) Biochem. Biophys. Acta 949:318; Escherichia], [Chassy et al. (1987) FEMS Microbiol. Lett. 44:173 Lactobacillus]; [Fiedler et al., (1988) Anal. Biochem 170:38, Pseudomonas]; [Augustin et al., (1990) FEMS Microbiol. Lett. 66:203, Staphylococcus], [Barany et al., (1980) J. Bacteriol. 144:698; Harlander (1987) "Transformation of Streptococcus lactis by electroporation, in: Streptococcal Genetics (ed. J. Ferreti and R. Curtiss III); Perry et al. (1981) Infect. Immun. 32:1295; Powell et al. (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54:655; Somkuti et al. (1987) Proc. 4th Evr. Cong. Biotechnology 1:412, Streptococcus].

v. Экспрессия в дрожжах

Дрожжевые экспрессирующие системы также известны каждому специалисту. Дрожжевой промотор представляет собой любую ДНК-последовательность, способную связываться с дрожжевой РНК-полимеразой и инициировать транскрипцию кодирующей последовательности (например, структурного гена) в направлении 5′ → 3′ с образованием мРНК. Промотор имеет область инициации транскрипции, которая обычно находится с 5′-конца от кодирующей последовательности. Эта область инициации транскрипции обычно включает сайт связывания с РНК-полимеразой ("ТАТА-бокс") и сайт инициации транскрипции. Дрожжевой промотор может также иметь второй домен, называемый верхней активаторной последовательностью (UAS), которая, если она присутствует, обычно находится на значительном расстоянии от структурного гена. UAS обеспечивает регулируемую (индуцибельную) экспрессию. Конститутивная экспрессия может происходить в отсутствие UAS. Регуляция экспрессии может быть либо негативной, либо позитивной, то есть, она либо усиливает, либо ослабляет транскрипцию.

Дрожжи представляют собой ферментирующий микроорганизм с активным путем метаболизма, а поэтому, последовательности, кодирующие ферменты пути метаболизма, представляют собой особенно ценные промоторные последовательности. Примерами таких ферментов являются алкоголь-дегидрогеназа (ADH) (ЕР-А-0284044), энолаза, глюкокиназа, глюкозо-6-фосфатизомераза, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа (GAP или GAPDH), гексокиназа, фосфофруктокиназа, 3-фосфоглицератмутаза и пируваткиназа (РуК) (ЕРО-А-0329203). Дрожжевой ген РН05, кодирующий кислотную фосфатазу, также имеет ценные промоторные последовательности [Myanohara et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 80:1].

Кроме того, неприродные синтетические промоторы функционируют так же, как и дрожжевые промоторы. Так, например, последовательности UAS одного дрожжевого промотора могут быть присоединены к области активации транскрипции другого дрожжевого промотора, в результате чего образуется синтетический гибридный промотор. Примерами таких гибридных промоторов являются регуляторная последовательность ADH, присоединенная к области активации транскрипции GAP (патенты США №№ 4876197 и 4880734). Другими примерами гибридных промоторов являются промоторы, которые состоят из регуляторных последовательностей генов ADH2, GAL4, GAL10 или OR РН05, объединенных с областью активации транскрипции гена гликолитического фермента, такого как, GAP или РуК (ЕР-А-164556). Кроме того, дрожжевым промотором может быть природный промотор, не происходящий от дрожжей и обладающий способностью связываться с бактериальной РНК-полимеразой и инициировать транскрипцию. Примеры таких промоторов можно найти, inter alia, в работах [Cohen et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:1078; Henikoff et al., (1981) Nature 283:835; Hollenberg et al. (1981) Curr. Topics Microbiol. Immunol 96:119; Hollenberg et al. (1979) "The Expression of Bacterial Antibiotic Resistance Genes in the Yeast Saccharomyces cerevisiae" в Plasmids of Medical, Environmental and Commercial Importance (eds. K.N. Timmis and A. Puhler); Mercerau-Puigalon et al. (1980) Gene 11:163; Panthier et al. (1980) Curr. Genet. 2:109].

ДНК-молекула может быть экспрессирована внутриклеточно в дрожжах. Промоторная последовательность может быть непосредственно присоединена к ДНК-молекуле, где первой аминокислотой у N-конца рекомбинантного белка является всегда метионин, который кодируется старт-кодоном ATG. Если это необходимо, то метионин у N-конца может быть отщеплен от белка путем in vitro-инкубирования с бромцианом.

Альтернативой дрожжевым экспрессирующим системам являются гибридные белки, а также экспрессирующие системы на основе клеток млекопитающих, бакуловирусные экспрессирующие системы и бактериальные экспрессирующие системы. Обычно, ДНК-последовательность, кодирующую N-концевую часть эндогенного дрожжевого белка или другого стабильного белка, сливают с 5′-концом гетерологичных кодирующих последовательностей. После экспрессии получают конструкцию из двух слитых аминокислотных последовательностей. Например, ген супероксиддисмутазы (SOD) дрожжей или человека может быть присоединен у 5′-конца чужеродного гена и экспрессирован в дрожжах. ДНК-последовательность в стыке двух аминокислотных последовательностей может кодировать, а может и не кодировать сайт отщепления. См., например, ЕР-А-0196056. Другим примером может служить гибридный белок убихитина. Этот гибридный белок получают с использованием убихитиновой области, которая предпочтительно сохраняет сайт процессинга фермента (например, убихитин-специфической процессирующей протеазы) для отщепления убихитина от чужеродного гена. А следовательно, с использованием этого метода, нативный чужеродный белок может быть выделен (например, WO88/024066).

Альтернативно, чужеродные белки могут быть также секретированы из клетки в культуральную среду путем создания химерных ДНК-молекул, которые кодируют гибридный белок, состоящий из фрагмента лидерной последовательности, которая способствует секреции чужеродного белка в дрожжах. При этом, предпочтительно, если имеются сайты процессинга, которые кодируются между лидерным фрагментом и чужеродным геном и которые могут быть расщеплены либо in vivo, либо in vitro. Этот фрагмент лидерной последовательности обычно кодирует сигнальный пептид, состоящий из гидрофобных аминокислот, которые направляют секрецию данного белка из клетки.

ДНК, кодирующая подходящие сигнальные последовательности, может быть получена от генов, ответственных за секрецию дрожжевых белков, таких как ген дрожжевой инвертазы (ЕР-А-0012873; JPO 62096086) и ген А-фактора (патент США 4588684). Альтернативно, для секреции в дрожжах могут также присутствовать недрожжевые лидерные последовательности, такие как лидерная последовательность интерферона (ЕР-А-0060057).

Предпочтительным классом лидерных последовательностей, обеспечивающих секрецию, являются такие последовательности, которые содержат фрагмент гена альфа-фактора дрожжей, содержащий как "пре"-сигнальную последовательность, так и "про"-область. Типами фрагментов альфа-фактора, которые могут быть использованы, являются полноразмерные лидерные пре-про-последовательности альфа-фактора (около 83 аминокислотных остатков), а также усеченные лидерные последовательности альфа-фактора (обычно от около 25 до около 50 аминокислотных остатков) (патенты США 4546083 и 4870008; ЕР-А-0324274). Другими лидерными последовательностями, имеющими фрагмент лидерной последовательности альфа-фактора, обеспечивающий секрецию, являются гибридные лидерные последовательности альфа-фактора, сконструированные с использованием пре-последовательности от первого альфа-фактора дрожжей, за исключением про-области от второго альфа-фактора дрожжей (см., например, WO89/02463).

Обычно, последовательности терминации транскрипции, распознаваемые дрожжами, представляют собой регуляторные области, локализованные с 3′-конца по отношению к стоп-кодону трансляции, и таким образом, вместе с промотором, они фланкируют кодирующую последовательность. Эти последовательности направляют транскрипцию мРНК, которая может быть транслирована в полипептид, кодированный ДНК. Примерами последовательностей терминации транскрипции и других распознаваемых дрожжами последовательностей терминации являются такие последовательности терминации транскрипции, которые кодируют гликолитические ферменты.

Обычно, вышеописанные компоненты, содержащие промотор, лидерную последовательность (если это необходимо), нужную кодирующую последовательность и последовательность терминации транскрипции, взятые вместе, образуют экспрессионные конструкции. Экспрессионные конструкции часто вводят в репликон, такой как внехромосомный элемент (например, плазмиды), способный стабильно поддерживаться в хозяине, таком как дрожжи или бактерии. Этот репликон может иметь две системы репликации, что позволяет его использовать, например, в дрожжах для экспрессии и в прокариотическом хозяине для клонирования и амплификации. Примерами таких челночных векторов типа дрожжи-бактерии являются YЕр24 [Botstein et al. (1979) Gene 8:17-24], pCl/1 [Brake et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81:4642-4646] и YRp17 [Stinchcomb et al., (1982) J. Mol. Biol. 158:157]. Кроме того, репликон может быть либо высококопийной, либо низкокопийной плазмидой. Высококопийная плазмида обычно имеет число копий в пределах от около 5 до около 200, а обычно, от около 10 до около 150. Хозяин, содержащий высококопийную плазмиду, предпочтительно содержит, по крайней мере, около 10, а более предпочтительно, по крайней мере, около 20 плазмид. В зависимости от действия вектора и чужеродного белка на хозяина, может быть выбран либо высококопийный, либо низкокопийный вектор. См. выше, например, Brake et al.

Альтернативно, экспрессирующие конструкции могут быть интегрированы в дрожжевой геном при помощи интегрирующегося вектора. Интегрирующиеся векторы обычно содержат, по крайней мере, одну последовательность, гомологичную последовательности дрожжевой хромосомы, что позволяет этому вектору интегрироваться, и предпочтительно, содержат две гомологичные последовательности, фланкирующие экспрессирующую конструкцию. Интеграция, очевидно, происходит вследствие рекомбинаций между гомологичной ДНК в векторе и дрожжевой хромосомой [Orr-Weaver et al. (1983) Methods in Enzymol. 101:228-245]. Интегрирующийся вектор может быть направлен в специфический локус в дрожжах путем отбора подходящей гомологичной последовательности для ее включения в вектор, см. Orr-Weaver et al., выше. Одна или несколько экспрессионных конструкций могут интегрироваться, оказывая, возможно, воздействие на уровни продуцируемых рекомбинантных белков [Rine et al., (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:6750]. Хромосомные последовательности, включенные в вектор, могут присутствовать либо в виде одного сегмента в векторе, который способствует интеграции целого вектора, либо в виде двух сегментов, гомологичных смежным сегментам в хромосоме и фланкирующих экспрессионную конструкцию в векторе, что может приводить к стабильной интеграции лишь экспрессионной конструкции.

Обычно, внехромосомные и интегрирующиеся экспрессионные конструкции могут содержать селективные маркеры, позволяющие проводить отбор трансформированных бактериальных штаммов. Селективными маркерами могут быть биосинтетические гены, которые могут экспрессироваться в дрожжевом хозяине, такие как, ADE2, HIS4, LEU2, TRP1 и ALG7 и ген резистентности к G418, которые сообщают дрожжевым клеткам резистентность к туникамицину и G418, соответственно. Кроме того, подходящий селективный маркер может также обеспечивать способность дрожжей расти в присутствии токсичных соединений, таких как металл. Так, например, присутствие CUP1 позволяет дрожжам расти в присутствии ионов меди [Butt et al. (1987) Microbiol. Rev. 51:351].

Альтернативно, некоторые из вышеописанных компонентов вместе могут образовывать трансформирующие векторы. Трансформирующие векторы обычно состоят из селективного маркера, который либо присутствует в репликоне, либо формируется в интегрирующийся вектор, описанный выше.

Экспрессирующие и трансформирующие векторы, или внехромосомные репликоны, или интегрирующие векторы, были сконструированы для трансформации многих дрожжей. Так например, экспрессирующие векторы были сконструированы inter alia, для следующих дрожжей: Candida albicans [Kurtz et al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6:142], Candida maltosa [Kunze et al. (1985) J. Basic Microbiol. 25:141], Hansenula polymorpha [Gleeson et al. (1986) J. Gen. Microbiol. 132:3459; Roggenkamp et al. (1986) Mol. Gen. Genet. 202:302], Kluyveromyces fragilis [Das, et al. (1984) J. Bacteriol. 158:1165], Kluyveromyces lactis [De Louvencourt et al. (1983) J. Bacteriol. 154:737; Van den Berg et al. (1990) Bio/Technology 8:135], Pichia guillerimondii [Kunze et al. (1985) J. Basic Microbiol. 25:141], Pichia pastoris [Cregg et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5:3376; патенты США №№ 4837148 и 4929555], Saccharomyces cerevisiae [Hinnen et al. (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1929; Ito et al. (1983) J. Bacteriol. 153:163], Schizosaccharomyces pombe [Beach and Nurse (1981) Nature 300:706] и Yarrowia lipolytica [Davidow, et al. (1985) Curr. Genet. 10:380471, Gaillardin et al., (1985) Curr. Genet. 10:49].

Методы введения экзогенной ДНК в дрожжевые клетки-хозяева хорошо известны специалистам и такими методами обычно является трансформация сферопластов или интактных дрожжевых клеток, обработанных щелочными катионами. Способы трансформации обычно варьируются в зависимости от вида трансформируемых дрожжей. См., например [Kurtz et al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6:142; Kunze et al. (1985) J. Basic Microbiol. 25:141; Candida]; [Gleeson et al. (1986) J. Gen. Microbiol. 132:3459; Roggenkamp et al. (1986) Mol. Gen. Genet. 202:302, Hansenula]; [Das, et al. (1984) J. Bacteriol. 158:1165; De Louvencourt et al., (1983) J. Bacteriol. 154:1165; Van den Berg et al. (1990) Bio/Technology 8:135 Kluyveromyces], [Cregg et al., (1985) Mol. Cell. Biol. 5:3376; Kunze et al. (1985) J. Basic Microbiol. 25:141; патенты США №№ 4837148 и 4929555; Pichia]; [Hinnen et al. (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1929; Ito et al., (1983) J. Bacteriol. 153:163 Saccharomyces]; [Beach and Nurse (1981) Nature 300:706 Schizosaccharomyces]; [Davidow, et al. (1985) Curr. Genet. 10:39; Gaillardin et al. (1985) Curr. Genet. 10:49; Yarrowia].

Антитела

Используемый в настоящем описании термин "антитело" относится к полипептиду или к группе полипептидов, содержащих, по крайней мере, один антигенсвязывающий центр. Термин "антиген-связывающий центр антитела" представляет собой трехмерный связывающий участок, имеющий форму внутренней поверхности и распределение заряда, которые комплементарны структурным особенностям эпитопа антигена, что позволяет этому антителу связываться с антигеном. Таким "антителом" являются, например, антитела позвоночных, гибридные антитела, химерные антитела, "очеловеченные" антитела, модифицированные антитела, мультивалентные антитела, белки Fab и антитела с одним доменом.

Антитела против белков настоящего изобретения могут быть использованы для аффинной хроматографии, иммуноанализов и дифференциации/идентификации белков Neisserial.

