Способ выявления из естественных сред перспективных пробиотических штаммов Российский патент 2022 года по МПК C12N1/20 A61K35/74 

Изобретение относится к микробиологии, а именно к способам выявления и селекции штаммов микроорганизмов, и может быть использовано для получения новых видов пробиотических препаратов.

Пробиотики - живые микроорганизмы, приносящие пользу организму хозяина при введении в адекватных количествах. Основными функциями пробиотиков являются: поддержка колонизационной резистентности, метаболизм пищевых субстратов и утилизация конечных метаболитов, продукция субстратов, необходимых для макроорганизма, а также регуляция местного и адаптивного иммунного ответа.

К пробиотикам, в частности, относятся бактерии родов Lactobacillus, Bifidobacterium, Enterococcus, Pediococcus, Lactococcus, Streptococcus, Bacillus, Escherichia и грибы рода Saccharomyces.

В основе колонизационной резистентности лежит способность пробиотических штаммов предотвращать колонизацию желудочно-кишечного тракта условно-патогенными и патогенными микроорганизмами вследствие конкуренции за питательные вещества, а также путём синтеза ряда антибактериальных метаболитов, активных в отношении патогенных бактерий. Пробиотики метаболизируют компоненты пищи и некоторые другие субстанции, за счет наличия специфических ферментов, отсутствующих у организма-хозяина.

Пробиотические штаммы осуществляют синтез большого числа важнейших метаболитов, которые участвуют в поддержании гомеостаза макроорганизма. К таким метаболитам относятся короткоцепочечные жирные кислоты, поддерживающие регуляцию энергетического гомеостаза, а также служащие сигнальными молекулами для клеток иммунной системы, определяя их дифференцировку и противовоспалительную активность. Пробиотические микроорганизмы продуцируют медиаторы – допамин, норадреналин, серотонин, гамма-аминомасляную кислоту и гистамин. Кроме того, пробиотики синтезируют незаменимые для макроорганизма метаболиты: триптофан и витамины группы В.

Метаболиты пробиотических бактерий взаимодействуют с иммунокомпетентными клетками и участвуют в регуляции местного и системного иммунного ответа.

Для расширения спектра пробиотических микроорганизмов, для поиска новых, эффективных штаммов, способных оказать значительное положительное влияние на организм хозяина, необходимы способы и методы, позволяющие выделить и идентифицировать микроорганизмы, обладающие необходимыми свойствами и отвечающие требованиям, предъявляемым к пробиотическим препаратам.

Известны способы решающие аналогичные задачи в иных направлениях. Так в (патенте RU 2624667C1, B09C1/10, опуб. 05.07.2017) «Способ выделения микроорганизмов для очистки и восстановления нефтезагрязненных почв и грунтов методом фитобиоремедиации» описан способ выделения штаммов микроорганизмов-деструкторов нефти, включающий стадии селекции и выделения чистой культуры, оценки выделенных штаммов. Известно изобретение (по патенту RU 2241745 С2, C12N1/26, B09C1/10, опубл. 10.12.2004) «Способ выделения деструкторов нефти и нефтепродуктов». Сущностью является способ выделения деструкторов нефти и нефтепродуктов, включающий отбор проб с нефтезагрязненной поверхности, селекцию углеводородокисляющих бактерий с последующим пересевом полученных культур и дальнейшую наработку в отдельности всех отселектированных микроорганизмов в ферментерах при параметрах культивирования, оптимальных для выделенных микроорганизмов, отличающийся тем, что селекцию начинают на жидкой минеральной среде с добавлением нефти с места загрязнения, инкубирование ведут при различных температурах +5°С, +15°С, +25°С и +35°С, а отбор культур для пересева осуществляют через 5, 10 и 15 дней. Известен способ выделения и активации консорциума аборигенных микроорганизмов-деструкторов нефти и нефтепродуктов (RU 2352630 C1, C121/10,C12N1/26, опубл. 20.04.2009), отличающийся тем, что после выделения проводят активацию микроорганизмов с помощью стимуляторов. Известен способ (патент RU 2133775 С1, C12Q1/04,C12N1/04, опубл. 27.07.1999) выделения штаммов-деструкторов, обладающих полисубстратной специфичностью, техническим результатом которого является возможность отбора наиболее ценных штаммов микроорганизмов. Известны способы получения аутопробиотиков, из фекальных масс организма-хозяина (патент RU 2580002 С1, C12N1/20, A61K35/74, C12R1/07, опубл. 10.04.2016) «Способ получения аутопробиотика, содержащего живые бифидобактерии и лактобактерии» и (патент RU 2139070 С1, A61K35/74, C12N1/20, опубл. 10.10.1999) «Способ получения аутопробиотика, содержащего живые бифидобактерии и лактобациллы». Сущность данных способов заключается в выделении и накоплении пробиотически активных штаммов из фекалий.

