СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БАКТЕРИАЛЬНОГО ЛАКТОФЕРРИНА Российский патент 2011 года по МПК C12P21/00 

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно биохимии и микробиологии, и может быть использовано, в частности, для получения и очищения лактоферрина из бульонной культуры микроорганизмов.

Лактоферрин (ЛФ) представляет собой гликопротеид, ассоциированный с двумя атомами железа, молекулярная масса по данным различных авторов колеблется от 79 до 95 кД. Углеводный компонент составляет 6,6% и представлен тремя цепями, каждая из которых оканчивается остатком сиаловой кислоты и содержит 1 или 2 остатка фукозы, шесть остатков гексозы и четыре остатка N-ацетилглюкозамина.

В настоящее время основным субстратом, из которого выделяют лактоферрин, являются продукты жизнедеятельности человеческого организма: грудное молоко или кровь (Николаев А.А., Аншакова Н.И. Лактоферрин человека: физико-химические свойства и способ очистки // Изобрет. и рационал в медицине. - М., 1987. - С.70-72).

Целью представленного изобретения является получение лактоферрина из бульонной культуры микроорганизмов Klebsiella pneumoniae.

Известно, что необходимость доступного для бактерий железа в тканях выражается в том, что при острых и хронических воспалительных процессах, вызываемых в том числе и инфекционными агентами, развивается гипоферримия. Понижение доставки железа в ткани сопровождается торможением развития железозависимых бактерий. Так, ставшие классическими эксперименты на ящерицах показывают, что при содержании их при повышенной температуре концентрация железа в крови уменьшается, одновременно с этим повышается резистентность этих животных к дифтероидным бактериям. При коррекции уровня железа снижается противоинфекционный иммунитет.

В других опытах, на Vibrio parahaemolyticus, отмечалось, что обеспечение этих бактерий легко доступными соединениями железа повышало их вирулентность для экспериментальных животных.

Аналогичные данные были получены и в отношении Yersinia pestis, Legionella pneumophila, Pseudomonas aeruginosa, Vibrio vulnificus, V. anguilarus, E.coli и др.

В наших исследованиях установлена способность бактерий к синтезу собственного бактериального лактоферрина (БЛФ). Синтез БЛФ подтверждался иммуноферментным анализом, проведенным с набором реагентов для выявления человеческого лактоферрина, обладающего, как известно, 100% специфичностью анализа (Бойко А.В., Бойко О.В. Синтез лактоферрина бактериями // Депонировано в ВНИИТИ, г.Москва. - 20.04.01. - №1039В2001).

Авторами было выяснено, что бактерии, способные к выживанию и размножению в условиях окружающей среды, активно вырабатывают собственные сидерофоры, в том числе и бактериального лактоферрина.

Синтез сидерофоров бактериями является лимитирующим фактором их выживания вне макроорганизма, то есть микробы, не способные синтезировать собственные сидерофоры, активно используют молекулы, имеющиеся в организме хозяина; они полностью зависят от него и не могут успешно развиваться и выживать в условиях окружающей среды.

Предложенный способ был успешно апробирован на 50 образцах в практической работе лаборатории микробиологии Астраханской областной ветеринарной лаборатории в течение 2006 года.

Ниже приводятся результаты апробации.

Пример 1

Проводили выделение бактериального лактоферрина следующим образом.

1. Посев в пробирки с 5 мл мясопептонного бульона (приготовленного в соответствии со «Справочником по микробиологическим и вирусологическим методам исследования»/ под ред. М.О.Биргера. - 3-е изд. М.: Медицина, 1982. - С.48) 0,1 мл суточной агаровой культуры Klebsiella pneumoniae в концентрации 10²⁰ КОЕ, приготовленной с использованием стандарта мутности с последующей инкубацией при 37°С в течение 24 ч.

2. Постановка реакции ИФА способом, указанным в «Наборе реагентов для количественного иммуноферментного определения лактоферрина в сыворотке крови человека Лактоферрин-стрип» для определения наличия лактоферрина в среде.

3. Чтение результатов на фотометре для ИФА при длине волны 492 нм.