Антитела против белков настоящего изобретения, как поликлональные, так и моноклональные, могут быть получены стандартными методами. В основном, этот белок используют, главным образом, для иммунизации соответствующих животных, предпочтительно, мышей, крыс, кроликов и коз. Для получения поликлональной сыворотки, предпочтительными являются кролики и козы, из-за объема получаемой сыворотки и доступности меченых антикроличьих и антикозьих антител. Иммунизацию, в основном, осуществляют путем смешивания или эмульгирования белка в физиологическом растворе, а предпочтительно, в адъюванте, таком как, полный адъювант Фрейнда, и инъецирования этой смеси или эмульсии парентерально (в основном, подкожно или внутримышечно). В основном, достаточной является доза 50-200 мкг на инъекцию. Повторную иммунизацию, обычно, проводят через 2-6 недель путем введения одной или более инъекций белка в физиологическом растворе, предпочтительно, с использованием неполного адъюванта Фрейнда. Альтернативно, антитела могут быть продуцированы путем in vitro-иммунизации известными методами, которые с точки зрения настоящего изобретения являются эквивалентными in vivo-иммунизации. Поликлональную антисыворотку получают путем взятия крови у иммунизованного животного с помещением ее в стеклянный или пластиковый контейнер и инкубирования этой крови в течение одного часа при 25°С, а затем в течение 2-18 часов при 4°С. Сыворотку выделяют путем центрифугирования (например, при 1000 г в течение 10 минут). От кроликов может быть получено примерно 20-50 мл сыворотки на объем крови.

Моноклональные антитела получают с использованием стандартных методов Kohler & Milstein [Nature (1975) 256:495-96] или их модификаций. Обычно, мышей или крыс иммунизируют, как описано выше. Однако, вместо того, чтобы брать кровь у животного для экстракции сыворотки, удаляют селезенку (и необязательно, несколько крупных лимфоузлов) и эту селезенку разлагают на отдельные клетки. Если это необходимо, то клетки селезенки могут быть скринированы (после удаления неспецифически прилипших клеток) путем нанесения клеточной суспензии на планшет или лунку, сенсибилизированную белком-антигеном. В-клетки, экспрессирующие мембрано-ассоциированный иммуноглобулин, который является специфичным для данного антигена, связываются с планшетом и не отделяются от остальной суспензии. Полученные В-клетки или все диссоциированные клетки селезенки затем индуцируют для их слияния с клетками миеломы с образованием гибридом и культивируют в селективной среде (например, среде с гипоксантином, в среде с аминоптерином, в среде с тимидином, "НАТ"). Полученные гибридомы засевают путем лимитирующего разведения и оценивают на продуцирование антител, которые специфически связываются с иммунизирующим антигеном (и которые не связываются с неродственными антигенами). Затем, отобранные MAb-секретирующие гибридомы культивируют in vitro (например, в сосудах с тканевой культурой или в реакторах для полого волокна), или in vivo (в виде асцита у мышей).

Если это необходимо, то антитела (поликлональные или моноклональные) могут быть помечены стандартными методами. Подходящими метками являются флуорофоры, хромофоры, радиоактивные атомы (в частности, ³²Р и ¹²⁵I), электронноплотные реагенты, ферменты и лиганды, имеющие партнеров по специфическому связыванию. Ферменты обычно обнаруживаются по их активности. Так, например, пероксидазу хрена (ПХ) обнаруживают по ее способности превращать 3,3′,5,5′-тетраметилбензидин (ТМВ) в синий пигмент, который может быть количественно оценен с помощью спектрофотометра. Термин "партнер по специфическому связыванию" означает белок, способный связываться с молекулой лиганда с высокой специфичностью, как, например, в случае антигена и специфичного к нему моноклонального антитела. Другими партнерами по специфическому связыванию являются биотин и авидин или стрептавидин, IgG и белок А, а также множество пар "рецептор-лиганд", известных специалистам. При этом, следует отметить, что в вышеуказанном описании не предусматривается разделение различных меток на отдельные классы, поскольку одна и та же метка может служить для различных целей. Так, например, ¹²⁵I может служить в качестве радиоактивной метки или в качестве электронноплотного реагента. Пероксидаза хрена (ПХ) может служить в качестве фермента или в качестве антигена для Mab. Кроме того, для достижения нужного эффекта можно объединять различные метки. Так, например, в соответствии с настоящим изобретением, для MAb и авидина также требуется использование меток: а именно, Mab может быть помечено биотином, и его присутствие обнаруживают с помощью авидина, помеченного ¹²⁵I, или с помощью Mab против биотина, помеченного ПХ. Другие модификации и варианты настоящего изобретения будут очевидны для каждого специалиста, и они могут рассматриваться как эквиваленты настоящего изобретения, а поэтому они также входят в объем изобретения.

Фармацевтические композиции

Фармацевтические композиции могут содержать либо полипептиды, либо антитела, либо нуклеиновую кислоту настоящего изобретения. Фармацевтические композиции содержат терапевтически эффективное количество полипептидов, антител или полинуклеотидов настоящего изобретения.

Термин "терапевтически эффективное количество", используемый в настоящем описании, означает количество терапевтического агента, предназначенное для лечения, ослабления симптомов заболевания или предупреждения данного заболевания или состояния, либо для выявления терапевтического или профилактического эффекта. Этот эффект может быть обнаружен, например, по уровню химических маркеров или антигенов. Терапевтическими эффектами также является ослабление физических симптомов, такое как снижение температуры тела. Точное эффективное количество, вводимое индивидууму, зависит от веса и состояния здоровья индивидуума, от природы и тяжести этого состояния и от терапевтических средств или их комбинаций, выбранных для введения индивидууму. Таким образом, невозможно заранее определить точное эффективное количество лекарственного средства. Однако, эффективное количество для каждого данного случая может быть определено путем рутинного экспериментирования и в соответствии с клинической оценкой врача.

В целях настоящего изобретения, эффективная доза составляет от около 0,01 мг/кг до 50 мг/кг или от 0,05 мг/кг до около 10 мг/кг ДНК-конструкций, предназначенных для введения индивидууму.

Фармацевтическая композиция может также содержать фармацевтически приемлемый носитель. Термин "фармацевтически приемлемый носитель" означает носитель для введения терапевтического агента, такого как, антитела или полипептид, гены и другие терапевтические агенты. Этот термин относится ко всем фармацевтическим носителям, которые, при введении этой композиции, сами не индуцируют выработку вредных для индивидуума антител и которые не оказывают чрезмерного токсического действия. Подходящими носителями могут быть крупные макромолекулы с замедленным метаболизмом, такие как белки, полисахариды, полимолочные кислоты, полигликолевые кислоты, полимерные аминокислоты, сополимеры аминокислот и неактивные вирусные частицы. Такие носители хорошо известны каждому специалисту.

В настоящем изобретении могут быть использованы фармацевтически приемлемые соли, например, соли минеральных кислот, такие как, гидрохлориды, гидробромиды, фосфаты, сульфаты и т.п.; и соли органических кислот, такие как, ацетаты, пропионаты, малонаты, бензоаты и т.п. Подробное обсуждение фармацевтически приемлемых наполнителей приведено в Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co, N.J. 1991).

Фармацевтически приемлемые носители в терапевтических композициях могут содержать жидкости, такие как, вода, физиологический раствор, глицерин и этанол. Кроме того, в таких носителях могут присутствовать и другие добавки, такие как, смачивающие или эмульгирующие агенты, забуферивающие вещества для коррекции рН и т.п. Обычно, терапевтические композиции получают в виде инъекций, в форме либо жидких растворов, либо суспензий; или они могут быть также получены в виде твердых форм, подходящих для изготовления растворов или суспензий в жидких носителях, приготавливаемых перед инъекцией. В определение фармацевтически приемлемого носителя также входят липосомы.

Методы доставки

После приготовления нужного состава, композиции настоящего изобретения могут быть непосредственно введены индивидууму. Такими индивидуумами, подвергаемыми лечению, могут быть животные, а в частности, человек.

Прямую доставку композиций обычно осуществляют путем подкожной, внутрибрюшинной, внутривенной или внутримышечной инъекции, либо путем введения в интерстициальное пространство ткани. Эти композиции могут быть также введены в область поражения. Другие способы введения предусматривают пероральное и внутрилегочное введение, введение с помощью суппозиториев и трансдермальное или чрезкожное введение (см., например, WO 98/20734), с использованием игл, аппарата типа "дробовика" для введения генов, или безыгольных шприцов. Схема лечения может предусматривать введение однократной дозы или дробных доз.

Вакцины

Вакцины настоящего изобретения могут быть либо профилактическими (т.е., для предупреждения инфекции), либо терапевтическими (т.е., для лечения заболевания после инфицирования).

Указанные вакцины содержат иммунизирующие антиген(ы), иммуноген(ы), полипептид(ы), белок(и) или нуклеиновую кислоту, обычно в комбинации с "фармацевтически приемлемыми носителями", которыми могут быть любые носители, не способствующие продуцированию вредных антител у индивидуума при введении ему данной композиции. Подходящими носителями обычно являются крупные макромолекулы с замедленным метаболизмом, такие как, белки, полисахариды, полимолочные кислоты, полигликолевые кислоты, полимерные аминокислоты, сополимеры аминокислот, липидные агрегаты (такие как, масляные капельки или липосомы) и неактивные вирусные частицы. Указанные носители хорошо известны каждому специалисту. Кроме того, эти носители могут функционировать как иммуностимулирующие агенты ("адъюванты"). Кроме того, антиген или иммуноген могут быть конъюгированы с бактериальным токсоидом, таким как, токсоид дифтерии, столбняка, холеры, H.pylori и другим патогеном.

Предпочтительными адъювантами для увеличения эффективности композиции являются, но не ограничиваются ими: (1) соли алюминия (алюмы), такие как, гидроксид алюминия, фосфат алюминия, сульфат алюминия и т.п.; (2) эмульсионные композиции типа "масло в воде" (в присутствии или в отсутствие других специфических иммуностимулирующих агентов, таких как, мурамиловые пептиды (см. ниже), или компонентов стенок бактериальных клеток), такие как, например, (а) MF59^TM (WO90/14837; Глава 10 в "Vaccine design: the subunit and adjuvant approach", eds. Powell & Newman, Plenum Press 1995), содержащий 5% сквален, 0,5% Твин-80 и 0,5% Span 85 (необязательно содержащий различные количества МТР-РЕ (см. ниже), хотя это и не обязательно) и полученный в виде субмикронных частиц с использованием микрофлюидизатора, такого как микрофлюидизатор модели 110Y (Microfluidics, Newton, MA), (b) SAF, содержащий 10% сквален, 0,4% Твин-80, блокированный 5% плюроником полимер L121, и thr-MDP (см. ниже) либо псевдоожиженный на микрофлюидизаторе с образованием субмикронной эмульсии, либо интенсивно перемешанный с образованием эмульсии с более крупным размером частиц, и (с) адъювантная система Ribi^тм (RAS) (Ribi Immunochem., Hamilton, МТ), содержащая 2% сквален, 0,2% Твин 80 и один или несколько компонентов стенки бактериальной клетки, выбранных из группы, включающей монофосфориллипид А (MPL), трегалозодимиколат (TDM) и скелета клеточной стенки (CWS), предпочтительно, MPL + CWS (Detox^тм); (3) сапониновые адъюванты, такие как, Стимулон^тм (Cambridg Bioscience, Worcester, MA), или продуцированные из них частицы, такие как, ISCOM (иммуностимулирующие комплексы); (4) полный адъювант Фрейнда (CFA) и неполный адъювант Фрейнда (IFA); (5) цитокины, такие как, интерлейкины (например, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12 и т.п.), интерфероны (например, гамма-интерферон), макрофаг-колониестимулирующий фактор (М-CSF), фактор некроза опухолей (TNF) и т.п. и (6) другие вещества, действующие как иммуностимулирующие агенты и повышающие эффективность композиции. Предпочтительными являются алюм и MF59^TM.

Упомянутыми выше мурамиловыми пептидами являются, но не ограничиваются ими, N-ацетил-мурамил-L-треонил-D-изоглутамин (thr-MDP), N-ацетил-нормурамил-L-аланил-D-изоглутамин (nor-MDP), N-ацетилмурамил-L-аланил-D-изоглутаминил-L-аланин-2-(1′-2′-дипальмитоил-sn-глицеро-3-гидроксифосфорилокси)этиламин (МТР-РЕ) и т.п.

Иммуногенные композиции (например, иммунизирующий антиген/иммуноген/полипептид/белок/нуклеиновая кислота, фармацевтически приемлемый носитель и адъювант) обычно содержат разбавители, такие как, вода, физиологический раствор, глицерин, этанол и т.п. Кроме того, в этих наполнителях могут присутствовать и другие добавки, такие как, смачивающие или эмульгирующие агенты, забуферивающие вещества для коррекции рН и т.п.

Обычно, иммуногенные композиции получают в виде инъекций в форме либо жидких растворов, либо суспензий; однако, могут быть также получены и твердые формы, подходящие для изготовления растворов или суспензий в жидких наполнителях и приготавливаемые перед инъекцией. Этот препарат может быть также эмульгирован или инкапсулирован в липосомы для усиления действия адъюванта, как указывалось выше при обсуждении фармацевтически приемлемых носителей.

Иммуногенные композиции, используемые в качестве вакцин, включают иммунологически эффективное количество антигенных или иммуногенных полипептидов, а также любых других вышеупомянутых компонентов, если это необходимо. Термин "иммунологически эффективное количество" означает, что введение этого количества индивидууму либо в виде разовой дозы, либо в виде дробных доз, является эффективным для лечения или предупреждения заболевания. Это количество варьируется в зависимости от состояния здоровья и физического состояния индивидуума, подвергаемого лечению, от таксономической группы индивидуума, подвергаемого лечению (например, примата, не относящегося к человеку, примата и т.п.), от способности иммунной системы индивидуума к синтезу антител, степени вырабатывания нужного иммунитета, состава вакцины, оценки клинического состояния лечащим врачом, и от других важных факторов. Предполагается, что это количество будет варьироваться в относительно широких пределах, которые могут быть определены методами рутинного экспериментирования.

Иммуногенные композиции обычно вводят путем подкожной, внутримышечной или трансдермальной/чрезкожной инъекции (см., например, WO98/20734). Другими препаратами, подходящими для других способов введения, являются препараты для перорального и внутрилегочного введения, суппозитории и препараты для чрезкожного введения. Схема лечения может предусматривать введение однократной дозы или множества доз. Эта вакцина может быть введена в сочетании с другими иммунорегуляторными агентами.

В качестве альтернативы вакцинам, изготавливаемым на основе белка, может быть проведена ДНК-вакцинация [например, Robinson & Torres (1997) Seminars in Immunology, 9:271-283; Donnelly et al., (1997) Annu. Rev. Immunol., 15: 617-648; см. также ниже].

Носители для доставки генов

Носители для генной терапии, используемые для доставки конструкций, включающих кодирующую последовательность терапевтических генов настоящего изобретения, необходимых для доставки в ткани млекопитающих в целях их экспрессии в этих млекопитающих, могут быть введены либо местно, либо системно. В этих конструкциях может быть использован вирусный или невирусный векторный подход при in vivo или ex vivo-введении. Экспрессия таких кодирующих последовательностей может быть индуцирована с использованием эндогенных промоторов млекопитающих или гетерологичных промоторов. Эспрессия кодирующей последовательности in vivo может быть конститутивной или регулируемой.

Настоящее изобретение включает носители для доставки генов, способные обеспечивать экспрессию рассматриваемых нуклеиновокислотных последовательностей. Носителем для доставки генов является, предпочтительно, вирусный вектор, а более предпочтительно, вирус на основе ретровируса, аденовируса, аденоассоциированного вируса (AAV), вируса герпеса или альфавируса. Вирусным вектором может быть также вектор на основе астровируса, коронавируса, ортомиксовируса, паповавируса, парамиксовируса, парвовируса, пикорнавируса, поксвируса или тогавируса. См, в основном, Jolly (1994) Cancer Gene Therapy 1:51-64; Kimura (1994) Human Gene Therapy 5:845-852; Connelly (1995) Human Gene Therapy 6:185-193 и Kaplitt (1994) Nature Genetics 6:148-153.