Однако данные способы не позволяют получить новые штаммы, отсутствующие у данного хозяина, и провести оценку выделенных микроорганизмов по важным признакам и свойствам, обуславливающим их пробиотическое действие.

В целях достижения заявленного результата была разработана методика отбора и селекции пробиотических микроорганизмов, за счет того, что включает их скрининг на ДНК-протекторную и антиоксидантную активность, и позволяющая выявлять наиболее перспективные штаммы, потенциально обладающие значительным потенциалом системных положительных эффектов в организме хозяина.

Сущность изобретения заключается в том, что способ выявления из естественных сред перспективных пробиотических штаммов, включающий отбор проб с субстратов, выделение и очистку штаммов микроорганизмов, при этом после выделения проводят исследование безопасности и свойств микроорганизмов, обусловливающих их потенциальное пробиотическое действие;

- проверяются антиоксидантные свойства микроорганизмов, и отбираются штаммы обладающие антиоксидантной активностью выше 40%;

- проверяются ДНК-протекторные свойства микроорганизмов, и отбираются штаммы обладающие ДНК-протекторной активностью выше 40%.

Технический результат заключается в поиске новых, эффективных штаммов, способных оказать значительное положительное влияние на организм хозяина, и позволяет выделить и идентифицировать микроорганизмы, обладающие необходимыми свойствами и отвечающие требованиям, предъявляемым к пробиотическим препаратам, а также проводить более эффективный скрининг за счет учета прогностически информативных параметров выработки низкомолекулярных метаболитов, обеспечивающих пробиотические свойства анализируемых штаммов.

Сущность способа состоит в следующем:

Проводится сбор материала, включая помет, содержимое слепой кишки, образцы подстилки.

Полученные образцы высеваются на твёрдых питательных средах и очищаются до отдельных штаммов методом истощающего штриха. Для чего пробы тщательно перемешиваются, затем из каждой отбирается две навески по 10 г. Для выделения Lactobacillus используют среду MRS (ЛенРеактив) с добавлением сорбиновой кислоты. Молочнокислые бактерии инкубируют в анаэробных условиях, при следующем составе газовой среды: 95% N2, 4% СО2, 1% О2.

Выделенные штаммы проверяются на безопасность, на отсутствие гемолитической активности, чувствительность к антибиотикам, и мутагенность. Для определения гемолитической активности штаммы высевают на кровяной агар и инкубируют при температуре 42°С в течение 48 часов. Гемолитическую активность оценивают по наличию и ширине зоны лизиса.

Для определения чувствительности к антибиотикам штаммы засевают газоном на соответствующие твёрдые питательные среды. Далее на них же помещают стандартные диски с антибиотиками: амоксициллином, ципрофлоксацином, цефтриаксоном, азитромицином, карбопенемом, эритромицином, тетрациклином, гентамицином, по 4 диска на одну чашку в 2х повторностях. Штаммы инкубируют при 42°С в анаэробных условиях, результат учитывают через 48 часов.

У штаммов, прошедших тесты на антибиотико-чувствительность и гемолитическую активность, исследуют антиоксидантные и генопротекторные свойства с помощью lux-биосенсоров. В качестве биосенсоров применяли рекомбинантные штаммы E.coli MG1655 (pKatG-lux) и MG1655 (pRecA-lux), содержащие плазмиды с опероном luxCDABE фотобактерии Photorhabdus luminescens, поставленным под контроль соответствующих промоторов Е. coli. Данный оперон содержит гены люциферазы и их регуляторы и обеспечивает биолюминесценцию, используемую в данном тесте в качестве репортерной функции. Биосенсоры с плазмидой pKatG реагируют на наличие в среде окислителей, в частности, перекиси водорода. Биосенсоры с плазмидой pRecA реагируют на наличие в клетке факторов, вызывающих повреждение ДНК.