4. Начинали выделение лактоферрина с отделения балластных белков в 2 М (116 г/л) сульфате аммония. При этой концентрации лактоферрин не преципитирует, и после отделения осадка в раствор добавляются железоаммоннийные квасцы в концентрации 0,75 г/л для насыщения лактоферрина железом (появление красной окраски свидетельствует о завершении перехода всего лактоферрина из апоформы в форму Fe²⁺).

5. Затем проба тщательно обессоливается и забуферивается фосфатным буфером рН 7,0 (добавляется фосфатный буфер рН 7,0) путем диализа и наносится на колонку с катионообменным сефадексом G-50 /8,5×9 см/. Элюция ведется ступенчатым градиентом концентрации хлористого натрия с шагом 0,05 М. Лактоферрин содержится во фракциях с концентрацией соли 0,25 М и 0,3 М.

Полученный препарат хромотографически и электрофоретически гомогенен.

Определение концентрации собственно лактоферрина без балластных солей в выделенном препарате проводили по методу Лоури - Фолина (Таблица 1).

Пример 2.

Выделение бактериального лактоферрина включало следующие этапы.

1. Посев в пробирки с 5 мл мясопептонного бульона 0,2 мл суточной агаровой культуры Klebsiella pneumoniae в концентрации 10²⁰ КОЕ, приготовленной с использованием стандарта мутности с последующей инкубацией при 37°С в течение 24 ч.

2. Далее методика повторяется аналогично описанной в примере 1 (Таблица 1).

Пример 3.

Проводили выделение бактериального лактоферрина следующим образом:

1. Посев в пробирки с 5 мл мясопептонного бульона 0,3 мл суточной агаровой культуры Klebsiella pneumoniae в концентрации 10²⁰ КОЕ, приготовленной с использованием стандарта мутности с последующей инкубацией при 37°С в течение 24 ч.

2. Далее методика повторяется аналогично описанной в примере 1 (Таблица 1).

Применение предлагаемого способа получения и очистки бактериального лактоферрина приводит к выделению ценного биологического материала, применяемого в медицине для лечения и профилактики инфекционных процессов различной локализации, а также в производстве диагностических тест-систем и работе научно-исследовательских лабораторий.

Использование этого способа позволит существенно снизить стоимость получения лактоферрина с одновременным увеличением выхода готовой продукции.

Изобретение может быть рекомендовано к применению в практической деятельности предприятий, занимающихся производством биопрепаратов, а также работе профильных научно-исследовательских лабораторий.

Таблица 1 Воспроизводимость результатов получения бактериального лактоферрина предлагаемым способом Пример Объем внесенной в пробирки бактериальной взвеси, мл Продукция бактериального лактоферрина, нг/мл 1 0,1 31,0 2 0,2 40,4 3 0,3 60,1

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для получения и очищения лактоферрина из бульонной культуры микроорганизмов. Способ предусматривает инкубацию Klebsiella pneumoniae на питательном бульоне при температуре 37°С с получением бульонной культуры и с последующей постановкой реакции ИФА. Отделение балластных белков в 2 М сульфате аммония с получением раствора. В полученный раствор добавляют железоаммонийные квасцы для насыщения лактоферрина железом. Насыщенный железом раствор обессоливают и забуферивают фосфатным буфером с последующим нанесением на колонку с катионообменным сефадексом G-50 /8,5×9 см/ и проведением элюции ступенчатым градиентом концентрации хлористого натрия с получением лактоферрина, содержащегося во фракциях с концентрацией соли 0,25 М и 0,3 М. Изобретение позволяет увеличить выход целевого продукта. 1 табл.

Способ получения бактериального лактоферрина, заключающийся в обработке суточной бактериальной культуры Klebsiella pneumoniae отделением балластных белков в 2 М сульфате аммония, добавлении раствора железо-аммонийных квасцов для насыщения лактоферрина железом, обессоливании пробы и забуферивании фосфатным буфером рН-7,0 с последующим нанесением на колонку с катионообменным сефадексом G-50 (8,5×9 см), проведением элюции ступенчатым градиентом концентрации хлористого натрия, при этом лактоферрин содержится во фракциях с концентрацией соли 0,25 М и 0,3 М.