Ретровирусные векторы хорошо известны специалистам, и авторы настоящей заявки считают, что в настоящем изобретении может быть использован любой вектор, который обычно применяется в ретровирусной генной терапии, включая ретровирусы типа В, С и D, ксенотропные ретровирусы (например, NZB-X1, NZB-X2 и NZB9-1 (см. О′Neill (1985) J. Virol. 53:160), политропные ретровирусы, например, MCF и MCF-MLV (см. Kelly (1983) J. Virol. 45:291), спумавирусы и лентивирусы. См. RNA Tumor Viruses, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, 1985.

Части векторов, используемых для ретровирусной генной терапии, могут быть получены от различных ретровирусов. Например, LTR (длинные концевые повторы) ретровектора могут происходить от вируса саркомы мыши; сайт связывания с тРНК может происходить от вируса саркомы Рауса; сигнал упаковки может происходить от вируса мышиного лейкоза; а сайт инициации синтеза второй цепи может происходить от вируса птичьего лейкоза.

Эти рекомбинантные ретровирусные векторы могут быть использованы для генерирования компетентных по трансдукции частиц ретровирусного вектора путем их введения в соответствующие линии клеток с дефектом упаковки (см. патент США 5591624). Ретровирусные векторы могут быть сконструированы для сайт-специфической интеграции ДНК в клетки-хозяева путем введения химерного фермента интегразы в ретровирусную частицу (см., WO96/37626). Предпочтительно, чтобы рекомбинантный вирусный вектор представлял собой рекомбинантный вирус, дефектный по репликации.

Клеточные линии с дефектом упаковки, подходящие для использования с вышеописанными ретровирусными векторами и хорошо известные специалистам, могут быть легко получены (см. WO95/30763 и WO92/05266) и могут быть использованы для создания клеточных линий-продуцентов (также называемых векторными клеточными линиями или "VCL") в целях продуцирования частиц рекомбинантного вектора. Предпочтительно, чтобы клеточные линии с дефектом упаковки были получены от человеческих родительских клеток (например, клеток НТ1080) или родительских клеточных линий норки, которые предотвращают инактивацию в сыворотке человека.

Предпочтительными ретровирусами для конструирования векторов, используемых для ретровирусной генной терапии, являются вирус птичьего лейкоза, вирус коровьего лейкоза, вирус мышиного лейкоза, фокус-индуцирующий вирус клеток норки, вирус саркомы мыши, вирус ретикулоэндотелиоза и вирус саркомы Рауса. Особенно предпочтительными вирусами мышиного лейкоза являются штаммы 4070А и 1504А (Hartley and Rowe (1976) J. Virol. 19:19-25), вирусы Абельсона (ATCC № VR-999), Френда (ATCC № VR-245), Граффи, Гросса (ATCC № VR-590) и Кирстена, вирус саркомы Харви и Раушера (ATCC № VR-998) и вирус мышиного лейкоза Молони (ATCC № VR-190). Такие ретровирусы могут быть взяты из депозитариев или коллекций, таких как, Американская коллекция типовых культур ("АТСС") в Rockville, Maryland, или они могут быть выделены из известных источников известными методами.

Примерами используемых в настоящем изобретении векторов для ретровирусной генной терапии являются векторы, описанные в патентных заявках: GB2200651, EP0415731, EP0345242, EP0334301, WO89/02468, WO89/05349, WO89/09271, WO90/02806, WO90/07936, WO94/03622, WO93/25698, WO93/25234, WO93/11230, WO93/10218, WO91/02805, WO91/02825, WO95/07994, в патентах США 5219740, 4405712, 4861719, 4980289, 4777127, 5591624. См. также Vile (1993) Cancer Res. 53:3860-3864; Vile (1993) Cancer Res. 53:962-967; Ram (1993) Cancer Res. 53 (1993) 83-88; Takamiya (1992) J. Neurosci. Res 33:493-503; Baba (1993) J. Neurosurg, 79:729-735; Mann (1983) Cell, 33:153; Cane (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. 81:6349 и Miller (1990) Human Gene Therapy 1.

Векторы, применяемые для аденовирусной генной терапии человека, также известны специалистам и могут быть использованы в настоящем изобретении. См., например, Berkner (1988) Biotechniques 6:616 и Rosenfeld (1991) Science 252:431 и WO93/07283, WO93/06223 и WO93/07282. Примерами векторов для аденовирусной генной терапии человека, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, являются векторы, описанные в вышеуказанных работах, а также в WO94/12649, WO93/03769, WO93/19191, WO94/28938, WO95/11984, WO95/00655, WO95/27071, WO95/29993, WO95/34671, WO96/05320, WO94/08026, WO94/11506, WO93/06223, WO94/24299, WO95/14102, WO95/24297, WO95/02697, WO94/28152, WO94/24299, WO95/09241, WO95/25807, WO95/05835, WO94/18922 и WO95/09654. Альтернативно, может быть осуществлено введение ДНК, связанной с "убитым" аденовирусом, как описано Curiel (1992) в Hum. Gene Ther. 3:147-154. Носителями для доставки генов настоящего изобретения также являются векторы на основе аденоассоциированного вируса (AAV). Основными и предпочтительными примерами таких векторов, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, являются векторы на основе AAV-2, описанные Srivastava в WO93/09239. Наиболее предпочтительные векторы содержат два инвертированных концевых повтора AAV, где нативные D-последовательности были модифицированы путем замены нуклеотидов, так, что, по крайней мере, от 5 до 18 нативных нуклеотидов, предпочтительно, по крайней мере, от 10 до 18 нативных нуклеотидов, а наиболее предпочтительно, 10 нативных нуклеотидов были сохранены, а остальные нуклеотиды этой D-последовательности были делетированы или заменены на ненативные нуклеотиды. Нативными D-последовательностями инвертированных концевых повторов AAV являются последовательности из 20 непрерывно следующих друг за другом нуклеотидов в каждом из инвертированных концевых повторов AAV (то есть, у каждого конца имеется одна последовательность), которые не участвуют в образовании НР. Не-нативным нуклеотидом для замены может быть любой нуклеотид, кроме нуклеотида, присутствующего в нативной D-последовательности в том же самом положении. Другими примерами AAV-векторов, которые могут быть использованы, являются pWP-19, pWN-1, оба из которых описаны Nahreini (1993) Gene 124:257-262. Другим примером такого AAV-вектора является psub201 (см., Samulski (1987) J. Virol. 61:3096). Другим примером AAV-вектора является вектор, Double D-ITR. Конструирование вектора Double D-ITR описано в патенте США 5478745. Другими векторами являются векторы, описанные Carter в патенте США 4797368, Muzyczka в патенте США 5139941, Chartejee в патенте США 5474935 и Kotin в WO94/288157. Другим примером AAV-вектора, который может быть использован в настоящем изобретении, является вектор SSV9AFABTKneo, содержащий энхансер AFP и альбуминовый промотор и обеспечивающий направленную экспрессию преимущественно в печени. Структура и конструирование этого вектора описаны Su (1996) в Human Gene Therapy 7:463-470. Другими примерами AAV-векторов для генной терапии являются векторы, описанные в патентах США 5354678, 5173414, 5139941 и 5252479.

В качестве векторов для осуществления генной терапии настоящего изобретения могут быть также использованы векторы на основе вируса герпеса. Основными и предпочтительными примерами таких векторов являются векторы на основе вируса простого герпеса, содержащие последовательность, кодирующую полипептид тимидинкиназы, такие как, векторы, описанные в патенте США 5288641 и в ЕР0176170 (Roizman). Другими примерами векторов на основе вируса простого герпеса являются вектор HFEM/ICP6-LacZ, описанный в WO95/04139 (Wistar Institute), вектор pHSVlac, описанный Geller (1988), Science 241: 1667-1669, и в WO90/09441 и WO92/07945, вектор HSV Us3::pgC-lacZ, описанный Fink (1992) в Human Gene Therapy 3:11-19, и векторы HSV 7134, 2 RH 105 и GAL4, описанные в ЕР 0453242 (Breakefield), и векторы, депонированные в АТСС под номерами доступа АТСС VR-977 и АТСС VR-260.

Рассматриваются также альфа-вирусные векторы для генной терапии, которые могут быть использованы в настоящем изобретении. Предпочтительными альфа-вирусными векторами являются векторы на основе вируса Синдбис. Могут быть использованы тогавирусы, вирус лесов Семлики (АТСС VR-67; АТСС VR-1247), вирус Миддлберга (АТСС VR-370), вирус реки Росс (АТСС VR-373; АТСС VR-1246), вирус венесуэльского лошадиного энцефалита (АТСС VR 923; АТСС VR-1250; АТСС VR-1249; АТСС VR-532) и вирусы, описанные в патентах США № 5091309, 5217879 и WO92/10578. Более конкретно, векторами, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, являются альфа-вирусные векторы, описанные в патентной заявка США рег. № 08/405627, поданной 15 марта 1995, WO94/21792, WO92/10578, WO95/07994, и в патентах США 5091309 и 5217879. Такие альфа-вирусы могут быть взяты из депозитариев или коллекций, таких как, АТСС в Rockville, Maryland, или они могут быть выделены из известных источников с помощью стандартной техники. Предпочтительно использовать альфа-вирусные векторы с ослабленной цитотоксичностью (см. заявку на патент США рег. № 08/679640).

Для экспрессии нуклеиновых кислот настоящего изобретения могут быть также использованы системы ДНК-векторов, такие как, системы экспрессии в эукариотических клетках. Подробное описание эукариотических экспрессирующих систем представлено в WO 95/07994. Предпочтительными эукариотическими экспрессирующими системами настоящего изобретения являются системы, полученные с использованием векторов на основе альфавирусов, а наиболее предпочтительно, векторов вируса Синдбис.

Другими вирусными векторами, подходящими для использования в настоящем изобретении, являются векторы, полученные на основе полиовирусов, например, АТСС VR-58, и вирусов, описанных Evans, Nature 339 (1989) 385, и Sabin (1973) J. Biol. Standardization 1:115; риновирусов, например, АТСС VR-1110, и вирусов, описанных Arnold (1990) в J. Cell. Biochem L401; вирусов оспы, таких как, вирус оспы канареек или вирус коровьей оспы, например, АТСС VR-111 и ATCC VR-2010, и вирусов, описанных Fisher-Hoch (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. 86:317; Flexner (1989) в Ann. NY Acad. Sci 569:86, Flexner (1990) Vaccine 8:17; в патенте США № 4603112 и 4769330 и WO89/01973; вируса SV40, например, АТСС VR-305, и вирусов, описанных Mulligan (1979) Nature 277:108 и Madzak (1992) в J. Gen. Virol 73:1533; вируса гриппа, например, АТСС VR-797 и рекомбинантных вирусов гриппа, сконструированных с использованием техники "обратной генетики", как описано в патенте США № 5166057 и Enami (1990) в Proc. Natl. Acad. Sci 87:3802-3805; Enami & Palese (1991) в J. Virol 65:2711-2713 и Luytjes (1989) Cell 59:110 (см. также McMichael (1983) NEJ Med. 309:13 и Yap (1978) Nature 273:238 и Nature (1979) 277:108); вируса иммунодефицита человека, описанного в ЕР-0386882 и Buchschacher (1992) J. Virol. 66:2731; вируса кори, например, АТСС VR-67 и VR-1247 и вирусов, описанных в ЕР-0440219; вируса Аура, например, АТСС VR-368; вируса Бебару, например, ATCC VR-600 и ATCC VR-1240; вируса Кабассу, например, ATCC VR-922; вируса Чикунгунья, например, АТСС VR-64 и ATCC VR-1241; вируса Форт-Моргана, например, ATCC VR-924; вируса Гета, например, АТСС VR-369 и АТСС VR-1243; вируса Кузулагач, например, АТСС VR-927; вируса Майяро, например, АТСС VR-66; вируса Мукамбо, например, АТСС VR-580 и АТСС VR-1244; вируса Ндуму, например, АТСС VR-371; вируса Пиксуна, например, АТСС VR-372 и АТСС VR-1245; вируса Тонате, например, АТСС VR-925; вируса Тринити, например, АТСС VR-469; вируса Уна, например, АТСС VR-374; вируса Ватароа, например, АТСС VR-926; вируса Y-62-33, например, ATCC VR-375; вируса О'Ньонг, вируса восточного энцефалита, например, АТСС VR-65 и АТСС VR-1242; вируса западного энцефалита, например, АТСС VR-70, ATCC VR-1251, ATCC VR-622 и АТСС VR-1252; коронавирусов, например, АТСС VR-740 и вирусов, описанных Hamre (1966) в Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 121:190.

Доставка композиций настоящего изобретения в клетки не ограничивается использованием вышеупомянутых векторов. Могут быть использованы и другие методы доставки и среды, например, такие как, векторы экспрессии нуклеиновых кислот; поликатионная конденсированная ДНК, связанная или не связанная лишь с одним "убитым" аденовирусом, см., например, заявку США № 08/366787, поданную 30 декабря 1994, и Curiel (1992) Hum. Gene Ther 3:147-154; связанная с лигандом ДНК, см., например, Wu (1989) J. Biol. Chem 264:16985-16987, носители для доставки в эукариотические клетки, см., например, заявку на патент США рег. № 08/240030, поданную 9 мая 1994, и заявку на патент США 08/404796; осаждение на фотополимеризованные гидрогелевые материалы, лабораторный аппарат типа "дробовика" для выстреливания частиц в целях переноса нужного гена, как описано в патенте США 5149655; ионизирующее облучение, как описано в патенте США 5206152 и в WO92/11033; нейтрализация заряда нуклеиновой кислоты или слияние с клеточными мембранами. Другие методы описаны в работах Philip (1994) Mol. Cell Biol. 14:2411-2418 и Woffendin (1994) Proc. Natl. Acad. Sci., 91:1581-1585.

Перенос генов может быть осуществлен с помощью частиц, см., например, заявку США рег. № 60/023867. Вкратце, последовательность может быть встроена в соответствующие векторы, которые содержат соответствующие регуляторные последовательности для обеспечения высокого уровня экспрессии и которые затем инкубируют с синтетическими молекулами для переноса генов, такими как, полимерные ДНК-связывающие катионы, такие как, полилизин, протамин и альбумин, связанные с лигандами, обеспечивающими доставку в клетки-мишени, такими как, азиалооросомукоид, как описано в работе Wu & Wu (1987) J. Biol. Chem. 262:4429-4432, инсулин, как описано в работе Hucked (1990) Biochem. Pharmacol. 40:253-263, галактоза, как описано в работе Plank (1992) J. Bioconjugate Chem. 3:533-539, лактоза или трансферрин.

Может быть также использована "голая" ДНК. Примеры методов введения "голой" ДНК описаны в WO90/11092 и в патенте США 5580859. Эффективность введения может быть увеличена с использованием биологически разлагаемых латексных сфер. Покрытые ДНК латексные сферы эффективно транспортируются в клетки после инициации эндоцитоза этими сферами. Этот метод может быть еще более усовершенствован путем обработки этих сфер в целях повышения гидрофобности и, тем самым, облегчения разрушения эндосомы и высвобождения ДНК в цитоплазму.

