СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПАТОГЕННОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ STAPHYLOCOCCUS EPIDERMIDIS, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ СПЕРМЫ Российский патент 2005 года по МПК G01N33/15 C12Q1/02 

Изобретение относится к области медицины, а именно урологии, и может быть использовано, в частности, для определения этиологической роли микроорганизмов в развитии инфекционных заболеваний урогенитальной сферы.

В практической медицине известно несколько способов определения патогенности выделенных микроорганизмов. В частности, определение таких факторов патогенности, как адгезивная активность бактерий, цитолитическая и гемолитическая активность, продукция ими протеазы, гиалуронидазы, а также деградация бактериями таких факторов неспецифической резистентности организма, как лизоцим, комплемент и интерферон (Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования / Под ред. М.О.Биргера. - 3-е изд., переработанное и дополненное. - М.: Медицина, 1982, с.117, Р.Стейниер, Э.Эдельберг, Дж.Ингрэм, Мир микробов, т.3. - М.: Мир, 1979, с.365-397).

Считается установленным, что основными возбудителями инфекций урогенитального тракта мужчин, влекущих за собой развитие патоспермии, являются представители аутофлоры человека. Поскольку в структуре микроорганизмов, изолируемых из эякулята здоровых мужчин и больных бесплодием, доминируют представители условно патогенной флоры, очевидно, что дифференциация этиологически значимых микроорганизмов от представителей нормальной микрофлоры или контаминантов должна основываться на выявлении качественных признаков, характерных для патогенных микроорганизмов.

К примеру, наиболее часто изолируемые из спермы субфертильных мужчин Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophyticus и Staphylococcus haemolyticus характеризуются выраженной адгезией и связыванием некоторых поверхностных белков эукариотических клеток (ламинина, фибронектина, витронектина, коллагена), что способствует развитию восходящей инфекции урогенитального тракта и колонизации простаты, проявляющихся в агглютинации сперматозоидов. Кроме того, эти стафилококки продуцируют внеклеточную слизь (slime substanse) с антифагоцитарными, антихемотаксическими и антипролиферативными свойствами, которая оказывает повреждающее действие на нейтрофилы и лимфоциты, а также, вероятно, угнетает подвижность сперматозоидов. Возможность длительного сохранения коагулазоотрицательных стафилококков в отделах урогенитального тракта, по всей видимости, определяется их устойчивостью к лизоциму комплемента и относящегося к группе дефенсинов мембранотропного антимикробного белка тромбоцитов.

Одной из интегральных биохимических систем, играющих важную роль в неспецифических защитных реакциях организма и, в частности, спермы, является набор полиаминов (спермин, спермидин, путресцин), оказывающих антибактериальное и антивирусное действие. Полагают, что в очень малых концентрациях окисленные производные полиаминов подавляют рост и размножение многих бактерий и вирусов. Поэтому определение устойчивости выделяемых из спермы микроорганизмов к спермину и спермидину позволит определить потенциальную патогенность выделенных из спермы культур.

Близким по своим прогностическим параметрам к предлагаемому нами способу является способ определения антилизоцимной активности микроорганизмов, постановка которого занимает в среднем 48 ч. Факт обнаружения этого свойства у Staphylococcus aureus и установление выраженности этого признака у других видов свыше 6 мкг/мл позволяют определить микроорганизм - носитель данного свойства к категории резидентных микроорганизмов, которые, как правило, являются этиологическими агентами в развитии инфекции (Бухарин О. В., Усвяцов Б. Я., Малышкин А. П., Немцева Н. В. Журн. Микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - №2, 1984, с.27-28, Бухарин О. В., Усвяцов Б. Я. Бактерионосительство (медико-экологический аспект). Екатеринбург. УрО РАН, 1996. С.120).

Данный способ имеет следующие недостатки:

Способ не позволяет сделать достаточно достоверный вывод о потенциальной патогенности того или иного штамма, так как если в слюнной и слезной жидкости лизоцим является одним из основных антимикробных агентов, то в сперме его концентрация существенно ниже и наличие этого свойства у микроорганизма еще не обеспечивает его носителю достаточной устойчивости и способности вызывать инфекционный процесс. В то время как устойчивость бактерий к спермину и спермидину является высокоспецифичным маркером для патогенных бактерий, выделяемых из спермы.

