СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПАТОГЕННОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ Российский патент 2005 года по МПК G01N33/15 C12Q1/02 

Изобретение относится к области медицины, а именно клинической лабораторной диагностике, и может быть использовано, в частности, для определения этиологической роли микроорганизмов в инфекционной патологии.

В практической медицине известно несколько способов определения патогенности выделенных микроорганизмов. В частности, определение таких факторов патогенности, как адгезивной активности бактерий, цитолитической и гемолитической активностей, продукция ими протеазы, гиалуронидазы, а также деградация бактериями таких факторов неспецифической резистентности организма, как лизоцим, комплемент и интерферон (Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования / Под ред. М.О. Биргера. - 3-е изд., переработанное и дополненное. - М.: Медицина, 1982, с.117; Стейниер Р., Эдельберг Э., Ингрэм Дж. Мир микробов. - Т.3. - М.: Мир, 1979, с.365-397).

Под патогенностью бактерий понимают способность вызывать заболевание. Это видовой полидетерминантный признак возбудителя, обозначающий его потенциальную возможность вызывать инфекционный процесс, то есть проникать в организм, размножаться в нем и оказывать на него повреждающее действие. Основные факторы патогенности разделяют на три группы:

1. Факторы, определяющие взаимодействие микроорганизма с эпителием слизистых оболочек.

2. Факторы, способствующие устойчивости микроорганизма к гуморальным и клеточным факторам защиты макроорганизма и способности размножаться in vivo.

3. Способность продуцировать токсины и токсические продукты, вызывая собственно патологический процесс.

Важной фазой инфекционного процесса является взаимодействие микроба с клеточными и гуморальными механизмами хозяина и обеспечения размножения in vivo. Патогенные и условно-патогенные бактерии используют для этого различного рода механизмы защиты. Так жгутики подвижных бактерий препятствуют их контакту с фагоцитами. Бактерии могут продуцировать факторы, подавляющие миграцию лейкоцитов к месту инфекции или подавляющие поглощение бактерий. У многих бактерий существуют структуры, обеспечивающие их выживание и размножение внутри фагоцитов. Эти структуры способствуют устойчивости микроорганизма к переваривающей активности фаголизосом либо препятствуют слиянию фагосом с лизосомами. В то же время, резистентность к бактерицидному действию нормальной сыворотки у клебсиелл, например, обуславливается наличием белков наружной мембраны липополисахаридов и кислых полисахаридов К-антигена. Также к факторам патогенности относят адгезивиые и цитотоксические свойства бактерий (пили, экзо- и эндотоксины, ферментативные факторы).

Наиболее близким по своим прогностическим параметрам к предлагаемому нами способу, является способ определения антилизоцимной активности микроорганизмов, постановка которого занимает в среднем 48 ч. Факт обнаружения этого свойства у Staphylococcus aureus и установление выраженности этого признака у других видов свыше 6 мкг/мл, позволяет определить микроорганизм-носитель данного свойства к категории резидентных микроорганизмов, которые, как правило, являются этиологическими агентом в развитии инфекции (Бухарин О.В., Усвяцов Б.Я., Малышкин А.П., Немцова Н.В. Журн. Микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии, №2, 1984, с.27 и 28, Бухарин О.В., Усвяцов Б.Я. Бактерионосительство (медико-экологический аспект). Екатеринбург. УрО РАН, 1996. С.120).

Данный способ имеет следующие недостатки.

Способ не позволяет сделать достаточно достоверный вывод о потенциальной патогенности того или иного штамма, так как если в слюнной и слезной жидкости лизоцим является одним из основных антимикробных агентов, то в других средах человеческого организма его концентрация существенно ниже и наличие этого свойства у микроорганизма еще не обеспечивает его носителю достаточной устойчивости и способности вызывать инфекционный процесс. Кроме того, колебания его уровня при развитии тех или иных нозоформ практически не изучено. Напротив, повышение уровня лактоферрин в организме при сепсисе, пневмонии и других инфекционных заболеваниях является установленным фактом и, следовательно, устойчивость микроорганизма к данному фактору неспецифического иммунитета позволит ему достаточно успешно размножаться in vivo.

Способ требует для количественного определения антилизоцимной активности использования тест-культуры Micrococcus lysodeicticus и, как следствие, дополнительных манипуляций и реактивов для ее подготовки.

Способ основан на методе отсроченного антагонизма и поэтому увеличивает время анализа на дополнительных 24 ч для предварительного выращивания исследуемой культуры.

Целью представленного изобретения является увеличение чувствительности, точности, сокращение времени, необходимого для установления патогенности выделенного штамма при одновременной простоте и доступности предлагаемого способа для широкого практического применения.

Поставленная цель в изобретении достигается тем, что в качестве маркера используют лактоферрин, взятый в концентрации 320 - 580 нг/мл с дальнейшим установлением количества выживших микроорганизмов сравнением оптической плотности опыта и контроля.

Таким образом, преимущество предлагаемого способа в том, что установление повреждающего воздействия лактоферрина на выделенные микроорганизмы повышает достоверность определения их патогенности. Так как проводится определение прямого повреждающего действия лактоферрина на бактериальную клетку, время анализа после получения чистой культуры составляет 3,5 ч, что на 44 часа быстрее, чем прототип.

Кроме того, применением для количественного определения числа выживших клеток бактерий после инкубации с лактоферрином фотоэлектрокалориметра (КФК-2) делает предлагаемую методику более чувствительной, чем достигается более высокая точность и воспроизводимость результатов.