Липосомы, которые могут действовать как носители для доставки генов, описаны в патенте США 5422120, WO95/13796, WO94/23697, WO91/14445 и ЕР-524968. Как описано в заявке США рег. № 60/023867, для невирусной доставки, последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие полипептид, могут быть встроены в соответствующие векторы, которые содержат соответствующие регуляторные последовательности для обеспечения высокого уровня экспрессии, и которые затем инкубируют с синтетическими молекулами для переноса генов, такими как, полимерные ДНК-связывающие катионы, такие как, полилизин, протамин и альбумин, связанные с лигандами, обеспечивающими доставку в клетки-мишени, такими как, азиалоорозомукоид, инсулин, галактоза, лактоза или трансферрин. Другими системами доставки являются липосомы для инкапсулирования ДНК, содержащей ген под контролем различных тканеспецифических или активных по всех тканях промоторов. Другими невирусными системами доставки, подходящими для использования, являются системы механической доставки, такие как, системы, описанные Woffendin et al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91(24): 11581-11585. Кроме того, кодирующая последовательность и продукт экспрессии этой последовательности могут быть доставлены посредством осаждения фотополимеризованных гидрогелевых материалов. Другими стандартными методами доставки генов, с помощью которых может быть осуществлена доставка кодирующей последовательности, являются, например, использование лабораторного аппарата типа "дробовика" для выстреливания частиц в целях переноса нужного гена, как описано в патенте США 5149655, и использования ионизирующего облучения для активации перенесенного гена, как описано в патенте США 5206152 и в WO92/11033.

Примерами липосом и поликатионных носителей для доставки генов являются липосомы и носители, описанные в патентах США № 5422120 и 4762915; в WO95/13796, WO94/23697 и WO91/14445; в ЕР-0524968 и в работе Stryer, Biochemistry, рр. 236-240 (1975) W.H. Freeman, San Francisco; Szoka (1980) Biochem Biophys Acta 600:1; Bayer (1979) Biochem Biophys Acta 550:464; Rivnay (1987) Meth Enzymol 149:119; Wang (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. 84:7851; Plant (1989) Anal. Biochem 176:420.

Полинуклеотидная композиция может содержать терапевтически эффективное количество носителя для генной терапии, определенного выше. В целях настоящего изобретения, эффективная доза составляет от около 0,01 мг/кг до 50 мг/кг или от 0,05 мг/кг до около 10 мг/кг ДНК-конструкций, предназначенных для введения индивидууму.

Методы доставки

После приготовления нужного состава, полинуклеотидные композиции настоящего изобретения могут быть (1) непосредственно введены индивидууму, (2) введены ex vivo в клетки, выделенные от этого индивидуума, или (3) введены in vitro для экспрессии рекомбинантных белков. Такими индивидуумами, подвергаемыми лечению, могут быть млекопитающие или птицы. Человек также может быть подвергнут лечению этими методами.

Прямую доставку композиций обычно осуществляют путем подкожной, внутрибрюшинной, внутривенной или внутримышечной инъекции, либо путем введения в интерстициальное пространство ткани. Эти композиции могут быть также введены в область поражения. Другие способы введения предусматривают пероральное и внутрилегочное введение, введение с помощью суппозиториев и трансдермальное или чрезкожное введение (см., например, WO98/20734), с использованием игл, аппарата типа "дробовика" для введения генов или безыгольных шприцов. Схема лечения может предусматривать введение однократной дозы или множества доз.

Методы для ex vivo-доставки и реимплантации трансформированных клеток индивидууму известны специалистам и описаны, например, в WO93/14778. Примерами клеток, подходящих для ex vivo-введения, являются, например, стволовые клетки, а в частности, гемопоэтические клетки, лимфоидные клетки, макрофаги, дендритные клетки или опухолевые клетки.

Доставка нуклеиновых кислот как ex vivo, так и in vitro, может быть осуществлена, в основном, следующими методами, например, декстран-опосредованной трансфекцией, преципитацией фосфатом кальция, полибрен-опосредованной трансфекцией, слиянием протопластов, электропорацией, инкапсулированием полинуклеотида(ов) в липосомы и прямой микроинъекции ДНК в ядра клеток, причем, все эти методы хорошо известны специалистам.

Полинуклеотидные и полипептидные фармацевтические композиции

Помимо фармацевтически приемлемых носителей и солей, описанных выше, в полинуклеотидных и/или полипептидных композициях могут быть использованы следующие дополнительные агенты.

А. Полипептиды

Примерами полипептидов являются, но не ограничиваются ими, азиолоорозомукоид (ASOR); трансферрин; азиалогликопротеины; антитела; фрагменты антител; ферритин; интерлейкины; интерфероны; колиниестимулирующий фактор гранулоцитов-макрофагов (GM-CSF), гранулоцит-колониестимулирующий фактор (G-CSF), макрофаг-колониестимулирующий фактор (М-CSF), фактор стволовых клеток и эритропоэтин. Могут быть также использованы вирусные антигены, такие как, белки оболочки. Кроме того, могут быть использованы белки от других инвазивных микроорганизмов, такие как, пептид, состоящий из 17 аминокислот и происходящий от белка круглого спорозоида серповидной пары плазмодия, известный как RII.

В. Гормоны, витамины и т.п.

Другие группы, которые могут быть использованы, включают, например, гормоны, стероиды, андрогены, эстрогены, тироидный гормон или витамины, например, фолиевую кислоту.

С. Полиалкилены, полисахариды и т.п.

Может быть также введен полиалкиленгликоль вместе с нужными полинуклеотидами/полипептидами. В предпочтительном варианте, таким полиалкиленгликолем является полиэтиленгликоль. Кроме того, для этих целей могут быть использованы моно-, ди- или полисахариды. В предпочтительном варианте этого аспекта, таким полисахаридом является декстран или DEAE-декстран. Также могут быть использованы хитозан и поли(лактид-ко-гликолид).

D. Липиды и липосомы

Нужный полинуклеотид/полипептид может быть также инкапсулирован в липиды или упакован в липосомы перед его доставкой индивидууму или в клетки, выделенные от этого индивидуума.

Инкапсулирование липидов осуществляют, в основном, с использованием липосом, которые способны стабилизировать связывание или захват и удерживание нуклеиновой кислоты. Отношение конденсированного полинуклеотида к липидному препарату может варьироваться, но, обычно, оно составляет приблизительно 1:1 (мг ДНК:микромоль липида) или более. Для обзора использования липосом в качестве носителей в целях доставки нуклеиновых кислот, см. Hug and Sleight (1991) Biochim. Biophys. Acta. 1097:1-17; Straubinger (1983) Meth. Enzymol. 101:512-527.

Липосомными препаратами для их использования в настоящем изобретении являются катионные (положительно заряженные), анионные (отрицательно заряженные) и нейтральные препараты. Было показано, что катионные липосомы опосредуют внутриклеточную доставку плазмидной ДНК (Felgner (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7416); мРНК (Malone (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6077-6081) и очищенных факторов транскрипции (Debs (1990) J. Biol. Chem. 265:10189-10192) в функциональной форме.

Катионные липосомы являются легкодоступными. Так, например, N-[1-2,3-диолеилокси)пропил]-N,N,N-триэтиламмониевые (DOTMA) липосомы выпускаются под товарным знаком Липофектин от GIBCO BRL, Grand Island, NY. (а также Felgner, см. выше). Другими коммерчески доступными липосомами являются Трансфектак (DDAB/DOPE) и DOTAP/DOPE (Boerhinger). Другие катионные липосомы могут быть получены из легко доступных материалов с помощью техники, хорошо известной специалистам. См. например, Szoka (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:4194-4198; WO90/11092, где описан синтез липосом DOTAP (на основе 1,2-бис(олеилокси)-3-(триметиламмонио)пропана).

Аналогично, анионные и нейтральные липосомы являются легкодоступными, так, например, они поставляются Avanti Polar Lipids (Birmingham, AL), либо они могут быть элементарно получены с использованием легкодоступных материалов. Такими материалами, среди прочих, являются фосфатидилхолин, холестерин, фосфатидилэтаноламин, диолеоилфосфатидилхолин (DOPC), диолеоилфосфатидилглицерин (DOPG), диолеоилфосфатидилэтаноламин (DOPE). Эти материалы могут быть также смешаны с исходными материалами DOTMA и DOTAP в подходящем соотношении. Методы изготовления липосом с использованием этих материалов хорошо известны специалистам.

Липосомы могут содержать многослойные везикулы (MLV), небольшие однослойные везикулы (SUV), или большие однослойные везикулы (LUV). Различные комплексы "липосома-нуклеиновая кислота" получают способами, известными специалистам. См. например, Straubinger (1983) Meth. Immunol. 101:512-527; Szoka (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:4194-4198; Papahadjopoulos (1975) Biochim. Biophys. Acta 394:483; Wilson (1979) Cell 17:77); Deamer & Bangham (1976) Biochim. Biophys. Acta 443:629; Ostro (1977) Biochem. Biophys. Res. Commun. 76:836; Fraley (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:3348); Enoch & Strittmatter (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:145; Fraley (1980) J. Biol. Chem. (1980) 255:10431; Szoka & Papahadjopoulos (1978) Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 75:145 и Shaefer-Ridder (1982) Science 215:166.

Е. Липопротеины

Кроме того, вместе с полинуклеотидом/полипептидом, предназначенным для доставки, могут быть включены липопротеины. Примерами липопротеинов, которые могут быть использованы, являются: хиломикроны, ЛПВП, ЛПСП, ЛПНП и ЛПОНП. Могут быть также использованы мутанты, фрагменты или гибриды этих белков. Кроме того, могут быть использованы модификации природных липопротеинов, такие как, ацетилированные ЛПНП. Эти липопротеины могут обеспечивать целевую доставку полинуклеотидов в клетки, экспрессирующие липопротеиновые рецепторы. Предпочтительно, чтобы в композицию, вместо другого лиганда для доставки, были включены липопротеины, обеспечивающие доставку нужного полинуклеотида.

Природные липопротеины содержат липид и белковую часть. Белковая часть известна как апопротеины. В настоящее время были выделены и идентифицированы апопротеины А, В, С, D и Е. По крайней мере, два из этих апопротеинов содержат несколько белков, обозначенных римскими цифрами AI, AII, AIV; CI, CII, CIII.

Липопротеин может содержать более одного апопротеина. Так, например, природные хиломикроны состоят из А, В, С и Е, а иногда эти липопротеины не содержат А, а содержат апопротеины С и Е. ЛПОНП содержит апоротеины А, В, С и Е; ЛПНП содержат апопротеин В; а ЛПВП содержит апопротеины А, С и Е.

Аминокислоты этих апопротеинов известны и описаны, например, Breslow (1985), Annu. Rev. Biochem. 54:699; Law (1986), Adv. Exp. Med. Biol. 151:162; Chen (1986), J. Biol. Chem 261:12918; Kane (1980), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:2465 и Ultermann (1984), Human Genet. 65:232.

Липопротеины содержат ряд липидов, включая, триглицериды, холестерин (свободный и в виде сложных эфиров) и фосфолипиды. Состав липидов варьируется в зависимости от природы липопротеинов. Так, например, хиломикроны содержат, главным образом, триглицериды. Более подробное описание липидного состава природных липопротеинов можно найти, например, в Meth. Enzymol. 128 (1986). Липидный состав выбирают так, чтобы конформация апопротеина благоприятствовала активности связывания с рецептором. Липидный состав может быть также выбран так, чтобы он способствовал облегчению гидрофобного взаимодействия и ассоциации с молекулой, связывающейся с полинуклеотидом.

Природные липопротеины могут быть выделены из сыворотки, например, путем ультрацентрифугирования. Эти методы описаны в Meth. Enzymol. (см, выше); Pitas (1980) J. Biochem. 255:5454-5460 и Mahey (1979) J. Clin. Invest. 64:750. Липоротеины могут быть также продуцированы in vitro или методами рекомбинантных ДНК путем экспрессии генов апопротеинов в нужной клетке-хозяине. См., например, Atkinson (1986) Annu. Rev. Biophys. Chem. 15:403 и Radding (1958) Biochim. Biophys. Acta 30:443. Липопротеины могут быть также закуплены у фирм-поставщиков, таких как, Biomedical Technologies, Inc., Stoughton, Massachusetts, USA. Подробное описание липопротеинов можно найти у Zuckermann et al., РСТ/US97/14465.

F. Поликатионные агенты

В композицию, вместе с нужным полинуклеотидом/полипептидом, предназначенным для доставки, могут быть включены поликатионные агенты с липопротеином или без него.

Обычно, поликатионные агенты, при соответствующем физиологическом рН, имеют суммарный положительный заряд и способны нейтрализовать электрический заряд нуклеиновых кислот, что способствует облегчению доставки в нужный участок. Эти агенты могут быть использованы in vitro, ex vivo и in vivo. Поликатионные агенты могут быть использованы для доставки нуклеиновых кислот в живой организм либо внутримышечно, либо подкожно и т.п.

Примерами полипептидов, которые могут быть использованы в качестве поликатионных агентов, являются: полилизин, полиаргинин, полиорнитин и протамин. Другими примерами являются гистоны, протамины, альбумин человеческой сыворотки, ДНК-связывающие белки, не-гистоновые хромосомные белки, оболочечные белки ДНК-вирусов, такие как, Х174 (транскрипционные факторы также содержат домены, которые связываются с ДНК, а поэтому они могут быть использованы в качестве агентов, способствующих конденсации нуклеиновой кислоты). Короче говоря, транскрипционные факторы, такие как, С/СЕВР, с-jun, c-fos, AP-1, AP-2, AP-3, CPF, Prot-1, Sp-1, Oct-1, Oct-2, CREP и TFIID содержат основные домены, которые связываются с ДНК-последовательностями.

Органическими поликатионными агентами являются спермин, спермидин и пуртресцин.

Исходя из вышеуказанного списка, размеры и физические свойства поликатионного агента могут быть проэкстраполированы для конструирования других полипептидных поликатионных агентов или для продуцирования синтетических поликатионных агентов.

Синтетическими поликатионными агентами, которые могут быть использованы, являются например, DEAE-декстран, полибрен. Липофектин^тм и липофектамин^тм (lipofectAMINE^тм) представляют собой мономеры, которые образуют поликатионные комплексы при их комбинации с полинуклеотидами/полипептидами.

Иммунологические анализы

Антигены Neisserial настоящего изобретения могут быть использованы в иммуноанализах для детекции уровней антител (либо, наоборот, антитела против Neisserial могут быть использованы для обнаружения уровней антигена). Взамен инвазивных методов диагностики могут быть разработаны иммуноанализы, основанные на хорошо определенных рекомбинантных антигенах. С помощью этих анализов могут быть обнаружены антитела против белков Neisserial, присутствующих в биологических образцах, включая, например, пробы крови или сыворотки. Протоколы для иммуноанализов подвергались множеству модификаций, и некоторые из них известны специалистам. Протоколы иммуноанализов могут быть основаны, например, на конкурентном связывании, прямых реакциях или на "сэндвич"-анализах. В этих протоколах могут быть, например, использованы твердые подложки, либо они могут быть основаны на иммунопреципитации. Большинство анализов предусматривает использование меченого антитела или полипептида; причем, в качестве меток могут служить, например, флуоресцентные, хемилюминесцентные, радиоактивные или окрашивающие молекулы. Известны также анализы, которые основаны на амплификации сигнала от зонда, и примерами которых являются анализы, проводимые с использованием биотина и авидина, иммуноферментные анализы с использованием меченных ферментом антител и непрямые иммуноанализы, такие как, анализ ELISA.

