СПОСОБ СКРИНИНГА ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ Российский патент 2000 года по МПК G01N33/15 

Изобретение относится к медицине, а именно к способам скрининга лекарственных препаратов для подбора препарата и его оптимальной дозы для лечения конкретного больного.

В настоящее время традиционный подбор препарата для конкретного больного включает в себя клиническое обследование больного, сопоставление данных обследования с рекомендациями фармации, назначение препарата или группы препаратов и коррекцию назначения по результатам воздействия препарата на организм (Методы экспериментальной химиотерапии (Практическое руководство)/Под ред. Першина Г.Н.- М., 1971, c. 234).

Недостатком такого подхода является длительность и ненадежность подбора, высокая вероятность осложнений.

Известен метод скрининга лекарственных препаратов для конкретного пациента, включающий в себя помещение рук оператора над больным и тестируемыми веществами и тестирование оптимального препарата исходя из температурной реакции оператора (пат. РФ N 2007117, кл. А 61 В 5/04, 1992).

Недостатком метода является определенная субъективность и недостаточная надежность результатов.

Известны методы скрининга лекарственных препаратов для лечения отдельных патологий - заболеваний ЦНС, вирусных, онкологических и иных заболеваний (пат. и авт. свид. РФ N 1806601, кл. А 61 В 5/0476, 1990; N 1540804, кл. A 61 B 10/00, 1987; N 2000739, кл. А 61 В 5/02, 1991; N 2046341, кл. G 01 N 33/48, 1994). В основе методов лежит введение тестируемых препаратов в организм или в контакт с препаратами тканей или жидкостей организма, выявление значимых характеристик, измерение параметров этих характеристик для каждого тестируемого препарата и выбор в качестве оптимального препарата средства, оказывающего максимальное воздействие на выбранные характеристики.

Недостатком методов является ограниченная область применения, что наиболее негативно сказывается в случае необходимости проведения комплексной терапии.

Прототипом заявляемого изобретения является способ скрининга противовирусных препаратов для конкретного индивидуума, включающий в себя отбор пробы крови больного, выделение из нее взвеси лейкоцитов, культивирование их с исследуемыми препаратами, фиксацию формалином моноцитов, их прокрашивание, определение клеток с вирусными включениями и выбор в качестве целевого препарата из исследуемых средств, обеспечивающего наибольшее снижение определяемых параметров (авт. свид. СССР N 1266029, кл. А 61 В 10/00, G 01 N 33/15, 1985).

Недостатком способа является узкий спектр применения, длительность анализа (около 2 суток).

Задачей, решаемой изобретением, является создание более быстрого и универсального способа скрининга лекарственных препаратов.

Указанная задача решается путем культивирования пробы цельной гепаринизированной крови больного с водными растворами тестируемых препаратов в разных дозах, определения соотношения -SH и -SS-групп в клеточной фракции крови больного после культивирования и выбор в качестве оптимального препарата или оптимальной дозы препарата, обеспечивающего указанное соотношение, наиболее близкое к 3,0.

Культивирование крови проводят, как правило, в течениe 1 ч при температуре, близкой к 37^oC, причем введение тестируемого препарата в кровь осуществляют в дозе, соответствующей 1:5000 от терапевтической.

В основу способа была положена гипотеза о том, что серусодержащие компоненты крови являются наиболее чувствительными к воздействию на организм факторов различной этиологии, связанных с заболеваниями организма, и, следовательно, препараты, способные их нормализовать, являются наиболее эффективными для лечения.

Основными отличиями заявляемого метода от прототипа является использованиe для культивирования цельной крови, определение нового параметра - соотношения -SH и -SS-групп в клеточной фракции крови и определение оптимального параметра состояния - соотношения параметров близкого к 3,0.

Способ осуществляется следующим образом.

К 1 мл цельной гепаринизированной крови, взятой из периферической вены, добавляют тестируемые препараты в необходимых дозах (дозировка in vitro рассчитывается исходя из 1:5000 от терапевтической), в контрольную пробирку добавляется растворитель, смеси инкубируют 1 ч при температуре около 37^oC. Возможно продление срока культивирования до 2 ч, позволяющее несколько повысить точность метода, однако этот прием целесообразно использовать только при близости результатов тестирования разных препаратов или при слабом воздействии препаратов на соотношение -SH и -SS-групп.

Количество -SH, -SS-групп и их соотношение в клеточной фракции крови определяют в основном методами прямого (-SH) и обратного (-SS) амперометрического титрования.