Способ требует для количественного определения антилизоцимной активности использования тест-культуры Micrococcus lysodeicticus и, как следствие, дополнительных манипуляций и реактивов для ее подготовки.

Способ основан на методе отсроченного антагонизма и поэтому увеличивает время анализа на дополнительных 24 ч для предварительного выращивания исследуемой культуры.

Целью представленного изобретения является увеличение чувствительности, точности, сокращение времени, необходимого для установления патогенности выделенного штамма.

Поставленная цель в изобретении достигается тем, что опытные пробы микроорганизмов, выделенные от доноров, инкубируют со спермином или спермидином в концентрации 0,02-0,06 мг/мл с дальнейшим установлением количества выживших микроорганизмов сравнением оптической плотности опыта и контроля и при превышении ее по сравнению с контролем считают данный штамм патогенным.

Таким образом, преимущество предлагаемого способа в том, что установление повреждающего воздействия спермина и спермидина на выделенные микроорганизмы повышает достоверность определения их патогенности. Так как проводится определение прямого повреждающего воздействия спермина и спермидина на бактериальную клетку, время анализа после получения чистой культуры составляет 3,5 ч, что на 44 часа быстрее, чем прототип.

Кроме того, применением для количественного определения числа выживших клеток бактерий после инкубации со спермином и спермидином фотоэлектрокалориметра (КФК - 2) делает предлагаемую методику более чувствительной, чем достигается более высокая точность и воспроизводимость результатов.

Способ доступен для широкого практического использования благодаря относительно низкой себестоимости и простоте выполнения.

Предложенный способ был успешно апробирован на 100 образцах в практической работе кафедры общей и биоорганической химии Астраханской государственной медицинской академии в течение 2002 года.

Ниже приводятся результаты апробации.

Пример №1.

Определяли устойчивость к повреждающему действию спермина и спермидина Staphylococcus epidermidis, имеющего типичные биохимические, морфологические и культуральные характеристики и выделенного из спермы пациента Н-а с хроническим простатитом.

В одну пробирку помещали 0,2 мл спермина, взятого в концентрации 0,1 мкг/мл, и во вторую - 0,1 мл спермидина, взятого также в концентрации 0,1 мкг/мл, в третью - 0,1 мл 0,5% раствора хлорида натрия - контроль. Затем в контрольную и опытную пробирки вносили по 0,1 мл взвеси исследуемой культуры в концентрации 10²⁰ мкг/мл. Конечная концентрация спермина и спермидина в опыте составляла 0,02 мг/мл.

После этого пробирки инкубировали в течение 30 минут при 37°С. Затем реакцию останавливали внесением в пробирки 5 мл питательного бульона с последующим содержанием пробирок в течение 2 часов при тех же условиях для размножения оставшихся в живых бактериальных клеток. После чего измеряли оптическую плотность (ОП) взвеси в опыте и контроле при длине волны 490 нм на фотоэлектрокалориметре (КФК-2). Сравнивая ОП опыта и ОП контроля, можно сделать вывод о количестве выживших и способных к дальнейшему размножению клеток. Принимая ОП контроля за 100%, вычисляли количество выживших бактерий в опыте.

В этом варианте ОП опыта выше контрольной на 30% (то есть составляла 130%) при использовании спермина и 40% (то есть составляла 140%) при использовании спермидина. Исходя из полученных результатов, делается вывод о патогенности данного штамма Staphylococcus epidermidis и его значимости в этиологии простатита (Таблицы 1, 2).

Пример №2.

Определяли устойчивость к повреждающему действию спермина и спермидина Staphylococcus epidermidis, имеющего типичные биохимические, морфологические и культуральные характеристики и выделенного из спермы пациента Б-а с хроническим простатитом.

В одну пробирку помещали 0,2 мл спермина, взятого в концентрации 0,1 мкг/мл, и во вторую - 0,2 мл спермидина, взятого также в концентрации 0,1 мкг/мл, в третью - 0,2 мл 0,5% раствора хлорида натрия - контроль. Затем в контрольную и опытную пробирки вносили по 0,1 мл взвеси исследуемой культуры в концентрации 10²⁰ мкг/мл. Конечная концентрация спермина и спермидина в опыте составляла 0,04 мг/мл.

