ШТАММ KLEBSIELLA PNEUMONIAE ВКПМ В-7001, ДОНОР ГЕНОВ ARS-ОПЕРОНА, ДЛЯ СОЗДАНИЯ ШТАММОВ БАКТЕРИЙ-БИОДЕСТРУКТОРОВ МЫШЬЯКСОДЕРЖАЩИХ СОЕДИНЕНИЙ Российский патент 2005 года по МПК C12N1/20 C12N1/20 C12R1/22 

Изобретение относится к области микробиологии и биотехнологии и может быть использовано для конструирования штаммов микроорганизмов с усиленной биодеструктивной активностью, перспективных для использования в биотехнологии утилизации люизита.

Природные штаммы микроорганизмов-деструкторов характеризуются низкой биодеструкцией ксенобиотиков и приспособлены к существованию в определенной экологической нише (Биотехнология в решении проблемы уничтожения химического оружия / С.В.Петров, Ю.Н.Корякин, В.И.Холстов, Н.В.Завьялова // Рос. хим. журн. - 1995. - Е. XXXIX, №4. - С.18-20). Дополнительный этап "генетической доработки" бактерий таких штаммов с целью повышения эффективности действия соответствующих ферментных систем и адаптации микроорганизмов к условиям технологического цикла является важнейшим условием использования природных бактерий-деструкторов в биотехнологии утилизации мышьяксодержащих отравляющих веществ (люизита, например).

Вследствие высокой токсичности соединений мышьяка, в том числе и для микроорганизмов, в биотехнологических целях могут быть использованы лишь штаммы бактерий, резистентные к соединениям мышьяка.

Известны некоторые виды микроорганизмов, обладающих указанными свойствами в отношении солей тяжелых металлов (Ktapciska D., Chmielowski S., Czernioch-Panz В / Localizacja germanu, akumulowanego w komorkach Pseudomonas putida // Acta Biol. Siles. - 1985. - Vol. 13. - P.22-27; Leswan В., Smytta A., Smalas J.Zbadanie wrazliwosci promieniowcow na iony otowin ozarproba ich adaptacji // Acta Biol. Siles. - Vol.3. - P.59-67; Rosck E., Mangir M. Lochmann E. - R. Unterschiedliche aufnahme von Cadmium in Saccharomyces und Rhodotorula Zeilen // Chemosphere. - 1986. - Vol.15 S. - P.81-83). Известны также плазмиды, детерминирующие индуцибельную резистентность содержащих такие плазмиды бактерий к соединениям мышьяка (Inducible plasmid-determined resistance to arsenate, arsenite and antimony (III) in Eschericha coli and Staphylococcus aureus / S. Silver, K. Budd, K.M. Leahy et. al. // J. Bacteriol. - 1981. - Vol.146, №3. - P 983-996).

Недостатком таких штаммов и содержащихся в них плазмид является неизученность с точки зрения их "технологичности", необходимой для адаптации микробов к условиям определенного биотехнологического цикла.

Стоимость штаммов, депонированных в зарубежных коллекциях, довольно высока. Необходимость их "генетической доработки" для усиления деструктивной активности при повышенных концентрационных пределах токсического действия соединений мышьяка делает нерентабельным их приобретение из-за рубежа, что предопределяет поиск и выделение природных штаммов микроорганизмов с повышенной резистентностью к соединениям мышьяка из окружающей среды, а также из популяции клинических изолятов, в том числе и патогенных бактерий.

Установлены механизмы, посредством которых микроорганизмы способны поглощать тяжелые металлы (Lattudy F. La precipitation des metaux lourds // Biofutur. - 1990. - №93. - P.36-37). Резистентность микроорганизмов к соединениям мышьяка определяется наличием в их геноме ars-оперона, структурные гены которого клонированы (Hänel F., Krügel Н., Fiedler G. Arsenical resistance of growth and phosphate control of antibiotic biosynthesis in Streptomyces // J.Gen. Microbiol. - 1989. - Vol.135, Pt.3. - Р.583-591; San-Francisco H.J.R., Tisa L.S., Kosen B.R. Identification of the memberane component of the anion pump encoded by the arsenical resistance operon of R-factor R773 // Mol. Microbiol. - 1989, - Vol.3, №1, - P.15-21). В последние годы установлено, что последовательность ДНК, гомологичная хромосомному гену ars кишечной палочки, как правило, присутствует в хромосоме грамотрицательных бактерий, устойчивых к соединениям мышьяка (Arsenic resistance determinants from environmental bacteria / J.A.Esquivel, V.Meza, J.C.Torres-Gusman et al. // Rev. Latinoamer. Microbiol, - 1998. - Vol. 40, №1-2. - P.45-52.