Способ доступен для широкого практического использования благодаря относительно низкой себестоимости и простоте выполнения.

Предложенный способ был успешно апробирован на 100 образцах в практической работе кафедры общей и биоорганической химии Астраханской государственной медицинской академии в течение 2002 года.

Ниже приводятся результаты апробации.

Пример №1.

Определяли устойчивость к повреждающему действию лактоферрина Staphylococcus epidermidis, имеющего типичные биохимические, морфологические и культуральные характеристики и выделенного из спермы здорового донора С-ва.

В одну пробирку помещали 0,2 мл лактоферрина, взятого в концентрации 0,8 мкг/мл (опыт), и во вторую - 0,2 мл 0,5% раствора хлорида натрия - контроль. Затем в контрольную и опытную пробирки вносили по 0,1 мл взвеси исследуемой культуры в концентрации 10²⁰ мк/мл. Конечная концентрация ЛФ в опыте составляла 320 нг/мл.

После этого пробирки инкубировали в течение 30 минут при 37°С. Затем реакцию останавливали внесением в пробирки 5 мл питательного бульона с последующим содержанием пробирок в течение 2 часов при тех же условиях для размножения оставшихся в живых бактериальных клеток. После чего измеряли оптическую плотность (ОП) взвеси в опыте и контроле при длине волны 490 нм на фотоэлектрокалориметре (КФК-2). Сравнивая ОП опыта и ОП контроля, можно сделать вывод о количестве выживших и способных к дальнейшему размножению клеток. Принимая ОП контроля за 100%, вычисляли количество выживших бактерий в опыте.

В этом варианте ОП опыта ниже контрольной на 70% (то есть составляла 30%). Исходя из полученных результатов делается вывод об отсутствии патогенного потенциала у данного штамма Staphylococcus epidermidis (Таблица 1).

Пример №2.

Определяли устойчивость к повреждающему действию лактоферрина Staphylococcus epidermidis, имеющего типичные биохимические, морфологические и культуральные характеристики и выделенного из спермы пациента Г-ко с хроническим простатитом.

В одну пробирку помещали 0,2 мл лактоферрина, взятого в концентрации 0,8 мкг/мл (опыт), и во вторую - 0,2 мл 0,5% раствора хлорида натрия - контроль. Затем в контрольную и опытную пробирки вносили по 0,3 мл взвеси исследуемой культуры в концентрации 10²⁰ мк/мл. Конечная концентрация ЛФ в опыте составляла 400 нг/мл.

Далее, исследование проводили способом, описанным в примере №1.

В этом примере ОП опыта превышала контрольную на 40% (то есть составляла 140%). Исходя из полученных результатов делается вывод о патогенности данного штамма Staphylococcus epidermidis и его значимости в этиологии простатита (Таблица 1).

Пример №3.

Определяли устойчивость к повреждающему действию лактоферрина Staphylococcus epidermidis, имеющего типичные биохимические, морфологические и культуральные характеристики и выделенного из раневого отделяемого пациента Н-а.

В одну пробирку помещали 0,2 мл лактоферрина, взятого в концентрации 0,8 мкг/мл (опыт), и во вторую - 0,2 мл 0,5% раствора хлорида натрия - контроль. Затем в контрольную и опытную пробирки вносили по 0,4 мл взвеси исследуемой культуры в концентрации 10²⁰ мк/мл. Конечная концентрация ЛФ в опыте составляла 580 нг/мл.

Далее, исследование проводили способом, описанным в примере №1.

В этом случае ОП опыта превышает контрольную на 20% (то есть составляла 120%). Исходя из полученных результатов делается вывод о патогенности данного штамма Staphylococcus epidermidis и его значимости в этиологии раневой инфекции (Таблица 1).

Предлагаемым способом достигается положительный эффект: повышается эффективность определения патогенности микроорганизмов за счет использования в качестве маркера их устойчивости к лактоферрину, повышается чувствительность, точность проведения анализа при одновременном использовании недорогого оборудования и реактивов, простоте и доступности для широкого практического применения, сокращается число стадий по сравнению с прототипом и как следствие этого сокращается время, необходимое для выдачи заключения лаборатории на 44 ч.

Проведение этого исследования расширит возможности установления этиологии инфекционного процесса различной локализации.

Предлагаемый способ может быть использован в фундаментальной и практической медицине для определения патогенности микроорганизмов.

Таблица 1
Воспроизводимость результатов определения патогенности микроорганизмов предлагаемым способомПримерКонцентрация лактоферрина, нг/млОП контрольОП опыт%ОП опыта от контроляПатогенность выделенных микроорганизмов1320,00,050,01530,0Не патогенный2400,00,10,120120,0Патогенный3580,00,20,280140,0Патогенный

Изобретение относится к области медицины и касается способа определения патогенности микроорганизма Staphylococcus epidermidis. Сущность изобретения заключается в инкубации опытных проб. Выделенных от доноров с лактоферрином в концентрации 320-580 нг/мл с дальнейшим установлением количества выживших микроорганизмов по сравнению с контролем. Преимущество изобретения заключается в повышении чувствительности способа. 1 табл.

Способ определения патогенности микроорганизмов Staphylococcus epidermidis, характеризующийся тем, что опытные пробы микроорганизмов, выделенные от доноров, инкубируют с лактоферрином в концентрации 320-580 нг/мл с дальнейшим установлением количества выживших микроорганизмов сравнением оптической плотности опыта и контроля и при превышении оптической плотности по сравнению с контролем считают данный штамм патогенным.