Наборы, подходящие для иммунодиагностики и содержащие соответствующие меченые реагенты, были сконструированы путем упаковки соответствующих материалов, включая композиции настоящего изобретения, в подходящие контейнеры вместе с остальными реагентами и материалами (например, подходящими буферами, солевыми растворами и т.п.), необходимыми для проведения анализа, а также с соответствующим руководством по проведению анализа.

Гибридизация нуклеиновых кислот

Термин "гибридизация" означает связывание двух последовательностей нуклеиновых кислот друг с другом посредством водородной связи. Обычно, одну последовательность фиксируют на твердом носителе, а другая присутствует в растворе в свободном виде. Затем, эти две последовательности подвергают контакту друг с другом в условиях, благоприятствующих образованию водородной связи. Факторами, которые влияют на образование этой связи, являются типы и объем растворителя; реакционная температура, время гибридизации, перемешивание, агенты, блокирующие неспецифическое связывание последовательности в жидкой фазе с твердым носителем (реагент Денхардта или BLOTTO); концентрация этих последовательностей; использование соединений для повышения скорости ассоциации последовательностей (сульфат декстрана или полиэтиленгликоль) и жесткость условий промывки после гибридизации. Sambrook et al., [см. выше], т.2, гл.9, стр.9.47-9.57.

Термин "жесткость" условий относится к условиям реакции гибридизации, которые благоприятствуют присоединению последовательностей с очень высокой степенью гомологии, но не отличающихся последовательностей. Так, например, комбинация таких параметров, как температура и концентрация соли должна быть выбрана так, чтобы температура плавления (Tm), вычисленная для гибрида в этом исследовании, составляла приблизительно ниже 120-200°С. Температура и концентрация соли могут быть, в большинстве случаев, определены эмпирически в предварительных экспериментах, в которых образцы геномной ДНК, иммобилизованной на фильтрах, подвергают гибридизации с нужной последовательностью, а затем промывают в условиях различной жесткости. См, Sambrook et al., на стр. 9.50.

Параметрами, рассматриваемыми при осуществлении, например, Саузерн-блот-анализа, являются (1) вариабельность блотируемой ДНК и (2) гомология между зондом и детектируемыми последовательностями. Общее количество исследуемых фрагментов может отличаться на порядок (× 10), от 0,1-1 мкг для гидролизата плазмиды или фага до 10^-9 - 10^-8 г для одной копии гена в высокой степени вариабельном эукариотическом геноме. Для полинуклеотидов с низкой вариабельностью могут быть использованы более короткое время блоттинга, гибридизации и экспонирования, меньшее количество исходных полинуклеотидов и более низкая специфическая активность зондов. Так, например, однокопийный дрожжевой ген может быть обнаружен при экспонировании в течение лишь 1 часа исходя из 1 мкг дрожжевой ДНК при блоттинге в течение двух часов и при гибридизации в течение 4-8 часов с использованием зонда 10⁸ cpm/pg. Для однокопийного гена млекопитающего, обычная процедура предусматривает использование 10 мкг исходной ДНК, проведение блоттинга в течение ночи и гибридизацию в течение ночи в присутствии 10% сульфата декстрана с использованием зонда с более, чем 10⁸ cpm/pg, что требует времени экспонирования ˜24 часа.

На температуру плавления (Tm) ДНК-ДНК-гибрида, образованного между зондом и нужным фрагментом, а следовательно, на соответствующие условия гибридизации и промывки, могут влиять несколько факторов. Во многих случаях, этот зонд не имеет 100%-ную гомологию с данным фрагментом. Другими обычно рассматриваемыми параметрами являются длины гибридизующихся последовательностей и общее содержание в них G+С, а также ионная сила и содержание формамида в буфере для гибридизации. Влияние всех этих факторов может быть приблизительно представлено одним уравнением:

Tm=81 + 16,6(log₁₀Ci) + 0,4[%(G+C)] - 0,6(%формамид)-600/n-1,5(%несоответствий),

где Ci означает концентрацию соли (одновалентных ионов), а n означает длину гибрида, выраженную в парах оснований (слегка модифицированное уравнение, взятое из Meinkoth & Wahl (1984) Anal. Biochem. 138:267-284).

При разработке эксперимента по гибридизации, некоторые факторы, влияющие на гибридизацию нуклеиновых кислот, могут быть соответствующим образом изменены. Легче всего поддаются коррекции такие параметры, как температура гибридизации и промывки, а также концентрация соли во время промывки. По мере возрастания температуры гибридизации (то есть, условий жесткости), становится менее вероятным, что гибридизация будет происходить между негомологичными цепями, и в результате этого фон снижается. Если радиоактивно меченный зонд не является полностью гомологичным иммобилизованному фрагменту (как это часто бывает в случае экспериментов по гибридизации семейства генов и межвидовой гибридизации), то температура гибридизации должна быть уменьшена, но при этом фон будет возрастать. Температура промывки одинаково влияет на интенсивность зон гибридизации и на уровень фона. Жесткость промывки также повышается со снижением концентраций соли.

В основном, обычная температура гибридизации в присутствии 50% формамида составляет 42°С для зонда, имеющего 95%-100%-ную гомологию с фрагментом-мишенью, 37°С для 90%-95%-ной гомологии и 32°С 85%-90%-ной гомологии. Для более низкой степени гомологии, содержание формамида должно быть снижено, а температура надлежащим образом скорректирована в соответствии с вышеприведенным уравнением. Если неизвестно, имеется ли гомология между зондом и целевым фрагментом, то проще всего начать с нежестких условий гибридизации и промывки. Если после авторадиографии наблюдаются неспецифические полосы или высокий фон, то фильтр может быть промыт в условиях высокой жесткости и повторно экспонирован. Если время, требуемое для экспонирования, делает этот метод непрактичным, то могут быть параллельно протестированы несколько условий жесткости гибридизации и/или промывки.

Анализы с использованием зондов нуклеиновых кислот

Такие методы, как ПЦР, анализ с использованием разветвленных ДНК-зондов или техника блоттинга с применением зондов нуклеиновых кислот в соответствии с настоящим изобретением позволяют обнаруживать присутствие кДНК или мРНК. Говорят, что зонд "гибридизуется" с последовательностью настоящего изобретения, в том случае, если он может образовывать дуплекс или двухцепочечный комплекс, который является достаточно стабильным для его обнаружения.

Нуклеиновокислотные зонды будут гибридизоваться с нуклеотидными последовательностями Neisserial настоящего изобретения (включая как смысловую, так и антисмысловую цепи). Хотя многие различные нуклеотидные последовательности кодируют аминокислотную последовательность, однако, предпочтительной является нативная последовательность Neisserial, поскольку, она является реальной последовательностью, присутствующей в клетках. мРНК представляет собой кодирующую последовательность, а поэтому зонд должен быть комплементарен этой кодирующей последовательности; одноцепочечная кДНК должна быть комплементарна мРНК, а следовательно, кДНК-зонд должен быть комплементарен некодирующей последовательности.

Последовательность зонда не должна быть обязательно идентичной последовательности Neisserial (или ее комплементу), при этом, некоторые изменения в этой последовательности и в ее длине могут приводить к увеличению чувствительности анализа в том случае, если зонд нуклеиновых кислот может образовывать дуплекс с нуклеотидами-мишенями, которые могут быть детектированы. Кроме того, зонд нуклеиновых кислот может включать дополнительные нуклеотиды для стабилизации образованного дуплекса. Другая последовательность Neisserial может также служить меткой для обнаружения образованного дуплекса. Так, например, не-комплементарная нуклеотидная последовательность может быть присоединена к 5′-концу зонда при условии, что остальная часть последовательности зонда должна быть комплементарна последовательности Neisserial. Альтернативно, не-комплементарные основания или более длинные последовательности могут быть встроены в зонд, при условии, что последовательность зонда достаточно комплементарна последовательности Neisserial для того, чтобы он мог гибридизоваться с ней с образованием дуплекса, который может быть обнаружен.

Точная длина и последовательность зонда зависят от условий гибридизации, таких как, температура, концентрация соли и т.п. Так, например, для диагностических целей, в зависимости от вариабельности последовательности аналита, зонд нуклеиновой кислоты обычно содержит, по крайней мере, 10-20 нуклеотидов, предпочтительно, 15-25, а более предпочтительно, по крайней мере, 30 нуклеотидов, хотя может быть использован и более короткий зонд. Короткие праймеры обычно требуют более низких температур для образования достаточно стабильных гибридных комплексов с матрицей.

Зонды могут быть получены методом синтеза, таким как, метод с использованием сложного триэфира, описанный Matteucci et al. [J. Am. Chem. Soc. (1981) 103:3185], или описанный Urdea et al. [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, (1983) 80:7461], или с использованием коммерчески доступных автоматических синтезаторов олигонуклеотидов.

Химическая природа этого зонда может быть выбрана в соответствии с предпочтениями. Для некоторых целей, подходящими являются ДНК или РНК. Для других целей, могут быть введены модификации, например, модификации в остове, такие как, фосфоротиолаты или метилфосфонаты, могут быть использованы для увеличения времени полужизни in vivo, для изменения аффинности РНК, и для увеличения резистентности к нуклеазе и т.п. [см. например, Agrawal & Iyer (1995) Curr Opin Biotechnol 6:12-19; Agrawal (1996) TIBTECH 14:376-387]; а также могут быть использованы аналоги, такие как, связанные с пептидом нуклеиновые кислоты [см. например, Corey (1997) TIBTECH 15:224-229; Buchardt et al., (1993) TIBTECH 11:384-386].

Альтернативно, другим хорошо известным способом детекции небольших количеств нуклеиновых кислот-мишеней является полимеразная цепная реакция (ПЦР). Этот анализ описан в работе Mullis et al. [Meth. Enzymol. (1987) 155:335-350]; в патентах США № 4683195 и 4683202. Два нуклеотида-"праймера" гибридизуются с нуклеиновыми кислотами-мишенями и используются для инициации реакции. Для обеспечения стабильности дуплекса или, например, для введения подходящего рестрикционного сайта, эти праймеры могут содержать последовательность, которая не гибридизуется с последовательностью амплифицируемой мишени (или ее комплемента). Обычно, такая последовательность будет фланкировать нужную последовательность Neisserial.

Термоустойчивая полимераза образует копии нуклеиновых кислот-мишеней из праймеров с использованием исходных нуклеиновых кислот-мишеней в качестве матриц. После того, как под действием полимеразы генерируется пороговое количество нуклеиновых кислот-мишеней, они могут быть обнаружены более традиционными методами, такими как, Саузерн-блот-анализы. При использовании Саузерн-блот-анализа, меченые зонды будут гибридизоваться с последовательностью Neisserial (или его комплементом).

Кроме того, мРНК или кДНК могут быть обнаружены стандартными методами блоттинга, описанными Sambrook et al. [см. выше]. мРНК или кДНК, генерированные из мРНК с использованием фермента полимеразы, могут быть очищены и разделены с помощью гель-электрофореза. Затем, эти нуклеиновые кислоты на геле переносят методом блоттинга на твердый носитель, такой как, нитроцеллюлоза. Этот твердый носитель экспонируют меченым зондом, а затем промывают для удаления всех негибридизовавшихся зондов. Затем обнаруживают дуплексы, содержащие меченый зонд. Обычно, этот зонд метят радиоактивной меткой.

Краткое описание чертежей

На Фиг.1-7 представлены биохимические данные и анализ последовательностей, описанных в Примерах 1, 2, 3, 7, 13, 16 и 19, соответственно, с открытыми рамками считывания (ORF) 40, 38, 44, 52, 114, 41 и 124. М1 и М2 представляют собой маркеры молекулярных масс. Стрелки указывают на положение главного рекомбинантного продукта или, в Вестерн-блотах, на положение главной иммунореактивной полосы N. meningitidis. ТР означает полный белковый экстракт N. meningitidis; OMV означает препарат из везикул внешней мембраны N. meningitidis. Результаты бактериальных анализов; ромб () означает данные, полученные перед иммунизацией; треугольник (▴) означает контрольные данные, полученные с GST; кружок (●) означает данные, полученные с рекомбинантным белком N. meningitidis. С помощью компьютерного анализа был получен график гидрофильности (вверху), график индекса антигенности (в середине) и AMPHI-анализ (внизу). Для предсказания Т-клеточных эпитопов была использована программа AMPHI [Gao et al., (1989) J. Immunol. 143:3007; Roberts et al., (1996) AIDS Res Hum Retrovir 12:593; Quakyi et al., (1992) Scand J. Immunol suppl. 11:9), которая имеется в пакете Protean программ DNASTAR, Inc. (1228 South Park Street, Madison, Wisconsin 53715 USA).

Примеры

В примерах описаны последовательности нуклеиновых кислот, которые были идентифицированы в N. meningitidis вместе с их предполагаемыми продуктами трансляции. Не все из этих последовательностей нуклеиновых кислот являются полными, то есть, они кодируют менее, чем полноразмерный белок дикого типа. Очевидно, что в данном случае, ни одна из ДНК-последовательностей, описанных в данной заявке, не имеет значительной гомологии с N.gonorrhoeae.

Примеры имеют, в основном, следующий формат:

- нуклеотидная последовательность, которая была идентифицирована в N. meningitidis (штамм В);

- предполагаемый продукт трансляции этой последовательности;

- компьютерный анализ продукта трансляции на основе сравнения базы данных;

- соответствующие генная и белковая последовательности, идентифицированные в N. meningitidis (штамм А)- описание характеристик белков, которые указывают на то, что они могут иметь подходящие антигенные свойства;

- результаты биохимического анализа (экспрессия, очистка, ELISA, FACS и т.п.).

В этих примерах подробно рассматривается гомология последовательностей между видами и штаммами. Белки, которые имеют аналогичные последовательности, обычно, имеют сходную структуру и функции, и эта гомология часто указывает на то, что они имеют общее эволюционное происхождение. Сравнение с последовательностями белков, имеющих известные функции, широко используется в качестве ориентира для присвоения новой последовательности предполагаемой функции белка и может конкретно использоваться в анализах всего генома.

Сравнение последовательностей осуществляли в NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) с использованием алгоритмов BLAST, BLAST2, BLASTn, BLASTp, tBLASTn, BLASTx & tBLASTx [см. также Altschul et al., (1997) "Gapped BLAST and PSI-BLAST; a new generation of protein database search programs". Nucleic Acids Research 25:2289-3402]. Был проведен поиск по следующим базам данных: неизбыточные последовательности GenBank+EMBL+DDBJ+PDB и трансляция неизбыточных последовательностей GenBank CDS+ последовательности PDB+SwissProt+SPupdate+PIR.

Точки внутри нуклеотидных последовательностей (например, в положении 288 в Примере 12) означают нуклеотиды, которые были произвольно введены для сохранения рамки считывания. Аналогичным образом были удалены нуклеотиды, подчеркнутые двумя линиями. Нижние строчные буквы (например, в положении 589 в Примере 12) означают неоднозначности, которые возникают в процессе сравнительного анализа независимых реакций секвенирования (некоторые из нуклеотидных последовательностей в этих примерах получают после объединения результатов двух или более экспериментов).

Для предсказания присутствия гиброфобных доменов, нуклеотидные последовательности были сканированы во всех шести рамках считывания с использованием алгоритма на основе статистических исследований, проведенных Esposti et al. [Critical evaluation of the hydropathy of membrane proteins (1990) Eur. J. Biochem. 190:207-219]. Эти домены представляют собой возможные трансмембранные области или гидрофобные лидерные последовательности.

Открытые рамки считывания (ORF) были предсказаны, исходя из фрагментированных нуклеотидных последовательностей с использованием программы ORFFINDER (NCBI).