Культивирование бактерий в жидкой питательной среде проводили при 37ºС до ранней или средней логарифмической фазы. Ночную культуру разбавляли свежей средой до плотности 0,01 - 0,1 единица Мак-Фарланда (концентрация 3⋅107 - 3⋅106 клеток/мл). Измерения плотности проводились при помощи денситометра DEN-1B («Biosan»). Затем суспензию подращивали до ранней логарифмической фазы. Аликвоты этой культуры (по 90 мкл) переносили в стерильные ячейки (находящиеся в стрипах планшета) и добавляли в них по 10 мкл тестируемого препарата (кроме контрольных ячеек). В контрольные ячейки добавляли 10 мкл деионизированной воды.

После обработки планшет с пробами помещали в люминометр, при температуре 30°С и измеряли изменения интенсивности биолюминесценции.

Фактор индукции SOS ответа/окислительного стресса/повреждения ДНК (I^s) вычисляют по формуле:

(1) ,

где: L_k – интенсивность люминесценции контрольной пробы (в условных единицах);

L_e– интенсивность люминесценции опытной пробы (в условных единицах).

Признаком статистической значимости эффекта SOS-индукции считали статистически значимое превышение L_e над L_k, оцениваемое по t-критерию.

Показатель протекторной активности (А, %) вычисляют по формуле:

(2)

где: I_a – фактор индукции SOS-ответа исследуемым воздействием в присутствии ингибитора.

I_p- фактор индукции SOS-ответа ципрофлоксацином.

Среднее квадратичное отклонение факторов индукции S вычисляют по формуле:

(3)

где индексы e и k относятся к опыту и контролю, соответственно.

Штаммы проявившие генопротекторные и антиоксидантные свойства отбирают для дальнейшей работы, и исследуют на пригодность к использованию в производственных целях. Определяют скорость роста, устойчивость к температурам и рН, скорость утилизации субстрата. Скорость роста оценивают по времени появления мутности суспензии клеток 0,5 по Макфаланду.

Проводя селекцию наиболее перспективных штаммов, безопасных и обладающих наиболее выраженной антиоксидантной и антимутагенной активностью, а так же высокой скоростью роста и утилизацией субстрата, получают штаммы максимально подходящие для производства пробиотических препаратов.

Пример 1

Проведен отбор подстилки и помета у следующих групп птиц:

1. яичный кросс Хайсекс-браун, клеточное содержание, корм: стандартная кормосмесь; ЗАО «Птицефабрика Гуляй-Борисовская», х. Гуляй-Борисовка Зерноградского района РО;

2. яичный кросс Хайсекс-браун, клеточное содержание, корм: стандартная кормосмесь; ОАО «Птицефабрика Белокалитвинская», п. Сосны Белокалитвинского района РО;

3. бройлеры напольного содержания, кросс Кобб, корм: полнорационный комбикорм; птицефабрика «Донецкий бройлер» (ИП Строителев О.Н.), г. Донецк, РО;

4. бройлеры клеточного содержания, кросс Кобб, корм: полнорационный комбикорм; учхоз ДГТУ, РО;

5. яичный кросс Хайсекс-браун, свободновыгульное содержание, корм: комбикорм ПК-1-2; личное подсобное хозяйство, п. Персиановский Октябрьского района РО;

6. яичная порода полосато-пестрый леггорн, свободновыгульное содержание, корм: полнорационный комбикорм с добавками в виде овощей до 20% рациона, личное подсобное хозяйство, с. Раздольное, Краснодарский край;

7. яичный кросс Хайсекс-браун, свободновыгульное содержание, корм: комбикорм «Мегамикс» с добавками в виде овощей до 10% рациона; личное подсобное хозяйство, г. Ростов-на-Дону.

Все группы не получали каких-либо пре- или пробиотических добавок ни в виде корма, ни в виде препаратов для подстилки. Также все группы не получали антибиотиков минимум за полгода до начала исследований.

