СПОСОБ ОЦЕНКИ ИММУНИТЕТА ПРИВИТОГО МОЛОДНЯКА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА Российский патент 2005 года по МПК A61K39/00 G01N33/53 

Изобретение относится к ветеринарной иммунологии, а именно к технике оценки иммунитета у привитых животных.

Известен способ определения поствакцинального иммунитета путем патологоанатомического и бактериологического методов исследования биоматериала от убитых животных после экспериментального заражения вирулентной культурой микобактерий туберкулеза (С.И.Гельберг, Е.А.Финкель // Пробл. туберкулеза. - 1959.- №2.- С. 80-84.- Метод А.И.Тогуновой, 1948; М.А. Сафин // Совершенствование систем и методов в борьбе с бруцеллезом и туберкулезом / ВАСХНИЛ. Сиб. отд-ние. - Новосибирск, 1987. - С. 142-148).

Известный способ применяется в научных лабораториях для изучения протективных свойств иммунизирующих препаратов и не может быть использован для прижизненной оценки иммунитета у привитых животных.

Известен также способ определения состояния клеточного иммунитета, основанный на проведении реакции между лейкоцитами крови и антигеном и определением адгезивных свойств лейкоцитов (см. авторское свидетельство №789104 от 23.10.80. Бюл. №35). Способ используется для выяснения этиологии и диагностики ряда заболеваний. Этот способ не нашел применения в ветеринарной практике и не может быть использован для оценки иммунитета из-за нестабильности результатов.

Наиболее близким к изобретению является способ основанный на составлении дифференциально-прогностических таблиц с использованием дискретно-динамического принципа оценки иммунного статуса человека (Петров Р.В. с соавт. Взаимосвязь иммунологических параметров здоровых доноров и людей, часто болеющих острыми респираторными заболеваниями и бронхитами, в стадии ремиссии. ЖМЭИ. - 1983. - №9. - С.99-105; Лебедев К.А., Бабайцев В.А. Новый метод составления диагностических таблиц на основе дискретно-динамического принципа оценки иммунного статуса. Иммунология. - 1986. - №5. - С.53-56; Лебедев К.А., Понякина И.Д. Дискретно-динамический анализ - новый подход к оценке иммунного статуса человека /Итоги науки и техники. - ВИНИТИ. - Иммунологии. - 1986. - Т.15. - С.64-91).

Дискретно-динамический анализ или метод группировки - вариант регрессионного анализа, сущность которого состоит в том, что исследуемую группу делят по значению одного из параметров, принятого в качестве базисного, на три приблизительно равные по величине подгруппы. В I входят животные с минимальными значениями базисного параметра, во II - с максимальными и в III - со средними значениями. В каждой подгруппе рассчитывают средние значения остальных (вариабельных) параметров. В тех случаях, когда средние значения вариабельного параметра в подгруппах с минимальными и максимальными значениями базисного параметра достоверно различаются, констатируют наличие взаимосвязей между данными базисного и вариабельного параметрами. Взаимосвязь положительна, если при увеличении базисного параметра уровень вариабельного также увеличивается; отрицательна, если при увеличении базисного параметра уровень вариабельного снижается. В работе использованы две подгруппы - с минимальными и максимальными значениями.

Предложенный анализ, описанным способом, для оценки иммунитета привитых животных сопряжен с большой затратой времени, достоверность результатов при этом во многом зависит от человеческого фактора и не нашел применения в ветеринарной научно-исследовательской практике.

Задачей изобретения является повышение эффективности прижизненной оценки иммунитета привитых животных и снижение затрат времени.

Задача достигается путем определения количества (тыс/мкл) в периферической крови животных лейкоцитов, нейтрофилов, лимфоцитов и наиболее активных иммунокомпетентных клеток: Т-лимфоцитов с помощью спонтанного розеткообразования с эритроцитами барана (Е-РОК); Т-киллеров - непрямого глобулинового розеткообразования с эритроцитами быка (ЕА-РОК); Т-лимфоцитов, распознающих антигены микобактерий туберкулеза, с эритроцитами быка, адсорбировавшими ППД-туберкулин (ЕТ-РОК); В-лимфоцитов - комплементарного розеткообразования с эритроцитами быка (ЕАС-РОК), именуемые в тексте - иммунологические параметры.