Наиболее близким к заявляемому является штамм кишечной палочки (E.coli HB 101), содержащий выделенную из условно-патогенных бактерий конъюгативную плазмиду R 773 (Inc FI) (Antirestriction activivty of metalloregulatory proteins ArsR and MerR sourse / S.M. Rastorguev, I.A. Letuchaya, G.G. Kholodii et al. // Molecular Biology. - 1999. - Vol.33, №2. - P.170-172). Штамм используется для изучения влияния репрессора ars-оперона, в частности гена arsR, на устойчивость резистентных бактерий к соединениям мышьяка. Штамм бактерий, содержащий конъюгативную плазмиду R773, нашел практическое применение в научных исследованиях, связанных с выяснением интимных механизмов функционирования ars-оперона, и не предназначается для использования в биотехнологии утилизации люизита или для создания на его основе штаммов микроорганизмов-деструкторов данного ксенобиотика.

Задачей изобретения является выделение из различных экологических ниш штаммов микроорганизмов с повышенной резистентностью к соединениям мышьяка, сравнительное изучение их биологических свойств и поиск плазмид, детерминирующих устойчивость штаммов бактерий к соединениям мышьяка.

Технический результат, который может быть достигнут при использовании штамма К. pneumoniae ВКПМ В-7001, - возможность получения генов ars-оперона для конструирования штаммов микроорганизмов-деструкторов люизита, пригодных для биотехнологической утилизации данного ксенобиотика.

Указанная задача решена выделением и исследованием свыше 140 изолятов микроорганизмов, среди которых отобрано 12 штаммов бактерий, обладающих повышенной устойчивостью к соединениям мышьяка. У 9 из 12 отобранных штаммов выявлены плазмиды с молекулярной массой от 2,4 до 87 МДа. Штамм К.pneumoniae ВКПМ В-7001, выделенный от больного, является диким типом и был идентифицирован по определителю (О. Kandlor, N. Weiss 1986. Regular, Nonsporting Gramnegative Kods // Jn:P.H. Sneath, N.S. Mair, M.E. Sharpe, J.G.Holt(ed) Bergey's manual of Systematic bacteriology, Vol.1. The Williams and Wilkins Co., Baltimore).

В бактериях штамма обнаружена конъюгативная плазмида рВК1 (25 МДа), детерминирующая резистентность к соединениям мышьяка и множественную лекарственную устойчивость. Штамм депонирован в коллекции микробных культур НИИ микробиологии МО РФ и Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ГосНИИГенетика (коллекционный номер ВКПМ В-7001).

Штамм характеризуется следующими признаками.

При выращивании бактерий в бульоне на основе ферментативного гидролизата мяса в течение 48 часов при температуре 37°С образуется равномерная муть. На плотной питательной среде вырастают куполообразные, блестящие, пышные, слизистые колонии. На питательных средах Эндо и Плоскирева бактерии формируют красные колонии с металлическим блеском. Цитрат и глюкозу бактерии используют в качестве единственных источников углерода, а аммиак - как источник азота.

Морфология клеток.

Грамотрицательные прямые неподвижные палочки размером 0, 3...1, 5×0,6 мкм, имеющие выраженную капсулу. В мазках бактерии располагаются одиночно, парами или короткими цепочками. Бактерии спор не образуют, лишены жгутиков.

Физиолого-биологические признаки штамма.

Факультативный анаэроб, каталазоположительный оксидазоотрицательный. Образует 2,3-бутандиол в качестве главного конечного продукта сбраживания глюкозы. Реакция Фогеса-Проскауэра положительная. Глюкоза сбраживается с образованием кислоты и газа. Ферментирует лактозу, дульцит. На среде TSI (среда с железом и сахарами) сероводород не образует. Обладает уреазной активностью. Желатиназу и индол не образует.

Оптимальная температура для роста 35...37°С. Оптимальное значение рН среды 7,2.

Бактерии штамма устойчивы к ампициллину, тетрациклину, хлорамфениколу, стрептомицину, канамицину, триметоприму, налидиксовой кислоте; чувствительны к рифампицину.

В бактериальных клетках имеются четыре плазмиды с молекулярной массой (МДа): 25,0; 55,0; 72,0; 87,0. Плазмида pBK1 имеет молекулярную массу 25 МДа, конъюгативна, детерминирует устойчивость к соединениям мышьяка и множественную лекарственную устойчивость. Минимальная ингибирующая концентрация (МИК) для As (V) - 36 мг · мл^-1, для As (III) - 58 мг · мл^-1 (в пересчете на чистый мышьяк).

Бактерии штамма авирулентны для лабораторных животных.

Способ, условия и состав сред для хранения бактерий штамма.

Штамм K.pneumoniae ВКПМ В-7001 хранится в лиофилизированном состоянии в ампулах под вакуумом при температуре минус 20°С. Защитная среда при высушивании - сахароза 10%, желатина 4%, рН среды 7,2±0,2.

Способ, условия и состав сред для размножения бактерий штамма K.pneumoniae ВКПМ В-7001.

