СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКОБАКТЕРИЙ ТУБЕРКУЛЕЗА Российский патент 2005 года по МПК C12N1/20 C12N1/26 C12N1/20 C12R1/32 

Изобретение относится к области микробиологии и может быть использовано для культивирования М tuberculosis, при микробиологической диагностике туберкулеза.

Известен способ культивирования M.tuberculosis путем посева микробных клеток в жидкую обогащенную среду Школьниковой (Драбкина P.O. Микробиология туберкулеза, - М.: Медгиз, 1963, - 225 с.)

В известном способе видимый рост микобактерий появляется на 14 день после инокуляции посевного материала в питательную среду. При этом эффективность роста посева невелика и зависит от особенностей выращиваемой культуры.

Целью предлагаемого решения является разработка способа культивирования микобактерий, позволяющего увеличить выход клеток возбудителя туберкулеза и повысить эффективность роста M.tuberculosis.

Поставленная цель достигается путем создания 2-фазной среды с нижней фазой - газопереносящей подложкой - в качестве которой используют перфтордекалин с концентрацией свободных ионов менее 10^-6М и количеством недофторированных примесей менее 0,003 мас.% при соотношении слоев обогащенной среды Школьниковой к перфтордекалину, равном 1:1, причем посев микобактерий осуществляют на линии раздела.

Перфтордекалин (далее - ПФД) относится к перфторуглеродам, которые представляют собой фторированные углеводороды, в которых атомы водорода полностью заменены фтором.

ПФД представляет собой химически инертную, гидрофобную жидкость в 1,5 раза тяжелее воды, способную растворять в себе большие количества кислорода и углекислого газа и легко освобождать эти газы при изменении их содержания в окружающей среде. При нормальном барометрическом давлении и температуре 37°С в 100 мл ПФД растворяется 42 мл О₂ и 134 мл СО₂. Концентрация свободных ионов фтора менее 10^-6М, а количество недофторированных примесей менее 0,003 мас.%.

Предложенный способ за счет улучшения газообмена стимулирует рост микобактерий, в результате чего выход микробных тел увеличивается более чем в 3 раза.

ПФД эффективно поддерживает газообмен в живых системах и биологических объектах. При соединении жидкой среды с ПФД в пробирке формируется двухфазная система, в силу своего большего веса ПФД располагается под средой, не смешиваясь с ней, а на границе фаз создаются оптимальные условия для размножения микроорганизмов за счет улучшенного газообмена и адсорбции питательных веществ на поверхности ПФД. Присутствие в системе культивирования подложки из ПФД с высокой газовой емкостью, прежде всего, дает возможность улучшить аэрацию растущей культуры и замедлить развитие ацидоза за счет газообмена между средой и газопереносящей подложкой.

Двухфазная среда, предлагаемая для культивирования микобактерий, готовилась следующим образом. Стерильный ПФД, полученный из Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН, помещали в пробирку в количестве 2 мл, на него наслаивали 2 мл обогащенной среды Школьниковой. Таким образом, формировалась двухфазная система, нижнюю фазу которой составлял более тяжелый ПФД, а верхнюю - питательный бульон - обогащенная среда Школьниковой.

Объектом исследования служил лабораторный штамм M.tuberculosis H37Rv, обладающий стандартными культуральными свойствами, из которого готовилась микробная взвесь в физиологическом растворе с 0,05% твина-80 в соответствии с оптическим стандартом мутности №5 ГИСК им. Л.А.Тарасевича. Посев микробной взвеси производился по 0,1 мл в пробирку.

Оценку роста осуществляли путем подсчета абсолютного количества микобактерий в мазках по методу Шепарда. Пробы материала для подсчета количества микобактерий брали на 4; 7 и 10 сутки после посева.

Сравнение результатов культивирования вирулентного лабораторного штамма H37Rv, проведенное на разработанной нами двухфазной среде и на обогащенной среде Школьниковой, показало увеличение выхода клеток микобактерий на первой. Абсолютное количество микобактерий в 1 мл среды при различной длительности культивирования представлено в таблице 1.

Таблица 1
Результаты подсчета количества клеток микобактерий туберкулезаСреда культивированияn Количество M.tuberculosis в 1 мл среда (М±m) 4-е сутки7-е сутки*10-е сутки*Ср. Школьниковой20 (0,09±0,005)×10⁷(2025±0,1)×10⁷(63,18±0,06)×10Ср. Школьниковой+ПФД20 (0,14±0,2)×10⁷(3,89±0,03)×10⁷(206,6±0,05)×10*Различия между группами достоверны (Р<0,01)

Особенностью роста микобактерий на разработанной нами двухфазной жидкой среде является преимущественное расположение микроколоний в зоне раздела фаз. Прирост бактериальных клеток в пробирках с ПФД оказался более значительным, чем в пробирках без ПФД. Из таблицы следует, что на 7 сутки после инокуляции количество M.tuberculosis в двухфазной среде превышало таковое в обычной среде Шк в 1,7 раза, а на 10 сутки - в 3,27 раза.

Морфология микроколоний и отдельных клеток микобактерий, выращенных с помощью двухфазной среды, при бактериоскопии была идентична клеткам со среды Шк, кислотоустойчивость при окраске по методу Циля-Нильсена сохранялась.

Способ культивирования М. tuberculosis на жидкой среде Шк с подложкой из ПФД позволил, по сравнению с контролем, увеличить скорость роста и прирост клеток, то есть повысить эффективность культивирования.

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано для бактериологической диагностики туберкулеза. Способ культивирования М. tuberculosis заключается в том, что к жидкой питательной обогащенной среде Школьниковой (Шк) добавляют подложку из перфтордекалина (ПФД) в соотношении 1:1, которая формирует нижнюю фазу, улучшая газообмен и стимулируя рост М. Tuberculosis. Используют ПФД с концентрацией свободных ионов менее 10^-6 и количеством недофторированных примесей менее 0,003 мас.%. Двухфазную среду для культивирования микобактерий готовят следующим образом. Стерильный ПФД помещают в пробирку в количестве 2 мл, на него наслаивают 2 мл, среды Шк. Таким образом формируется система, нижнюю фазу которой составляет более тяжелый ПФД, а верхнюю - питательный бульон. Культивирование вирулентного лабораторного штамма H37Rv, проведенное на разработанной среде, показало значительное увеличение выхода клеток микобактерий по сравнению со средой Шк. На 7 сутки после инокуляции количество М. tuberculosis в двухфазной среде превышало таковое в обычной среде Шк в 1,7 раза, а на 10 сутки - в 3,27 раза. 1 табл.

Способ культивирования Mycobacterium tubercuLosis путем посева микробных клеток в жидкую обогащенную среду Школьниковой, отличающийся тем, что посев осуществляют в двуслойную среду, нижний слой которой представляет собой перфтордекалин с концентрацией свободных ионов менее 10^-6 М и количеством недофторированных примесей менее 0,003 мас.%, а верхний слой - обогащенная среда Школьниковой при соотношении слоев 1:1.