С использованием дискретно-динамического анализа и специально составленной программы для ЭВМ определяют те сочетания иммунологических параметров, которые присущи привитым животным. На основании выявленных со степенью достоверности (Р<0,05) значимых сочетаний параметров составляют с использованием компьютерной программы дифференциально-прогностическую таблицу, которая дает возможность оценить степень защищенности от заболевания отдельного животного и стада в целом.

Отличительными признаками предложенного способа являются: на основе дифференциально-прогностической таблицы, составленной с помощью специальной программы для ЭВМ, выделяют те сочетания параметров, которые присущи привитым животным. По значениям базисного и вариабельного параметров дифференциально-прогностической таблицы определяют соответствие их исследуемому животному. Оценивают степень защищенности от заболевания животного и стада в целом: до 40% отмечают низкий уровень защищенности, 40-70% - средний уровень, 70% и выше - высокий уровень защищенности. Предложенный способ позволяет дать прижизненную оценку иммунитета у привитых животных и снизить затраты времени в 20 раз по сравнению с известным методом.

Пример 1. У молодняка крупного рогатого скота, привитого вакциной БЦЖ в возрасте 10-20 дней (Наставление по применению вакцины БЦЖ при туберкулезе крупного рогатого скота / ГУВ МСХ СССР, 26.02.1990 г.), в разные возрастные периоды (у 20-ти в возрасте 4-5 месяцев, у 20-ти в возрасте 9-11 месяцев и у 20-ти в возрасте 15-17 месяцев) в периферической крови определяют число иммунокомпетентных клеток в абсолютном содержании (тыс/мкл). Анализируют полученные данные (табл.1) и устанавливают, что с возрастом изменяется количество иммунокомпетентных клеток. Так, число ЕА-, ЕАС-, ЕТ-РОК и нейтрофилов у животных к 9-11-месячному возрасту увеличивается, а к 15-17-месячному возрасту с высокой степенью достоверности увеличивается число Е-, ЕА- и ЕАС-РОК. Такого рода изменения в количестве иммунокомпетентных клеток не позволяют оценить состояние иммунитета и далее изучают корреляционные связи иммунологических параметров, которые представлены в таблице 2.

У телят, привитых БЦЖ, в возрасте 4-5 месяцев между числом Е-РОК и нейтрофилов установлена прямая связь (r=+0,75), которая у телят к 9-11-ти месяцам снижается до слабого уровня (r=+0,03). Между числом нейтрофилов с различными формами лимфоцитов (ЕА-, ЕАС- и ЕТ-РОК) у телят в возрасте 4-5 месяцев установлены прямые связи средней силы. Эти и другие связи иммунологических параметров у животных к 9-11- и 15-17-месячному возрасту ослабевают. Несмотря на получение новых сведений, достичь цели по оценке иммунитета у животных не представляется возможным.

Также определяют число иммунокомпетентных клеток у молодняка крупного рогатого скота через 4 месяца после иммунизации вакциной БЦЖ в возрасте 4-5, 9-11 и 15-17 месяцев. У непривитого молодняка крупного рогатого скота в эти же возрастные периоды также определяют число иммунокомпетентных клеток (по 20 животных в каждой группе). Проводят изучение иммунного ответа у животных, привитых вакциной БЦЖ, в сравнении с интактными.

В таблице 3, в которой представлены средние показатели и регрессионная связь иммунологических параметров, показано, что количественный состав иммунокомпетентных клеток в крови интактных и привитых животных существенно различается. Так, число всех иммунокомпетентных клеток у привитых животных в возрасте 4-5 месяцев по отношению к непривитым этого же возраста с высокой степенью достоверности (Р<0,05) снижается, в то же время уравнение линейной регрессии (у/х) указывает на тенденцию усиления взаимосвязей иммунологических параметров у привитых телят.