Бактерии выращивают при температуре 35...37°С на питательной среде следующего состава:

КН₂PO₄ - 8,8 г,

NaOH - 1,4 г,

сухой экстракт кормовых дрожжей - 5,2 г,

мясной гидролизат - 10,0 мл,

дистиллированная вода до 1,0 л.

рН среды - 7,2±0,1. (Питательная среда для культивирования микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae и неферментирующих грамотрицательных бактерий: патент РФ №1745766 1992 г.).

Для приготовления плотной питательной среды в жидкую питательную среду приведенного состава добавляют 15,0 г агар-агара, стерилизуют 30 минут при температуре 121°С и разливают растопленную и остуженную до температуры 50°С среду в стерильные чашки Петри.

Для оценки устойчивости бактерий K.pneumoniae ВКПМ В-7001 к мышьяку используют соединения, содержащие мышьяк различной валентности: As₂O₃(III) и Na₃AsO₄ (V). В качестве количественной характеристики резистентности бактерий к соединениям мышьяка используют показатель МИК (минимальная ингибирующая концентрация). Клеточную суспензию исследуемых бактерий и контрольного штамма Escherichia coli 803 в физиологическом растворе NaCl (1·10⁷ микробов · мл^-1) наносят в виде капли на плотную питательную среду вышеприведенного состава, содержащую различные концентрации соединений мышьяка. Растворы последних готовят и предварительно стерилизуют путем фильтрования с использованием фильтров с диаметром пор 25 мкм фирмы "Sartorius". Посевы микробных культур на питательные среды в чашках Петри выращивают в течение 40 часов при температуре 37°С, после чего учитывают интенсивность роста по сравнению с контролем (посев бактерий на плотную питательную среду без ингибирующих добавок).

Для подавляющего большинства штаммов бактерий значения МИК As (III) составляют (0,15...0,60) мг · мл^-1, As (V) (0,18...0,54) мг · мл^-1 в пересчете на чистый мышьяк, в частности для бактерий штамма E.coli 803 - 0,18 мг · мл^-1, 0,32 мг · мл^-1 соответственно. МИК для бактерий штамма K.pneumoniae ВКПМ В-7001 As(III) составляет 58 мг · мл^-1, As(V) - 36 мг · мл^-1.

Из четырех плазмид, содержащихся в бактериях штамма K.pneumoniae ВКПМ В-7001, лишь одна детерминирует резистентность к мышьяку - конъюгативная плазмида рВК1, имеющая молекулярную массу 25 МДа. Конъюгационную передачу плазмиды рВК1 осуществляют в реципиентный штамм кишечной палочки. В качестве реципиента используют устойчивый к рифампицину штамм Escherichia coli 803 Rif^r (МИК для бактерий реципиентного штамма As(III, V) составляет - 0,32 мг · мл^-1 в пересчете на чистый мышьяк).

Конъюгационную передачу плазмидной ДНК рВК1 осуществляют согласно руководству (Миллер ДЖ. Эксперименты в молекулярной генетике. Пер. с англ. / Под ред. С.И.Алиханяна. М.: Мир, 1976) при скрещивании донорных и реципиентных бактериальных клеток в жидкой питательной среде. Отбор выросших трансконъюгатов проводят с поверхности плотных селективных питательных сред с антибиотиками: рифампицином в сочетании с антибактериальными препаратами, к которым устойчивы бактерии K.pneumoniae ВКПМ В-7001.

Трансконъюгаты E.coli 803Rif^r (pBK1) вместе с резистентностью к мышьяку (МИК > 14 мг · мл^-1) приобретают устойчивость к тетрациклину, хлорамфениколу, стрептомицину и ампициллину.

Положительной характеристикой штамма K.pneumoniae ВКПМ В-7001 является наличие в его бактериях конъюгативной плазмиды pBK1 с генетической детерминантой резистентности к соединениям мышьяка и маркерами резистентности к 4 антибактериальным препаратам, облегчающим последующие генитические манипуляции, связанные с конструированием рекомбинантных плазмид, их передачей в соответствующие реципиентные штаммы бактерий и исследованием рекомбинантных плазмид в новом генетическом окружении.

Изобретение относится к области микробиологии и биотехнологии и может быть использовано в химической промышленности. Получен штамм Klebsiella pneumoniae ВКПМ В-7001, который содержит конъюгативную плазмиду рВК1, детерминирующую устойчивость данного сообщества микроорганизмов к соединениям мышьяка. Использование предложенного штамма позволяет получить штаммы бактерий-биодеструкторов соединений, содержащих мышьяк.

Штамм Klebsiella pneumoniae ВКПМ В-7001, содержащий конъюгативную плазмиду рВК1, донор генов ars-оперона, для создания штаммов бактерий-деструкторов мышьяксодержащих соединений.