Для отбора выбирали свежий помёт, полученный от нескольких, не менее 5-6 здоровых птиц. Отобранный помёт в количестве 30-40 г. помещали в стерильные пластиковые контейнеры. Все пробы охлаждали до температуры +4°С и в течение 24 часов доставляли в лабораторию. В процессе транспортировки обеспечивали поддержание температурного режима +4 - +8°С.

Из проб было отобрано 38 штаммов молочнокислых бактерий, которые представлены в Таблице 1.

Определение видовой принадлежности штаммов было проведено методом MALDI-TOF масс-спектрометрии. Исследование проводили на приборе Microflex LT instrument (Bruker Daltonics GmbH, Leipzig, Германия) с использованием программного обеспечения Biotyper (version 3.0) (Bruker Daltonics GmbH, Leipzig, Германия).

Таблица 1.

Отобранные штаммы молочнокислых бактерий, их источник и КОЕ/г лактобактерий в источнике.

Источник Количество Lactobacillus, КОЕ/г Выделенные штаммы клеточное содержание, бройлеры, птицефабрика «Донецкий бройлер» 8,0±0,5·108 L. johnsonii KL18 свободновыгульное содержание, личное хозяйство, с. Раздольное 4,0±0,5·108 L. johnsonii KL20, KL21 L. gasseri KL22, L. salivarius KL23, KL24, L. johnsonii KL25, L. johnsonii KL26, L. salivarius KL27, L. johnsonii KL28, L. reuteri KL29 клеточное содержание, несушки, ЗАО «Птицефабрика Гуляй-Борисовская», х. Гуляй-Борисовка Зерноградского района РО 3,1±0,1·108 L. frumenti KL31, KL32, L. reuteri KL33, L. gasseri KL34, L. johnsonii KL36, L. salivarius KL37, L. frumenti KL39 клеточное содержание, несушки, ОАО «Птицефабрика Белокалитвинская», п. Сосны Белокалитвинского района РО 5,1±0,4·106 L. crispatus KL41 напольное содержание, бройлеры, учхоз ДГТУ, РО 1,2±0,2·109 L. salivarius KL61, L. crispatus KL62, L. johnsonii KL63, L. crispatus KL64, L. salivarius KL65, L. crispatus KL66, L. coryniformis KL67 личное подсобное хозяйство, п. Персиановский Октябрьского района РО 4,4±1,2·108 L. crispatus KL71, L. crispatus KL72, L. kitasatonis KL73, L. curvatus KL74, L. reuteri KL75, L. reuteri KL76, L. kitasatonis KL77, свободновыгульное содержание (РнД), личное подсобное хозяйство, г. Ростов-на-Дону 1,1±0,04·109 L. reuteri KL81, L. crispatus KL82, L. reuteri KL83, L. coryniformis KL84, L. frumenti KL85, L. frumenti KL86, L. crispatus KL87

Все выделенные штаммы проверили на безопасность по следующим параметрам: гемолитическая активность, антибиотикорезистентность, мутагенность. Анализ гемолитической активности при посеве на кровяной агар показал, что из 38 штаммов ни один не обладает такой активностью.

Исследование устойчивость к антибиотикам выявило устойчивость у четырех штаммов молочнокислых бактерий. Штаммы KL21 и KL24 оказались нечувствительны амоксициллину (отсутствие зоны подавления роста), KL32 продемонстрировал слабую чувствительность к эритромицину (зона отсутствия роста 1 мм), KL87 – отсутствие чувствительности к эритромицину (отсутствие зоны подавления роста). Все четыре штамма исключаются из дальнейших исследований.

Тест на повреждение ДНК с биосенсором pRecA показал отсутствие мутагенной активности у всех выделенных штаммов.

Безопасные штаммы были проанализированы на наличие антиоксидантных и ДНК-протекторных свойств в тестах с биосенсорами. Результаты исследования отображены на фиг. 1 и фиг. 2.