У животных в возрасте 9-11 месяцев значительному изменению подвержено содержание ЕА-, ЕАС- и ЕТ-РОК, однако разница в том, что количество ЕА- и ЕАС-РОК в крови животных уменьшается, тогда как число ЕТ-РОК с высокой степенью достоверности увеличивается.

Результаты по изучению корреляционных связей показаны в таблице 4. У молодняка крупного рогатого скота, привитого вакциной БЦЖ, во все возрастные периоды усиливаются и становятся прямыми от средних до сильных уровней. Результаты этих исследований также не решают поставленную задачу.

Пример 2. Анализируют иммунологические параметры с помощью дискретно-динамического анализа, который с целью автоматизации и исключения субъективизма в нем обеспечивают специальной программой для ЭВМ, включающей разделение исследуемых животных на подгруппы с минимальным и максимальным значением параметров с установкой стабильности границ базисного параметра. После этого также с помощью программы проводят статистическую обработку цифрового материала в подгруппах, ведут отбор значимых сочетаний параметров по t-критерию Стьюдента и построение дифференциально-прогностических таблиц.

Основные расчетные формулы, используемые для составления программы ЭВМ (Урбах В.Ю. Биометрические методы (статистическая обработка опытных данных в биологии, сельском хозяйстве и медицине) /В.Ю.Урбах - М.: Наука, 1964. - 416 с.; Усович А.Т. Применение математической статистики при обработке экспериментальных данных в ветеринарии /А.Т.Усович, П.Т.Лебедев // Обл. прав-ние НТО с.-х / СибНИВИ. - Омск, 1970. - 44 с.).

Дискретно-динамическому анализу подвергают иммунологические параметры молодняка крупного рогатого скота через 4 месяца после иммунизации вакциной БЦЖ в возрасте 4-5, 9-11 и 15-17 месяцев, а также непривитых животных в эти же возрастные периоды и составляют дифференциально-прогностические таблицы, суть которых представлены в таблицах 5-7.

В таблице 5 обозначены 15 значимых сочетаний параметров у интактных и привитых вакциной БЦЖ молодняка крупного рогатого скота в возрасте 4-5 месяцев (6 сочетаний параметров у интактных и 9 сочетаний у привитых), причем 8 сочетаний зарегистрированы только у привитых животных, 5 сочетаний не повторились и в одном случае сочетание параметров совпадает у привитых и интактных животных, по которому также ведут анализ состояния иммунной системы, констатируя различие в значимых сочетаниях параметров.

В таблице 6 представлены 8 значимых сочетаний параметров у молодняка крупного рогатого скота, интактных и привитых вакциной БЦЖ, в возрасте 9-11 месяцев (3 сочетания у интактных и 5 у привитых). 4 сочетания параметров зарегистрированы только у привитых животных, 2 сочетания не повторились и в одном случае сочетание параметров совпадает.

В таблице 7 представлены 20 значимых сочетаний параметров у молодняка крупного рогатого скота, интактных и привитых вакциной БЦЖ, в возрасте 15-17 месяцев (2 сочетания у интактных и 18 сочетаний у привитых).

Вакцина БЦЖ в иммунной системе молодняка крупного рогатого скота усиливает взаимосвязи иммунологических параметров и увеличивает число сочетаний. Методом дискретно-динамического анализа и составленной в результате анализа дифференциально-прогностической таблицы можно установить те значимые (Р<0,05) сочетания иммунологических параметров, указывающие на уровень противотуберкулезного иммунитета у привитых животных.