При прямом амперометрическом титровании кровь из вены (10 мл) вносят в пробирку, содержащую антикоагулянт (1-2 капли гепарина, 1 мл которого содержит 5000 ME). Затем кровь разливают по 1 мл в необходимое количество пробирок (обычно 7-9), которое зависит от количества тестируемых препаратов и их доз. В каждую пробирку добавляют тестируемые препараты в необходимых дозах (дозировка in vitro рассчитывается исходя из 1:5000 от терапевтической), в контрольную пробирку добавляется растворитель, смеси инкубируют в термостате 1 ч при t = 37^oC. После инкубации пробирки центрифугируют 5-7 мин при 800 об/мин, после чего плазму удаляют. Затем клеточную фракцию крови гемолизируют в 0,1%-ном растворе Трилона "Б" (pH = 7,0): 1 часть клеток крови и 19 частей раствора смешивают, помещают в холодильник (4-5^oC) и через 30 мин центрифугируют для осаждения разрушенных клеток в течение 15 мин при 6000 об/мин. Надосадочную жидкость (гемолизат) используют в работе. В сосуд для титрования (бюкс, стеклянная чашка на 30-40 мл) вносят 25-30 мл аммиачного буфера. Помещают сосуд на магнитную мешалку, погружают в исследуемый раствор платиновый электрод и свободный конец солевого мостика, включают в сеть микроамперметр, опускают в центр сосуда капсулу с магнитом и начинают ее вращение со скоростью, исключающей разбрызгивание раствора. Дозатором отмеривают в сосуд 0,2 мл гемолизата. После того как стрелка микроамперметра примет стабильное положение начинают титрование, добавляя по 0,05 (0,1) мл 1•10^-3 М раствора AgNO₃. После каждой очередной порции ждут, чтобы стрелка остановилась, отмечают соответствующее ее положению число делений шкалы и продолжают титрование. По достижении конечной его точки первая же очередная порция титранта вызывает заметный скачок силы тока и отклонение стрелки на большую, нежели прежде, величину. Сделав после этого еще 4-5 измерений, титрование прекращают, и по его результатам графическим способом находят количество нитрата серебра, затраченного на титрование раствора, на базе чего рассчитывают содержание SH-групп.

При обратном амперометрическом титровании в сосуд для титрования наливают 25 мл аммиачного буфера, ставят его на поверхность магнитной мешалки, погружают в раствор индикаторный электрод и конец солевого мостика от электрода сравнения, включают в сеть микроамперметр и магнитную мешалку, пускают ее, и при непрерывном перемешивании последовательно вносят в буферную смесь следующие реагенты: 0,5 мл 1•10^-3 М раствора AgNO₃; 0,2 мл гемолизата; 200 мг сульфита натрия.

Включают микроамперметр и, после того как стрелка примет стабильное положение (примерно через 3-5 мин), начинают титровать исследуемую пробу 5•10^-4 М раствором унитиола, добавляя его в реакционную смесь по 0,05 мл (или по 0,1 мл) до конечного объема 0,5 мл. По завершении титрования количество унитиола, затраченного на титрование пробы, определяют графическим способом, а затем на основе этой величины рассчитывают количество SS-групп, после чего рассчитывают отношение концентрации SH-групп к концентрации SS-групп.

Как правило, указанные методы совмещают между собой. После определения содержания SH-групп вышеописанным методом прямого титрования, не прерывая перемешивания раствора, вносят в сосуд для титрования сульфит натрия и обратным титрованием с помощью эквимолярного раствора унитиола определяют в той же пробе содержание SS-групп. При этом избыточный раствор серебрa для обратного титрования вносят в реакционную смесь не однократно, а отдельными порциями в процессе прямого титрования.

Возможность применения заявляемого способа скрининга препаратов для лечения заболеваний различной этиологии демонстрируется следующими примерами.

Пример 1. Больная Б-я Э.В. с диагнозом: рак поперечно-ободочной кишки, T₃N₀M₀, выполнена радикальная операция - резекция поперечно-ободочной кишки. Было проведено исследование влияние разных доз противоопухолевого и иммуномодулирующего препарата украин ("Nowicky Pharma", Австрия), антигипоксанта олифена (OOO "Корпорация Олифен") на состояние тиолдисульфидного равновесия крови, результаты которого представлены в таблице.

Оптимальным препаратом, по нашим оценкам, являлся украин в дозе 5,0 мг на введение (при добавлении украина в этой дозе -SH/-SS-коэффициент повысился с 2,00 до 3,00). Больной был проведен 1 курс лечения украином до операции и 2 - после оперативного лечения с использование украина в дозе 5,0 мг на введение через день (10 введений на 1 курс). При гистологическом исследовании удаленной опухоли: железистый рак с ослизнением в просвете желез, некрозами, воспалительным инфильтратом в строме. До настоящего времени в течение трех лет сохраняются полная ремиссия заболевания и нормальные показатели содержания раково-эмбрионального антигена (РЭА) в сыворотке крови (27.12.96 - 1,2 нг/мл, 10.04.97 - 1,1 нг/мл, при норме до 5 нг/мл).

Пример 2. Больная Г-ва Н.В. с диагнозом: рак поперечно-ободочной кишки, T₄N₂M₁, была проведена резекция опухоли по поводу кишечной непроходимости, в ходе операции выявлен канцероматоз брюшины.

Проводилось изучение влияния украина и реаферона (НПО "Вектор", Новосибирская обл.) на состояние тиолдисульфидного равновесия крови (таблица).