Далее, исследование проводили способом, описанным в примере №1.

В этом примере ОП опыта превышала контрольную на 40% (то есть составляла 140%) при использовании спермина и ОП опыта превышала контрольные цифры на 20% (то есть составляла 120%) при использовании спермидина. Исходя из полученных результатов делается вывод о патогенности данного штамма Staphylococcus epidermidis и его значимости в этиологии простатита (Таблицы 1, 2).

Пример №3.

Определяли устойчивость к повреждающему действию спермина и спермидина Staphylococcus epidermidis, имеющего типичные биохимические, морфологические и культуральные характеристики и выделенного из спермы здорового донора У-ва.

В одну пробирку помещали 0,3 мл спермина, взятого в концентрации 0,1 мкг/мл, и во вторую - 0,3 мл спермидина, взятого также в концентрации 0,1 мкг/мл, в третью - 0,2 мл 0,5% раствора хлорида натрия - контроль. Затем в контрольную и опытную пробирки вносили по 0,1 мл взвеси исследуемой культуры в концентрации 10²⁰ мкг/мл. Конечная концентрация спермина и спермидина в опыте составляла 0,06 мг/мл.

Далее, исследование проводили способом, описанным в примере №1.

В этом варианте ОП опыта ниже контрольной на 50% (то есть составляла 50%) при использовании спермина и 30% (то есть составляла 70%) при использовании спермидина. Исходя из полученных результатов делается вывод об отсутствии патогенного потенциала у данного штамма Staphylococcus epidermidis (Таблицы 1, 2).

Предлагаемым способом достигается положительный эффект:

повышается эффективность определения патогенности микроорганизмов, выделяемых из спермы, за счет использования в качестве маркера их устойчивости к спермину и спермидину, повышается чувствительность, точность проведения анализа при одновременном использовании не дорогого оборудования и реактивов, простоте и доступности для широкого практического применения, сокращается число стадий по сравнению с прототипом и, как следствие этого, сокращается время, необходимое для выдачи заключения лаборатории, на 44 ч.

Проведение этого исследования расширит возможности установления этиологии инфекционного процесса различной локализации.

Предлагаемый способ может быть использован в фундаментальной и практической медицине для определения патогенности микроорганизмов.

Таблица 1Воспроизводимость результатов определения микроорганизмов с использованием сперминаПримерКонцентрация спермина мг/млОП контрольОП опыт% ОП опыта от контроляПатогенность выделенных микроорганизмов10,020,20,26130Патогенный20,040,10,28140Патогенный30,060,050,025,50Не патогенный

Таблица 2Воспроизводимость результатов определения микроорганизмов с использованием спермидинаПримерКонцентрация спермидина мг/млОП контрольОП опыт% ОП опыта от контроляПатогенность выделенных микроорганизмов10,020,20,28140Патогенный20,040,10,12120Патогенный30,060,050,03570Не патогенный

Изобретение относится к области медицины, а именно к урологии, и касается способа определения патогенности микроорганизмов Staphylococcus Epidermidis, выделенных из спермы. Сущность изобретения заключается в том, что опытные пробы микроорганизмов, выделенные от доноров, инкубируют со спермином или спермидином в концентрации 0,02-0,06 мг/мл с дальнейшим установлением количества выживших микроорганизмов сравнением оптической плотности опыта и контроля и при превышении ее по сравнению с контролем считают данный штамм патогенным. Преимущество изобретения заключается в увеличении чувствительности и точности. 2 табл.

Способ определения патогенности микроорганизмов, Staphylococcus Epidermidis, выделенных из спермы, характеризующийся тем, что опытные пробы микроорганизмов, выделенные от доноров, инкубируют со спермином или спермидином в концентрации 0,02-0,06 мг/мл с дальнейшим установлением количества выживших микроорганизмов сравнением оптической плотности опыта и контроля и при превышении ее по сравнению с контролем считают данный штамм патогенным.