Наиболее важно оценить состояние специфической защиты отдельного животного, используя различия базисного параметра и вариабельного, обозначенные в дифференциально-прогностической таблице. Например, по таблице 7 (группа молодняка через 4 месяца после иммунизации вакциной БЦЖ в возрасте 15-17 месяцев) находят сочетание параметров: базис лейкоциты ≥ 7,70 и вариабельный Е-РОК ≥ 1,48. Далее по этому сочетанию находят животных (таких животных 6). Аналогичным способом проводят отбор животных по всем сочетаниям параметров и определяют 17 животных (85%), способных противостоять заболеванию в условиях неблагополучной по туберкулезу крупного рогатого скота ферме. Далее по этой же таблице устанавливают устойчивых к заражению интактных животных этого же возраста 33,3%. Проводя подобный анализ остальных дифференциально-прогностических таблиц по оценке иммунитета у молодняка крупного рогатого скота через 4 месяца после иммунизации в возрасте 4-5 и 9-11 месяцев, было установлено 36% интактных и 75% ранее привитых БЦЖ в возрасте 4-5 месяцев, а также 30% интактных и 45% ранее привитых БЦЖ в возрасте 9-11 месяцев с высокой активностью иммунокомпетентных клеток.

Также дискретно-динамическому анализу подвергают иммунологические параметры молодняка крупного рогатого скота, привитого вакциной БЦЖ в возрасте 10-20 дней, в результате чего составляют дифференциально-прогностическую таблицу, суть которой показана в таблице 8. Устанавливают 9 сочетаний параметров у телят в возрасте 4-5 месяцев, привитых БЦЖ в раннем возрасте.

Лейкоциты в качестве базисного параметра с высокой степенью достоверности осуществляют свою функцию с Е-РОК, а в качестве вариабельного также с Е-РОК. Лимфоциты в качестве базисного параметра взаимосвязаны с нейтрофилами и в качестве вариабельного с нейтрофилами. Е-РОК как в качестве базисного параметра, так и в качестве вариабельного взаимосвязан с нейтрофилами. ЕА-РОК в качестве базисного параметра взаимосвязан с ЕТ-РОК.

Анализ иммунологических параметров у молодняка крупного рогатого скота в возрасте 9-11 месяцев, привитого также в раннем возрасте, показал, что количество значимых сочетаний параметров уменьшается (2 сочетания). Важно отметить тот факт, что у животных этого возраста выявляются новые по отношению к животным 4-5 месяцев значимые сочетания параметров.

У животных в возрасте 15-17-ти месяцев число достоверно различающихся сочетаний параметров также сниженное (3) из них 2 сочетания выявлены вновь, на основании анализа дифференциально-прогностической таблицы можно заключить, что с уменьшением числа значимых сочетаний параметров снижается степень защищенности животных против туберкулеза. Сказанное подтверждают многие результаты исследований и практические наблюдения, которые позволили включить в Наставление по применению вакцины БЦЖ ревакцинацию животных этим же препаратом (Наставление по применению вакцины БЦЖ при туберкулезе крупного рогатого скота / ГУВ МСХ СССР, 22.02.1985 г.).

Оценивая состояние специфической защиты отдельного животного с помощью дифференциально-прогностической таблицы и значений сочетаний параметров (базис, вариабельный), выявлено из числа телят, привитых вакциной БЦЖ до 20-ти дней, в возрасте 4-5 месяцев 30% иммунных животных, в возрасте 9-11 месяцев 40% и в возрасте 15-17 месяцев 70% иммунных животных.

Следовательно, если в стаде молодняка крупного рогатого скота, привитого ранее вакциной БЦЖ, по способу случайной выборки (не менее 30-ти животных) определить у животных число иммунокомпетентных клеток (иммунологические параметры), с помощью специальной программы для ЭВМ выявить значимые сочетания параметров и составить дифференциально-прогностическую таблицу, то по количеству значимых параметров предварительно можно оценить состояние противотуберкулезной специфической защищенности животных без проведения экспериментального заражения вирулентной культурой микобактерий. Кроме того, предложенный способ позволяет снизить затраты времени в 20 раз.

Используя предлагаемый способ оценки иммунитета, другие исследователи могут испытывать новые противотуберкулезные препараты, определять другие иммунологические параметры как в системе иммунитета, так и в межсистемах, а также параметры неспецифической защиты. Составив на этой основе дифференциально-прогностическую таблицу, могут использовать ее в дальнейшей своей работе, накапливая базу данных.