Подчеркнутые аминокислотные последовательности указывают на предполагаемые трансмембранные домены или лидерные последовательности в ORF, предсказанные с использованием алгоритма PSORT (http://www.psort.nibb.ac.jp). Функциональные домены также предсказаны с использованием программы MOTIFS (GCG Wisconsin & PROSITE).

Для оценки in vivo-иммуногенности белков, идентифицированных в примерах, могут быть использованы различные тесты. Так, например, белки могут быть экспрессированы методом рекомбинантных ДНК и использованы для скрининга сыворотки пациента путем иммуноблоттинга. Положительная реакция между белком и сывороткой пациента указывает на то, что у этого пациента был предварительно выработан иммунный ответ на интересуемый белок, т.е., этот белок является иммуногеном. Этот метод может быть также использован для идентификации иммунодоминантных белков.

Этот рекомбинантный белок может быть также легко использован для продуцирования антител, например, у мышей. Эти антитела могут быть использованы для прямого подтверждения того факта, что этот белок локализован на поверхности клетки. Меченое антитело (например, флуоресцентное мечение для FACS) может быть инкубировано с интактными бактериями и присутствие метки на поверхности бактерии подтверждает локализацию этого белка.

В частности, для экспрессии, очистки и биохимической характеризации белков настоящего изобретения были использованы следующие методы (А)-(S).

А) Получение хромосомной ДНК:

Штамм 2996 N. meningitidis культивировали до экспоненциальной фазы роста в 100 мл среды GC, собирали путем центрифугирования и ресуспендировали в 5 мл буфера (20% сахароза, 50 мМ Трис-HCl, 50 мМ EDTA, pH 8). После инкубирования в течение 10 минут на льду, бактерии подвергали лизису путем добавления 10 мл раствора для лизиса (50 мМ NaCl, 1% Na-саркозила, 50 мкг/мл протеиназы К) и полученную суспензию инкубировали при 37°С в течение 2 часов. Были проведены две экстракции фенолом (уравновешенным до рН 8) и одна экстракция смесью CHCl₃/изоамиловый спирт (24:1). ДНК осаждали путем добавления 0,3 М ацетата натрия и 2 объемов этанола и собирали путем центрифугирования. Осадок один раз промывали 70% этанолом и снова растворяли в 4 мл буфера (10 мМ Трис-HCl, 1 мМ EDTA, pH 8). Концентрацию ДНК измеряли путем считывания при оптической плотности (ОП) 260 нм.

В) Конструирование олигонуклеотидов:

Синтетические олигонуклеотидные праймеры конструировали на основе кодирующей последовательности каждой из ORF с использованием (а) последовательности meningococcus B, если она присутствует, или (b) последовательности gonococcus/meningococcus A, адаптированной к предпочтительной встречаемости кодонов в менингоккоках, если это необходимо. Все предсказанные сигнальные пептиды были исключены путем выведения 5′-концевой последовательности праймера для амплификации, расположенной непосредственно ниже от предсказанной лидерной последовательности.

5′-Праймеры включают два рестрикционных сайта распознавания ферментом (BamHI-NdeI, BamHI-NheI или EcoRI-NheI, в зависимости от рестрикционной карты самого гена); 3′-праймеры включают рестрикционный XhoI-сайт. Эта процедура разработана для прямого клонирования каждого продукта амплификации (соответствующего каждой ORF) в две различные экспрессирующие системы: pGEX-KG (с использованием либо BamHI-XhoI, либо EcoRI-XhoI) и рЕТ21b+ (с использованием либо NdeI-XhoI либо NheI-XhoI).

Хвост 5′-концевого праймера: CGCGGATCCCATATG (BamHI-NdeI)

CGCGGATCCGCTAGC (BamHI-NheI)

CCGGAATTCTAGCTAGC (EcoRI-NheI)

Хвост 3′-концевого праймера: CCCGCTCGAG (XhoI).

Кроме того, праймеры, содержащие последовательности распознавания рестриктирующих ферментов, включают нуклеотиды, которые гибридизуются с амплифицируемой последовательностью. Число гибридизующихся нуклеотидов зависит от температуры плавления всего праймера и было определено для каждого праймера с использованием формул:

T_m = 4(G +С)+2(А+Т) (исключая хвост)

T_m = 64,9+0,41(%GC)-600/N (весь праймер)

Средняя температура плавления для отобранных олигонуклеотидов составляла 65-70°С для всего олигонуклеотида и 50-55°С для одной гибридизующейся области.

В Таблице 1 представлены прямой и обратный праймеры, используемые для каждой амплификации. Олигонуклеотиды были синтезированы на синтезаторе ДНК-РНК Perkin-Elmer 394, элюированы с колонок в 2 мл NH₄ОН и деблокированы путем инкубирования в течение 5 часов при 56°С. Эти олигонуклеотиды осаждали путем добавления 0,3 М Na-ацетата и 2 объемов этанола. Затем образцы центрифугировали, и осадки ресуспендировали либо в 100 мкл, либо в 1 мл воды. ОП₂₆₀ определяли с использованием спектрофотометра Perkin-Elmer Lambda Bio, а затем определяли концентрацию и доводили ее до 2-10 пмоль/мкл.

С) Амплификация

Ниже представлен протокол проведения стандартной ПЦР: в качестве матрицы использовали 50-200 нг геномной ДНК в присутствии 20-40 мкМ каждого олигонуклеотида, 400-800 мкМ раствора dNTP, 1 × ПЦР-буфера (включая 1,5 мМ MgCl₂), 2,5 единиц ДНК-полимеразы TaqI (с использованием Perkin-Elmer AmpliTaQ, GIBCO Platinum, ДНК-полимеразы Pwo или полимеразы Taq Tahara Shuzo).

В некоторых случаях, ПЦР оптимизировали путем добавления 10 мкл ДМСО или 50 мкл 2 М бетаина.

После горячей инициации (путем добавления полимеразы в течение предварительного 3-минутного инкубирования всей смеси при 95°С), каждый образец подвергали двухстадийной амплификации: первые 5 циклов осуществляли при температуре гибридизации с использованием одного из олигонуклеотидов, за исключением хвоста рестриктирующих ферментов, а затем проводили 30 циклов в соответствии с температурой гибридизации полноразмерных олигонуклеотидов. После этих циклов, проводили конечную стадию удлинения в течение 10 минут при 72°С.

Ниже представлены стандартные условия проведения циклов:

 ДенатурацияГибридизацияУдлинениеПервые 5 циклов30 с
95°С30 с
50-55°С30-60 с
72°СПоследние 30 циклов30 с
95°С30 с
65-70°С30-60 с
72°С

Время удлинения варьировалось в зависимости от длины амплифицируемой ORF.

Амплификацию осуществляли с использованием либо системы Perkin-Elmer Gene-Amp PCR 9600, либо 2400. Для проверки результатов, 1/10 объема амплификации загружали на 1-1,5% агарозный гель и размер каждого амплифицированного фрагмента сравнивали с маркером молекулярной массы ДНК.

Амплифицированную ДНК либо загружали непосредственно на 1% агарозный гель, либо сначала осаждали этанолом и ресуспендировали в подходящем объеме для загрузки на 1% агарозный гель. Затем, ДНК-фрагмент, соответствующий полосе нужного размера, элюировали и выделяли из геля с использованием набора для экстракции из геля Qiagen Gel Extraction Kit в соответствии с инструкциями производителя. Конечный объем ДНК-фрагмента составлял 30 мкл или 50 мкл воды или 10 мМ Трис, рН 8,5.

D. Рестрикция ПЦР-фрагментов

Очищенную ДНК, соответствующую амплифицированному фрагменту, разделяли на две аликвоты и подвергали двойной рестрикции ферментами:

- NdeI/XhoI или NheI/XhoI для клонирования в рЕТ-21b+ с последующей экспрессией белка в виде гибрида с С-концевой His-меткой.

- BamHI/XhoI или EcoRI/XhoI для клонирования в pGEX-KG с последующей экспрессией белка в виде гибрида с N-концевым GST.

- EcoRI/PstI, EcoRI/SalI, SalI/PstI для клонирования в pGex- His с последующей экспрессией белка в виде гибрида с N-концевой His-меткой.

Каждый очищенный ДНК-фрагмент инкубировали (при 37°С, в течение периода времени от 3 часов до ночи) с использованием 20 единиц каждого рестриктирующего фермента (New England Biolabs) в конечном объеме 30 или 40 мкл в присутствии подходящего буфера. Затем продукт рестрикции очищали с использованием набора для ПЦР-очистки QIAquick PCR в соответствии с инструкциями производителя и элюировали в конечном объеме 30 или 50 мкл воды или 10 мМ Трис-HCl, рН 8,5. Конечную концентрацию ДНК определяли путем электрофореза на 1% агарозном геле в присутствии титрованного маркера молекулярной массы.

Е. Рестрикция клонирующих векторов (рЕТ22В, pGEX-KG, pTRC-His A, и pGex-His)

10 мкл плазмиды подвергали двойной рестрикции 50 единицами каждого рестриктирующего фермента в 200 мкл реакционного объема в присутствии подходящего буфера путем инкубирования в течение ночи при 37°С. После загрузки целого гидролизата на 1% агарозный гель, полосу, соответствующую рестриктированному вектору, выделяли из геля с использованием набора для экстракции из геля Qiagen QIAquick Gel Extraction Kit), и ДНК элюировали в 50 мкл 10 мМ Трис-HCl, рН 8,5. Концентрацию ДНК оценивали путем измерения ОП₂₆₀ образца и доводили до 50 мкг/мкл. Для каждой процедуры клонирования использовали 1 мкл плазмиды.

Вектор pGEX-His представляет собой модифицированный вектор pGEX-2Т, несущий область, кодирующую шесть гистидиновых остатков, расположенных выше сайта расщепления тромбина, и содержащую сайт множественного клонирования вектора pTRC99 (Pharmacia).

F. Клонирование

Фрагменты, соответствующие каждой ORF, предварительно рестриктированной и очищенной, лигировали в рЕТ22b и pGEX-KG. В конечном объеме 20 мкл, фрагмент/вектор в молярном отношении 3:1 лигировали с использованием 0,5 мкл ДНК-лигазы Т4 NEB (400 единиц/мкл) в присутствии буфера, поставляемого производителем. Реакционную смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 3 часов. В некоторых экспериментах, лигирование осуществляли с использованием набора для быстрого лигирования Boehringer ("Rapid Ligation Kit") в соответствии с инструкциями производителя.

Для введения рекомбинантной плазмиды в подходящий штамм, 100 мкл компетентных клеток DH5 E.coli инкубировали с реакционным раствором лигазы на льду в течение 40 минут, а затем при 37°С в течение 3 минут, и после добавления 800 мкл бульона LB снова инкубировали при 37°С в течение 20 минут. Затем клетки центрифугировали на максимальной скорости в микроцентрифуге Эппендорфа и ресуспендировали приблизительно в 200 мкл супернатанта. Затем, эту суспензию высевали на LB-среду с ампициллином (100 мг/мл).

Скринирование рекомбинантных клонов осуществляли путем культивирования 5 произвольно выбранных колоний в течение ночи при 37°С, либо в 2 мл LB-бульона (с клонами pGEX или рТС) или 5 мл LB-бульона (с клонами рЕТ) + 100 мкг/мл ампициллина. Затем эти клетки осаждали и ДНК экстрагировали с использованием набора Qiagen QIAprep Spin Miniprep Kit в соответствии с инструкциями производителей до получения конечного объема 30 мкл. 5 мкл каждого отдельного минипрепарата (приблизительно 1 г) рестриктировали либо NdeI/XhoI, либо BamHI/XhoI и весь гидролизат загружали на 1-1,5% агарозный гель (в зависимости от предполагаемого размера вставки) одновременно с маркером молекулярной массы (ДНК-лэддер размером 1 т.п.о., GIBCO). Скрининг положительных клонов проводили исходя из правильного размера вставки.

G. Экспрессия

Каждую ORF, клонированную в экспрессирующий вектор, трансформировали в штамм, подходящий для экспрессии рекомбинантного белкового продукта. 1 мкл каждой конструкции использовали для трансформации 30 мкл BL21 E.coli (вектор pGEX), ТОР 10 E.coli (вектор pTRC) или BL21-DE3 E.coli (вектор рЕТ), как описано выше. В случае вектора pGEX-His, для первоначального клонирования и экспрессии использовали тот же самый штамм E.coli (W3110). Одиночные рекомбинатные колонии инокулировали в 2 мл LB + Amp (100 мкг/мл), инкубировали в течение ночи при 37°С, а затем разводили 1:30 в 20 мл LB+Amp (100 мкг/мл) в 1000-мл колбах для того, чтобы ОП₆₀₀ составляла в пределах от 0,1 до 0,15. Колбы инкубировали при 30°С в ротационных шейкерах с водяной баней до тех пор, пока ОП не указывала на экспоненциальный рост, соответствующий индуцированию экспрессии (ОП 0,4-0,8 для векторов рЕТ и pTRC; ОП 0,8-1 для векторов pGEX и pGEX-His). Для векторов рЕТ, pTRC и pGEX-His, экспрессию белка индуцировали путем добавления 1 мМ IPTG, а в случае системы pGEX, конечная концентрация IPTG составляла 0,2 мМ. После инкубирования в течение 3 часов при 30°С, конечную концентрацию образца оценивали по ОП. Для оценки экспрессии, 1 мл каждого образца удаляли, центрифугировали в микроцентрифуге, осадок ресуспендировали в PBS и анализировали с помощью электрофореза на 12% ПААГ с ДСН с окрашиванием кумасси синим. Целый образец центрифугировали при 6000 g и осадок ресуспендировали в PBS для последующего использования.

Н. Крупномасштабная очистка GST-гибридных белков

Одиночную колонию культивировали в течение ночи при 37°С на агаровой чашке с LB + Amp. Бактерии инокулировали в 20 мл жидкой культуры LB + Amp в шейкере с водяной баней и культивировали в течение ночи. Бактерии разводили 1:30 в 600 мл свежей среды и оставляли для культивирования при оптимальной температуре (20-37°С) до ОП₅₅₀ 0,8-1. Экспрессию белка индуцировали 0,2 мМ IPTG с последующим инкубированием в течение трех часов. Эту культуру центрифугировали при 8000 об/мин при 4°С. Затем, супернатант отбрасывали и бактериальный осадок ресуспендировали в 7,5 мл холодного PBS. Клетки разрушали путем обработки ультразвуком на льду в течение 30 секунд при 40 Вт с использованием ультразвукового устройства В-15 Branson, а затем замораживали, два раза оттаивали и снова центрифугировали. Супернатант собирали и смешивали со 150 мкл смолы глутатионсефарозы 4В (Pharmacia) (предварительно промытой PBS) и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 минут. Полученный образец центрифугировали при 700 g в течение 5 минут при 4°С. Смолу два раза промывали 10 мл холодного PBS в течение 10 минут, ресуспендировали в 1 мл холодного PBS и загружали на сменную колонку. Смолу два раза промывали 2 мл холодного PBS до тех пор, пока ОП₂₈₀ промывки не достигала 0,02-0,06. GST-гибридный белок элюировали путем добавления 700 мкл холодного глутатионового буфера для элюирования (10 мМ восстановленный глутатион, 50 мМ Трис-HCl), и фракции собирали до тех пор, пока ОП₂₈₀ не достигала 0,1. 21 мкл каждой фракции загружали на 12% ДСН-гель с помощью ДСН-ПААГ Biorad и с использованием широкого ряда стандартов молекулярной массы (М1) (200, 116,25, 97,4, 66,2, 45, 31, 21,5, 14,4, 6,5 кДа) или маркера Amersham Rainbow Marker (M2) (220, 66, 46, 30, 21,5, 14,3 кДа) в качестве стандартов. Поскольку молекулярная масса (Mw) GST составляет 26 кДа, то эта величина должна быть добавлена к величине Mw каждого GST-гибридного белка.