В качестве пробиотических рассматриваются штаммы, обладающие одновременно выраженной ДНК-протекторной и антиоксидантной активностью. В общей сложности отобрано 11 штаммов, удовлетворяющих следующим критериям: антиоксидантная активность выше 40%, ДНК-протекторная активность также выше 40%. По совокупности антиоксидантных и ДНК-протекторных свойств для применения в качестве пробиотиков были выбраны следующие штаммы:

Таблица 2

№ штамма Видовое название Источник KB16 Bacillus subtilis напольное содержание, бройлеры, «Донецкий бройлер», помёт KB18 Bacillus amyloliquefaciens напольное содержание, бройлеры, «Донецкий бройлер», помёт KB41 Bacillus subtilis клеточное содержание, несушки, ЗАО «Птицефабрика Гуляй-Борисовская», помёт KB44 Bacillus amyloliquefaciens клеточное содержание, несушки, ЗАО «Птицефабрика Гуляй-Борисовская», помёт KB54 Bacillus amyloliquefaciens свободновыгульное содержание л/х г. Ростов-на-Дону, помёт KL31 Limosilactobacillus frumenti клеточное содержание, несушки, ЗАО «Птицефабрика Гуляй-Борисовская», помёт KL61 Ligilactobacillus salivarius клеточное содержание, бройлеры, учхоз ДГТУ, помёт KL62 Lactobacillus crispatus клеточное содержание, бройлеры, учхоз ДГТУ, помёт KL73 Lactobacillus kitasatonis свободновыгульное содержание, л/х п. Персиановский, помёт KL82 Lactobacillus crispatus свободновыгульное содержание, л/х г. Ростов-на-Дону, помёт

Антиоксидантная активность выделенных штаммов в целом была выше, чем ДНК-протекторная. Известно, что многие штаммы Lactobacillus обладают высокой антиоксидантной активностью за счёт ферментативных систем замещающих каталазу, способности выделять вторичные метаболиты-антиоксиданты, связывать ионы металлов и т.д. (Wang, 2017). Из 36 исследованных штаммов 21 штамм имел антиоксидантную активность более 60%, из них 16 – более 80%. Для сравнения: антиоксидантная активность α-токоферола в концентрации 0,43 мг/мл (10^-3 М) составляет 36,8%.

ДНК-протекторная активность выделенных штаммов сильно разнилась между собой. Так, 12 исследуемых штаммов вообще не имели выраженной ДНК-протекторной активности, 7 – имели слабую активность - менее 20%. С другой стороны, 4 штамма имели очень высокую ДНК-протекторную активность (более 80%). Всё это свидетельствует о том, что представители рода Lactobacillus имеют широкий диапазон свойств, и что первичный скрининг активности клеток по целевым параметрам являются обязательным.

В процессе подбора штаммов-пробиотиков необходимо учитывать также их потенциальные промышленные свойства, в том числе скорость роста и наработки биомассы. 11 безопасных и обладающих пробиотической активностью штаммов были протестированы на скорость роста по времени появления мутности суспензии клеток 0,5 по Макфаланду. Данные представлены в табл. 3.

Таблица 3.

Время достижения суспензией лактобактерий мутности 0,5 по Макфарланду.

Штамм Время, часы L. frumenti KL31 24 L. salivarius KL61 24 L. crispatus KL62 24 L. johnsonii KL63 48 L. crispatus KL64 60 L. coryniformis KL67 72 L. crispatus KL72 48 L. kitasatonis KL73 24 L. kitasatonis KL77 36 L. crispatus KL82 24 L. reuteri KL83 72

По совокупности свойств штаммов наиболее перспективными для дальнейших исследований и коммерческого использования признаны штаммы L. frumenti KL31, L. salivarius KL61, L. crispatus KL62, L. kitasatonis KL73, L. crispatus KL82.

Изобретение относится к биотехнологии и микробиологии. Предложен способ выявления из естественных сред перспективных пробиотических штаммов, включающий проверку антиоксидантных и ДНК-протекторных свойств выделенных штаммов микроорганизмов, из которых отбираются штаммы, обладающие антиоксидантной и ДНК-протекторной активностью выше 40%. Изобретение обеспечивает расширение арсенала способов выявления микроорганизмов, пригодных для применения в качестве пробиотиков. 2 ил., 3 табл., 1 пр.

Способ выявления из естественных сред перспективных пробиотических штаммов, включающий отбор проб с субстратов, выделение и очистку штаммов микроорганизмов, отличающийся тем, что вначале проверяются антиоксидантные свойства и ДНК-протекторные свойства микроорганизмов, а затем отбираются штаммы, обладающие антиоксидантной активностью и ДНК-протекторной активностью выше 40%.