Пример 3. Для производственного испытания метода оценки иммунитета в хозяйстве, неблагополучном по туберкулезу, где в плановом порядке применяется вакцина БЦЖ, берут пробы крови у молодняка крупного рогатого скота у одних в возрасте 7-8 месяцев, у других в возрасте 10-12 месяцев, ранее привитых вакциной БЦЖ в возрасте до 20-ти дней, по 40 животных в каждой группе.

В крови животных определяют число иммунокомпетентных клеток в абсолютном содержании. Далее иммунологические параметры подвергают дискретно-динамическому анализу, который автоматизирован специально составленной программой для ЭВМ. По результатам проведенного анализа составляют дифференциально-прогностическую таблицу (табл.9), в которой показаны 22 значимых сочетания параметров (вариабельный, базис) для молодняка в возрасте 7-8 месяцев и 11 - для молодняка в возрасте 8-10 месяцев.

В дальнейшем, используя значения базисного и вариабельного параметров таблицы, оценивают каждого животного исследуемой группы по всем значимым сочетаниям параметров. Если показатели числа иммунокомпетентных клеток животного соответствуют интервалам хотя бы одного из сочетаний (базисного, вариабельного) таблицы, такие животные признаются с высокой активностью иммунокомпетентных клеток. В этом случае животные могут противостоять спонтанному заражению туберкулезом в условиях неблагополучной фермы.

При полном анализе всех животных было выявлено с высокой активностью иммунокомпетентных клеток 22 из 40 животных (52,5%) в возрасте 7-8 и 17 из 40 животных (42,5%) в возрасте 10-12 месяцев.

Делая общую оценку по стаду, можно сказать, что молодняк крупного рогатого скота, привитый вакциной БЦЖ, в возрасте 7-8 месяцев удовлетворительно защищен от заражения туберкулезом и менее защищен в возрасте 10-12 месяцев.

Таблица 2
Корреляционные связи иммунологических параметров у привитого вакциной БЦЖ молодняка крупного рогатого скота, rВозраст, месНомер параметраИммунологические параметрынейтрофилыЕ-рокЕА-рокЕАС-рокЕТ-рок 1-0,750,530,360,39 2--0,790,630,464-53---0,780,75 4----0,69 5----- 1-0,0020,130,21-0,06 2--0,400,550,649-113---0,590,73 4----0,71 5- --- 1-0,030,04-0,13-0,05 2--0,670,660,3215-173---0,610,55 4----0,68 5-----

Изобретение относится к области ветеринарной иммунологии, а именно к технике оценки иммунитета у привитых животных. Сущность изобретения составляет способ, основанный на дифференциально-прогностическом исследовании с использованием дискретно-динамических параметров: концентрации нейтрофилов, Т-лимфоцитов, Т-киллеров, Т- и В-лимфоцитов в возрастных группах. Техническим результатом является повышение эффективности прижизненной оценки иммунитета привитых животных и снижение затрат времени путем использования программы для ЭВМ и составлении дифференциально-прогностической таблицы по значениям базисного и вариабельного параметров, по которому оценивают иммунитет у привитых животных. 9 табл.

Способ оценки иммунитета привитого молодняка крупного рогатого скота (КРС) путем иммунологического исследования крови в возрастных группах животных, отличающийся тем, что для оценки иммунитета молодняка, привитого от туберкулеза, определяют концентрацию нейтрофилов, Т-лимфоцитов (Е-РОК), Т-киллеров (ЕА), Т-лимфоцитов, распознающих антигены микобактерий туберкулеза (ЕТ), В-лимфоцитов (ЕАС) в возрастных группах 4-5, 9-11 и 15-17 месяцев, исследуют полученные значения с помощью компьютерной программы с учетом вариабельных и базисных значений по каждой группе и по отклонению этих значений в сравнении с интактными животными оценивают состояние иммунитета у молодняка КРС, привитого от туберкулеза.