I. Анализ растворимости His-гибрида

Для анализа растворимости His-гибридных продуктов экспрессии, осадки от 3 мл культур ресуспендировали в буфере M1 [500 мкл PBS pH 7,2]. Затем добавляли 25 мкл лизоцима (10 мг/ мл) и бактерии инкубировали в течение 15 минут при 4°С. Осадок обрабатывали ультразвуком в течение 30 секунд при 40 Вт с использованием ультразвукового устройства В-15 Branson, а затем замораживали, два раза оттаивали, после чего снова выделяли осадок, и супернатант центрифугировали. Супернатант собирали, и остаток ресуспендировали в буфере М2 [8 М мочевина, 0,5 М NaCl, 20 мМ имидазол и 0,1 М NaH₂PO₄] и инкубировали в течение 3-4 часов при 4°С. После центрифугирования, супернатант собирали, и осадок ресуспендировали в буфере М3 [6 М гуанидиний-HCl, 0,5 М NaCl, 20 мМ имидазол и 0,1 М NaH₂PO₄] в течение ночи при 4°С. Супернатанты от всех стадий анализировали с помощью электрофореза в ПААГ с ДСН.

J. Крупномасштабная очистка His-гибрида

Одиночную колонию культивировали на агаровой чашке с LB + Amp в течение ночи при 37°С. Бактерии инокулировали в 20 мл жидкой культуры LB + Amp и инкубировали в шейкере с водяной баней в течение ночи. Бактерии разводили 1:30 в 600 мл свежей среды и оставляли для культивирования при оптимальной температуре (20-37°С) до ОП₅₅₀ 0,6-0,8. Экспрессию белка индуцировали путем добавления 1 мМ IPTG с последующим инкубированием культуры в течение трех часов. Эту культуру центрифугировали при 8000 об/мин при 4°С. Затем, супернатант отбрасывали, и бактериальный осадок ресуспендировали в 7,5 мл либо (i) холодного буфера А (300 мМ NaCl, 50 мМ фосфатного буфера, 10 мМ имидазола, рН 8) для растворимых белков, либо (ii) буфера В (мочевина 8 М, 10 мМ Трис-HCl, 100 мМ фосфатного буфера, рН 8,8) для нерастворимых белков.

Клетки разрушали путем обработки ультразвуком на льду в течение 30 секунд при 40 Вт с использованием ультразвукового устройства В-15 Branson, а затем замораживали, два раза оттаивали и снова центрифугировали.

Для нерастворимых белков, супернатант помещали на хранение при -20°С, а осадок ресуспендировали в 2 мл буфере С (6 М гидрохлорида гуанидина, 100 мМ фосфатного буфера, 10 мМ Трис-HCl, рН 7,5) и обрабатывали в гомогенизаторе в 10 циклов. Полученный продукт центрифугировали при 13000 об/мин в течение 40 минут.

Супернатанты собирали и смешивали со 150 мкл Ni²⁺-смолы (Pharmacia) (предварительно промытой, при необходимости, буфером А или буфером В) и инкубировали, слегка помешивая, при комнатной температуре в течение 30 минут. Полученный образец центрифугировали при 700 g в течение 5 минут при 4°С. Смолу два раза промывали 10 мл буфера А или буфера В в течение 10 минут, ресуспендировали в 1 мл буфера А или буфера В и загружали на сменную колонку. Смолу промывали либо (i) 2 мл холодного буфера А при 4°С, либо (ii) 2 мл буфера В при комнатной температуре до тех пор, пока ОП₂₈₀ промывки не достигала 0,02-0,06.

Смолу промывали либо (i) 2 мл холодного 20 мМ имидазолового буфера (300 мМ NaCl, 50 мМ фосфатного буфера, 20 мМ имидазола, рН 8), либо (ii) буфера D (мочевина 8 М, 10 мМ Трис-HCl, 100 мМ фосфатного буфера, рН 6,3) до тех пор, пока ОП₂₈₀ промывки не достигала 0,02-0,06. His-гибридный белок элюировали путем добавления 700 мкл либо (i) холодного буфера А для элюирования (300 мМ NaCl, 50 мМ фосфатного буфера, 250 мМ имидазола, рН 8), либо (ii) буфера В для элюирования (мочевина 8 М, 10 мМ Трис-HCl, 100 мМ фосфатного буфера, рН 4,5) и фракции собирали до тех пор, пока ОП₂₈₀ не достигала 0,1. 21 мкл каждой фракции загружали на 12% гель с ДСН.

К. Ренатурация His-гибридных белков

К денатурированным белкам добавляли 10% глицерин. Затем эти белки разводили до концентрации 20 мкг/мл с использованием буфера для диализа (10% глицерин, 0,5 М аригинин, 50 мМ фосфатный буфер, 5 мМ восстановленный глутатион, 0,5 мМ окисленный глутатион, 2 М мочевина, рН 8,8) и диализовали против того же самого буфера при 4°С в течение 12-14 часов. Затем этот белок диализовали против буфера II (10% глицерин, 0,5 М аригинин, 50 мМ фосфатный буфер, 5 мМ восстановленный глутатион, 0,5 мМ окисленный глутатион, рН 8,8) в течение 12-14 часов при 4°С. Концентрацию белка оценивали по формуле:

Белок (мг/мл)=(1,55 × ОП₂₈₀)-(0,76 × ОП₂₆₀)

L. Крупномасштабная очистка His-гибрида

500 мл бактериальных культур индуцировали и получали гибридные белки, растворимые в буфере М1, М2 или М3 с использованием вышеописанной процедуры. Неочищенный экстракт бактерий загружали на Ni-NTA-колонку Superflow (Qiagen), уравновешенную буфером М1, М2, или М3, в зависимости от солюбилизирующего буфера гибридных белков. Несвязанный материал элюировали путем промывки колонки тем же буфером. Специфический белок элюировали соответствующим буфером, содержащим 500 мМ имидазола, и диализовали против соответствующего буфера без имидазола. После проведения каждого электрофореза, колонки подвергали очистке путем промывки, по крайней мере, двумя колоночными объемами 0,5 М гидроксида натрия и снова уравновешивали для дальнейшего использования.

М. Иммунизация мышей

Для иммунизации, мышам внутрибрюшинно вводили 20 мкг каждого очищенного белка. В случае ORF 44, мышей CD1 иммунизовали Al(OH)₃, используемого в качестве адъюванта, в дни 1, 21 и 42, а затем проводили мониторинг иммунного ответа в образцах, взятых на 56-й день. В случае ORF 40, мышей CD1 иммунизировали путем введения адъюванта Фрейнда вместо Al(OH)₃ с использованием того же самого протокола иммунизации, за исключением того, что иммунный ответ оценивали не на 56-й, а на 42-й день. Аналогично, для ORF 38, мышей CD1 иммунизировали адъювантом Фрейнда, но, при этом, иммунный ответ оценивали на 49-й день.

N. ELISA-анализ (серологический анализ)

Некапсулированный штамм М7 MenB высевали в планшеты с шоколадным агаром и инкубировали в течение ночи при 37°С. Из этих планшетов с агаром собирали бактериальные колонии с использованием стерильного щеточного тампона и инокулировали в 7 мл бульона Мюллера-Хинтона (Difco), содержащего 0,25% глюкозу. Рост бактерий оценивали через каждые 30 минут по ОП₆₂₀. Бактерии культивировали до тех пор, пока ОП не достигала значений 0,3-0,4. Полученную культуру центрифугировали в течение 10 минут при 10000 об/мин. Супернатант отбрасывали и бактерии один раз промывали PBS, ресуспендировали в PBS, содержащем 0,025% формальдегид, и инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре, а затем оставляли, при перемешивании, на ночь при 4°С. В каждую лунку 96-луночного планшета Greiner добавляли 100 мкл бактериальных клеток и инкубировали в течение ночи при 4°С. Затем лунки три раза промывали промывочным буфером РВТ (0,1% Твин-20 в PBS). Затем в каждую лунку добавляли 200 мкл буфера для насыщения (2,7% поливинилпирролидон 10 в воде) и планшеты инкубировали в течение 2 часов при 37°С. Затем лунки три раза промывали РВТ. В каждую лунку добавляли 200 мкл разведенной сыворотки (буфер для разведения: 1% BSA, 0,1% Твин-20, 0,1% NaN₃ в PBS) и планшеты инкубировали в течение 90 минут при 37°С. Лунки три раза промывали РВТ. Затем в каждую лунку добавляли 100 мкл конъюгированной с пероксидазой хрена кроличьей антимышиной сыворотки (Dako), разведенной 1:2000 в буфере для разведения, и эти планшеты инкубировали в течение 90 минут при 37°С. Лунки три раза промывали буфером РВТ. В каждую лунку добавляли 100 мкл субстратного буфера для ПХ (25 мл цитратного буфера рН 5, 10 мг О-фенилдиамина и 10 мкл Н₂О) и планшеты оставляли при комнатной температуре на 20 минут. В каждую лунку добавляли 100 мкл H₂SO₄ и проводили оценку по ОП₄₉₀. ELISA-анализ считается положительным, если ОП₄₉₀ в 2,5 раза превышает соответствующую неиммунную сыворотку.

О. Процедура анализа FACScan на связывание с бактериями

Некапсулированный штамм М7 MenB высевали в планшеты с шоколадным агаром и инкубировали в течение ночи при 37°С. Из этих планшетов с агаром собирали бактериальные колонии с использованием стерильного щеточного тампона и инокулировали в 4 пробирки с 8 мл бульона Мюллера-Хинтона (Difco), содержащего 0,25% глюкозу. Рост бактерий оценивали через каждые 30 минут по ОП₆₂₀. Бактерии культивировали до тех пор, пока ОП не достигала значений 0,35-0,5. Полученную культуру центрифугировали в течение 10 минут при 4000 об/мин. Супернатант отбрасывали, и осадок ресуспендировали в блокирующем буфере (1% BSA, 0,4% NaN₃) и центрифугировали в течение 5 минут при 4000 об/мин. Клетки ресуспендировали в блокирующем буфере до тех пор, пока ОП₆₂₀ не достигала 0,07. В каждую лунку 96-луночного планшета Costar добавляли 100 мкл бактериальных клеток. Затем в каждую лунку добавляли 100 мкл разведенной (1:200) сыворотки (в блокирующем буфере), и планшеты инкубировали в течение 2 часов при 4°С. Затем клетки центрифугировали в течение 5 минут при 4000 об/мин, супернатант отсасывали и клетки промывали путем добавления 200 мкл/лунку блокирующего буфера в каждую лунку. В каждую лунку добавляли 100 мкл конъюгированных с R-фикоэритрином антимышиных антител против козьего F(ab)₂, разведенных 1:100, и планшеты инкубировали в течение 1 часа при 4°С. Клетки осаждали путем центрифугирования при 4000 об/мин в течение 5 минут и промывали путем добавления 200 мкл/лунку блокирующего буфера. Супернатант отсасывали, и клетки ресуспендировали в 200 мкл/лунку PBS, 0,25% формальдегиде. Образцы переносили в пробирки для проведения FACScan и считывали. FACScan проводили при следующих условиях: FL1 - вкл., FL2 и FL3 - выкл.; пороговое значение FSC-H: 92; напряжение РМТ FSC: Е 02; РМТ SSC: 474; приращение усиления: 7,1; РМТ FL-2: 539; компенсационное значение: 0.

Р. Получение OMV

Бактерии культивировали в течение ночи на 5 GC-планшетах, собирали "петлей" и ресуспендировали в 10 мл 20 мМ Трис-HCl. Затем, проводили термоинактивацию при 56°С в течение 30 минут, и эти бактерии разрушали путем обработки ультразвуком в течение 10 минут на льду (50%-ный рабочий цикл, 50%-ный выход). Неразрушенные клетки удаляли путем центрифугирования при 5000 g в течение 10 минут, и полную фракцию клеточных оболочек выделяли путем центрифугирования при 50000 g при 4°С в течение 75 минут. Для экстракции цитоплазматических мембранных белков из неочищенных внешних мембран, всю фракцию ресуспендировали в 2% саркозиле (Sigma) и инкубировали при комнатной температуре в течение 20 минут. Суспензию центрифугировали при 10000 g в течение 10 минут для удаления агрегатов, а затем, супернатант подвергали ультрацентрифугированию при 50000 g в течение 75 минут для удаления внешних мембран. Эти внешние мембраны ресуспендировали в 10 мМ Трис-HCl, pH 8 и концентрацию белка измеряли с помощью анализа на содержание белка Bio-Rad с использованием BSA в качестве стандарта.

Q. Получение целых экстрактов

Бактерии культивировали в течение ночи на GC-планшете, собирали "петлей" и ресуспендировали в 1 мл 20 мМ Трис-HCl. Термоинактивацию проводили при 56°С в течение 30 минут.

R. Вестерн-блоттинг

Очищенные белки (500 нг/дорожку), внешние мембранные везикулы (5 мкг) и полные клеточные экстракты (25 мкг), полученные из штамма MenB 2996, загружали на 15% ПААГ с ДСН и переносили на нитроцеллюлозную мембрану. Перенос осуществляли в течение 2 часов при 150 мА и при 4°С в буфере для переноса (0,3% основание Трис, 1,44% глицин, 20% метанол). Мембрану насыщали путем инкубирования в течение ночи при 4°С в буфере для насыщения (10% сепарированное молоко, 0,1% Тритон Х100 в PBS). Эту мембрану два раза промывали буфером для промывки (3% сепарированное молоко, 0,1% Тритон Х100 в PBS) и инкубировали в течение 2 часов при 37°С с мышиной сывороткой, разведенной 1:200 в промывочном буфере. Затем мембрану промывали два раза и инкубировали в течение 90 минут с 1:2000-разведенным и меченным пероксидазой хрена антителом против мышиного Ig. Мембрану два раза промывали 0,1% Тритоном Х100 в PBS и проявляли с помощью субстратного набора Opti-4CN Substrate Kit (Bio-Rad). Реакцию прекращали путем добавления воды.

S. Бактерицидный анализ

Штамм МС58 культивировали в течение ночи при 37°С на планшетах с шоколадным агаром. Затем собирали 5-7 колоний и использовали для инокуляции 7 мл бульона Мюллера-Хинтона. Суспензию инкубировали при 37°С на устройстве для конического сканирования и культивировали до тех пор, пока ОП₆₂₀ не достигала 0,5-0,8. Аликвоты культуры распределяли по стерильным 1,5 мл-пробиркам Эппендорфа и центрифугировали в течение 20 минут в микроцентрифуге на максимальной скорости. Осадок один раз промывали в буфере Гея (Gibco) и ресуспендировали в том же буфере до достижения ОП₆₂₀ = 0,5, после чего разводили в буфере Гея 1:20000 и хранили при 25°С.

В каждую лунку 96-луночного планшета для культивирования тканей добавляли 50 мкл буфера Гея/1% BSA. В каждую лунку добавляли 25 мкл разведенной мышиной сыворотки (1:100 в буфере Гея/0,2% BSA) и планшет инкубировали при 4°С. После этого, в каждую лунку добавляли 25 мкл ранее описанной бактериальной суспензии. Затем в каждую лунку добавляли 25 мкл либо термоинактивированного (при 56°С в водяной бане в течение 30 минут), либо нормального комплемента детеныша кролика. Сразу после добавления комплемента детеныша кролика, на планшеты с агаром Мюллера-Хинтона высевали 22 мкл каждого образца/лунку (время 0). 96-луночный планшет инкубировали в течение 1 часа при 37°С при перемешивании, а затем 22 мкл каждого образца/лунку высевали на планшеты с агаром Мюллера-Хинтона (время 1). После инкубирования в течение ночи подсчитывали колонии, соответствующие времени 0 ч и времени 1 ч.

В Таблице II представлены систематизированные результаты клонирования, экспрессии и очистки.

Пример 1:

Была идентифицирована нижеследующая неполная ДНК-последовательность в N. meningitidis <SEQ ID No:1>:

Эта последовательность соответствует аминокислотной последовательности <SEQ ID No:2; ORF40 >:

Последующее исследование выявило полную ДНК-последовательность <SEQ ID No:3>:

Эта последовательность соответствует аминокислотной последовательности <SEQ ID No:4; ORF40-1 >:

Последующее исследование выявило соответствующий ген в штамме А N. meningitidis <SEQ ID No:5>:

Эта последовательность кодирует белок, имеющий аминокислотную последовательность <SEQ ID No:6; ORF40а>:

Первоначально идентифицированная неполная последовательность штамма В (ORF40) обнаруживает 65,7%-ную идентичность с ORF40а с перекрыванием в 254 аминокислоты:

Полная последовательность штамма В (ORF40-1) и ORF40а обнаруживает 83,7%-ную идентичность с перекрыванием в 601 аминокислоту.

Компьютерный анализ этих аминокислотных последовательностей дал следующие результаты:

Гомология с белком Hsf, кодируемым локусом на поверхности фибрилл H.influenzae типа b (номер доступа U41852).

ORF40 и белок Hsf обнаруживают 54%-ную идентичность с перекрыванием в 251 аминокислоту:

ORF40а также обнаруживает гомологию с Hsf:

Продукт гена hsf gi 1666683 (U41852) [Haemophilus influenzae], длина = 2353, оценка = 153 (67,7 бита), ожидаемая величина = 1,5е-116, суммарная величина Р(11) = 1,5е-116, идентичность = 33/36 (91%), Положительный результат = 34/36 (94%)

Оценка = 161 (71,2 бита), ожидаемая величина = 1,5е-116, суммарный результат Р(11) = 1,5е-116, идентичность = 32/38 (84%), положительный результат = 36/38 (94%).

Оценка = 110 (48,7 бита), ожидаемая величина = 1,5е-116, суммарная величина Р(11) = 1,5е-116, идентичность = 21/29 (72%), положительный результат = 25/29 (86%).

Оценка = 85 (37,6 бита), ожидаемая величина = 1,5е-116, суммарная величина Р(11) = 1,5е-116, идентичность = 18/32 (56%), положительный результат = 20/32 (62%).

Оценка = 92 (40,7 бита), ожидаемая величина = 1,5е-116, суммарная величина Р(11) = 1,5е-116, идентичность = 16/19 (84%), положительный результат = 19/19 (100%).

Оценка = 90 (39,8 бита), ожидаемая величина = 1,5е-116, суммарная величина Р(11) = 1,5е-116, идентичность = 17/28 (60%), положительный результат = 20/28 (71%).

Исходя из гомологии с Hsf, было предсказано, что этот белок от N. meningitidis и его эпитопы могут быть использованы в качестве антигенов для изготовления вакцин или диагностики.

ORF40-1 (61 кДа) клонировали в векторы рЕТ и pGex и экспрессировали в E.coli, как описано выше. Продукты экспрессии и очистки белка анализировали с помощью электрофореза в ПААГ с ДСН. На Фиг.1А представлены результаты аффинной очистки His-гибридного белка, а на Фиг.1В представлены результаты экспрессии GST-гибрида в E.coli. Очищенный His-гибридный белок использовали для иммунизации мышей, сыворотку которых использовали для FACS-анализа (Фиг.1С), анализа на бактерицидность (Фиг.1D) и ELISA (положительный результат). Эти эксперименты подтвердили, что ORF40-1 представляет собой белок, экспонированный на поверхности, и этот белок может быть использован в качестве иммуногена.

На Фиг.1Е представлены графики гидрофильности, индексы антигенности и области AMPHI для ORF40-1.

Пример 2

Была идентифицирована нижеследующая неполная ДНК-последовательность в N. meningitidis <SEQ ID No:7>:

Эта последовательность соответствует аминокислотной последовательности <SEQ ID No:8; ORF38 >:

Последующее исследование выявило полную нуклеотидную последовательность <SEQ ID No:9>:

Эта последовательность соответствует аминокислотной последовательности <SEQ ID No:10; ORF38-1 >:

Компьютерный анализ этой аминокислотной последовательности выявил предполагаемый сайт присоединения липида прокариотического мембранного липопротеина (подчеркнут).

Последующее исследование позволило идентифицировать соответствующий ген в штамме А N. meningitidis <SEQ ID No:11>:

Эта последовательность кодирует белок, имеющий аминокислотную последовательность <SEQ ID No:12; ORF38-а>:

Первоначально идентифицированная неполная последовательность штамма В (ORF38) обнаруживает 95,2%-ную идентичность с ORF38а с перекрыванием в 165 аминокислот:

Полная последовательность штамма В (ORF38-1) и ORF38а обнаруживает 98,4%-ную идентичность с перекрыванием в 321 аминокислоту.

Компьютерный анализ этих последовательностей дал следующие результаты:

Гомология с липоротеином (lipo) C.jejuni (номер доступа X82427).

ORF38 и липопротеин обнаруживают 38%-ную идентичность с перекрыванием в 96 аминокислот:

Исходя из этого анализа, было предсказано, что этот белок от N. meningitidis и его эпитопы могут быть использованы в качестве антигенов для изготовления вакцин или диагностики.

ORF38-1 (32 кДа) клонировали в векторы рЕТ и pGex и экспрессировали в E.coli, как описано выше. Продукты экспрессии и очистки белка анализировали с помощью электрофореза в ПААГ с ДСН. На Фиг.2А представлены результаты аффинной очистки His-гибридного белка, а на Фиг.2В представлены результаты экспрессии GST-гибрида в E.coli. Очищенный His-гибридный белок использовали для иммунизации мышей, сыворотку которых использовали для Вестерн-блот-анализа (Фиг.2С) и FACS-анализа (Фиг.2D). Эти эксперименты подтвердили, что ORF38-1 представляет собой белок, экспонированный на поверхности, и этот белок может быть использован в качестве иммуногена.

На Фиг.2Е представлены графики гидрофильности, индексы антигенности и области AMPHI для ORF38-1.

Пример 3

Была идентифицирована нижеследующая ДНК-последовательность N. meningitidis <SEQ ID No:13>:

Эта последовательность соответствует аминокислотной последовательности <SEQ ID No:14; ORF44>:

Компьютерный анализ этой аминокислотной последовательности предсказал наличие лидерного пептида (подчеркнут).

Последующее исследование позволило идентифицировать соответствующий ген в штамме А N. meningitidis <SEQ ID No:15>:

Эта последовательность кодирует белок, имеющий аминокислотную последовательность <SEQ ID No:16; ORF44а>:

Последовательность штамма В (ORF44) обнаруживает 99,2%-ную идентичность с ORF44а с перекрыванием в 124 аминокислоты.

Компьютерный анализ этих последовательностей дал следующие результаты:

Гомология с адгезином LecA Eikenella corrodens (номер доступа D78153).

ORF44 и белок LecA обнаруживают 45%-ную идентичность с перекрыванием в 91 аминокислоту:

Исходя из гомологии с адгезином, было предположено, что этот белок от N. meningitidis и его эпитопы могут быть использованы в качестве антигенов для вакцин или диагностики.

ORF44-1 (11,2 кДа) клонировали в векторы рЕТ и pGex и экспрессировали в E.coli, как описано выше. Продукты экспрессии и очистки белка анализировали с помощью электрофореза в ПААГ с ДСН. На Фиг.3А представлены результаты аффинной очистки His-гибридного белка, а на Фиг.3В представлены результаты экспрессии GST-гибрида в E.coli. Очищенный His-гибридный белок использовали для иммунизации мышей, чью сыворотку использовали для анализа ELISA, который дал положительные результаты и для анализа на бактерицидность (Фиг.3С). Эти эксперименты подтвердили, что ORF44-1 представляет собой белок, экспонированный на поверхности, и этот белок может быть использован в качестве иммуногена.

На Фиг.3D представлены графики гидрофильности, индексы антигенности и области AMPHI для ORF44-1.

Пример 4

Была идентифицирована нижеследующая неполная ДНК-последовательность в N. meningitidis <SEQ ID No:17>:

Эта последовательность соответствует аминокислотной последовательности <SEQ ID No:18; ORF49>:

Последующее исследование выявило полную нуклеотидную последовательность <SEQ ID No:19>:

Эта последовательность соответствует аминокислотной последовательности <SEQ ID No:20; ORF49-1>:

Компьютерный анализ предсказал трансмембранный домен, а также показал, что ORF49 не имеет какой-либо значительной гомологии аминокислотной последовательности с известными белками. Однако была идентифицирована соответствующая ORF от штамма А N. meningitidis.

ORF49 обнаруживает 86,1%-ную идентичность с ORF (ORF 49а) штамма N. meningitidis с перекрыванием в 173 аминокислоты:

ORF49-1 и ORF49а обнаруживают 83,2%-ную идентичность с перекрыванием в 457 аминокислот:

Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF49а <SEQ ID No:21> представляет собой:

Эта последовательность кодирует белок, имеющий аминокислотную последовательность <SEQ ID No:22>:

Исходя из присутствия предполагаемого трансмембранного домена, было предсказано, что эти белки от N. meningitidis и их эпитопы могут быть использованы в качестве антигенов для вакцин или диагностики.

Пример 5

Была идентифицирована нижеследующая неполная ДНК-последовательность в N. meningitidis <SEQ ID No:23>:

Эта последовательность соответствует аминокислотной последовательности <SEQ ID No:24; ORF50>:

Компьютерный анализ предсказал два трансмембранных домена и также показал, что ORF50 не имеет какой-либо значительной гомологии аминокислотной последовательности с известными белками.

Исходя из присутствия предполагаемого трансмембранного домена, было предсказано, что эти белки от N. meningitidis и их эпитопы могут быть использованы в качестве антигенов для вакцин или диагностики.

Пример 6

Была идентифицирована нижеследующая неполная ДНК-последовательность в N. meningitidis <SEQ ID No:25>:

Эта последовательность соответствует аминокислотной последовательности <SEQ ID No:26; ORF39>:

Последующее исследование выявило полную нуклеотидную последовательность <SEQ ID No:27>:

Эта последовательность соответствует аминокислотной последовательности <SEQ ID No:28; ORF39-1>:

Компьютерный анализ этих аминокислотных последовательностей дал следующие результаты:

Гомология с предсказанной ORF от N. meningitidis (штамм А).

ORF39 обнаруживает 100%-ю идентичность с ORF (ORF39а) штамма А N. meningitidis с перекрыванием в 165 аминокислот:

ORF39-1 и ORF39а обнаруживают 99,4%-ную идентичность с перекрыванием в 710 аминокислот:

Полная нуклеотидная последовательность ORF39а <SEQ ID No:29> представляет собой:

Эта последовательность кодирует белок, имеющий аминокислотную последовательность <SEQ ID No:30>:

ORF39а гомологична цитолизину от A. pleuropneumoniae:

Детерминант токсина В sp|P26760|RT1B_ACTPL RTX-I (АТР-связывающий белок секреции токсина RTX-I,) (АРХ-IB) (HLY-IB) (Цитолизин IB) (CLY-IB)

> gi |97137|pir| |D43599 цитолизин IB - Actinobacillus pleuropneumoniae (серотип 9)

> gi |38944 (Х61112) белок ClyI-B [Actinobacillus pleuropneumoniae] длина = 707, оценка = 931 бит (2379), ожидаемая величина = 0,0, идентичность = 472/690 (68%), положительный результат = 540/690 (77%), бреши = 3/690 (0%).

Следует отметить, что настоящее изобретение описано лишь в иллюстративных целях, и в него могут быть внесены модификации, не выходящие за рамки объема и сущности изобретения.

Изобретение относится к белкам с установленными аминокислотными последовательностями, представленными в перечне последовательностей, полученным из бактерии, преимущественно штаммов А и В, которые проявляют свойства антигена. Изобретение также включает соответствующие нуклеотидные последовательности фрагментов нуклеиновой кислоты, кодирующие аминокислотные последовательности указанных белков. Белки по изобретению могут быть использованы в качестве антигенов для получения специфических антител и изготовления композиций для лечения, профилактики или диагностики инфекции, вызванной Neisseria meningitidis. Композиции готовят на основе белка, фрагмента нуклеиновой кислоты или антитела с добавлением фармацевтически приемлемого носителя и представляют собой вакциннную, диагностическую или фармацевтическую композиции. Последовательности полученных белков не имеют какой-либо значительной гомологии с последовательностями Neisseria gonorrhoeae, что позволяет получать лечебно-профилактические и диагностические композиции с высокой специфичностью по отношению к N.meningitidis, а также получать диагностические реагенты для дифференциации N.meningitidis от N.gonorrhoeae. 5 н. и 7 з.п. ф-лы, 2 табл., 7 ил.

1. Белок, полученный из Neisseria meningitidis и проявляющий свойства антигена, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID No:8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88 и 90, или характеризующийся 80%-ным или более высоким уровнем идентичности к последовательности SEQ ID No:8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88 и 90 или его фрагмент, сохраняющий при этом свойства антигена.2. Белок по п.1, отличающийся тем, что указанный фрагмент состоит по крайней мере из 16 непрерывно следующих друг за другом аминокислот, при этом указанный фрагмент включает эпитоп.3. Антитело, полученное с помощью белка по п.1 или 2, которое связывается с белком по п.1 или 2.4. Фрагмент нуклеиновой кислоты, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность белка по п.1 или 2.5. Фрагмент нуклеиновой кислоты по п.4, содержащий нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID No:7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87 и 89.6. Фрагмент нуклеиновой кислоты по п.5, содержащий фрагмент, состоящий, по крайней мере, из 20 непрерывно следующих друг за другом нуклеотидов, кодирующий фрагмент белка Neisseria meningitidis, проявляющий свойства антигена.7. Фрагмент нуклеиновой кислоты по любому из пп.4-6, содержащий комплементарную нуклеотидную последовательность.8. Фрагмент нуклеиновой кислоты, используемый в качестве зонда, способный гибридизоваться с фрагментом нуклеиновой кислоты по любому из пп.4-7, в условиях высокой степени жесткости, таких как 65°С, в растворе 0,1×SSC, 0,5% ДСН.9. Композиция для лечения, профилактики или диагностики инфекции, вызванной Neisseria meningitidis, содержащая эффективное количество белка по п.1 или 2, фрагмента нуклеиновой кислоты по любому из пп.4-8 или антитела по п.3, и фармацевтически приемлемый носитель.10. Композиция по п.9, представляющая собой вакцинную композицию или диагностическую композицию.11. Композиция по п.9 или 10, используемая в качестве фармацевтического средства.12. Композиция по п.11, используемая для изготовления лекарственного препарата для лечения или профилактики инфекции, вызванной Neisseria meningitidis.