Оптимальным препаратом, по нашим данным, являлся украин в дозе 10,0 мг на введение (при добавлении украина в этой дозе -SH/-SS-коэффициент повысился с 1,17 до 1,75). Проведен курс лечения в дозе 10,0 мг украина внутривенно через день (10 инъекций). После первой же инъекции была отмечена характерная реакция на введение препарата, свидетельствующая об эффективности терапии: повышение температуры тела до 37,9^oC, потливость, По мере продолжения терапии реакция ослабевала и к концу курса лечения стала минимальной. Субъективно было отмечено значительное улучшение самочувствия больной, а при лабораторных исследованиях - нормализация содержания РЭА в сыворотке крови (9.12.96 - 1,7 нг/мл, а 27.12.96 - 1,3 нг/мл). В дальнейшем больной было проведено еще 2 курса лечения украином, при этом была отмечена стабилизация опухолевого процесса в течение 8 месяцев.

Пример 3. Больная Л-н Б. А. с диагнозом: рак левой молочной железы, T₃N₂M₁, с метастазами в позвоночник (Th₁₂, L_1-2), состояние после мастэктомии. Получила курс лучевой терапии на позвоночник, 4 курса химиотерапии, бонефос.

При исследовании влияния украина и олифена на тиолдисульфидное равновесие крови (таблица) отмечено, что у данной больной на всех дозах препаратов отмечались низкие показатели коэффициента -SH/-SS-, оптимальным препаратом был украин в дозе 5,0 мг на введение (при добавлении украина в этой дозе -SH/-SS-коэффициент повысился с 1,00 до 1,67). Однако в соответствии с общепринятыми правилами в данном случае было проведено лечение украином в дозе 10 мг на введение внутривенно через день (10 инъекций). После курса терапии состояние больной существенно не улучшилось, сохранялся болевой синдром, содержание онкомаркера СА 15-3 несколько повысилось (14.01.97 - 38,3 ЕД/мл, 04.02.97 - 42,6 ЕД/мл, при норме до 26,9 ЕД/мл), а в дальнейшем заболевание продолжало быстро прогрессировать.

Пример 4. Больная А-ва Ш.О., 59 лет, с диагнозом: рак пищевода, T₂N_xM₀, проведена лучевая терапия.

При исследовании влияния украина и циклоферона (индуктор интерферона, НТФФ "Полисан") на состояние тиолдисульфидного равновесия установлено, что оптимальный эффект давал украин в дозе 5,0 мг (при добавлении украина в этой дозе -SH/-SS-коэффициент повысился с 0,93 до 2,50). Проведено 2 курса лечения украином в дозе 5,0 мг через день (10 инъекций). Перед первым и вторым курсами терапии содержание онкомаркеров было в норме, при этом после проведения второго курса терапии украином отмечено снижение содержания СА 19-9 (24.01.97 содержание РЭА - 0,53 нг/мл, СА 19.9 - 5,0 ЕД/мл; 30.12.98 содержание РЭА - 0,80 нг/мл, СА 19-9 - 23,9 ЕД/мл; 27.01.99 СА 19-9 - 18,1 ЕД/мл при норме до 37 ЕД/мл). До настоящего времени в течение трех лет у больной отмечается стабилизация процесса, по данным фиброгастродуоденоскопии (22.12.98) - язва нижней трети пищевода (язвенный дефект 0,3х0,5 см под фибрином), эрозивный эзофагит; при УЗИ брюшной полости данных о генерализации процесса не получено.

Пример 5. Больная Д-ва С.В. с диагнозом: неходжкинская лимфома желудка (пролимфоцитарная), T₃N₂M₀, проведена субтотальная резекция желудка по Бильрот-2. При гистологическом исследовании удаленной опухоли - пролимфоцитарная лимфома, в лимфоузлах большой и малой кривизны желудка аналогичная гистологическая картина. При исследовании влияния украина и олифена на тиолдисульфидное равновесие крови (таблица) отмечено, что у данной больной оптимальным препаратом был олифен в дозе 0,5 г на введение (при добавлении олифена в этой дозе -SH/-SS-коэффициент повысился с 2,00 до 3,12). Проведено 3 курса лечения олифеном по 1 таблетке (0,5 г) 3 раза в день в течениe 1,5 месяцев с прорывами 2-3 месяца. В течение 5 лет у больной сохранялась полная клинико-гематологическая ремиссия заболевания.

Пример 6. Больной К-н А.В. с диагнозом: хронический вирусный гепатит В без дельта-агента (вируса).

При исследовании влияния реаферона и циклоферона на тиолдисульфидное равновесие крови (таблица) отмечено, что у данного больного оптимальным препаратом был реаферон в дозе 1 млн.МЕ на введение (при добавлении реаферона в этой дозе -SH/-SS-коэффициент повысился с 1,52 до 3,07). Проведен курс лечения реафероном по 1 млн.МЕ внутримышечно через каждые 3 дня в течение 6 месяцев. В результате проведенной терапии произошла нормализация активности АлАТ и АсАТ, реверсия ДНК HBV, HBeAg и HBsAg, сохраняется стабильная ремиссия в течение 8 месяцев.

Пример 7. Больная П-ва Г.А. с диагнозом: ревматоидный полиартрит с поражением плечевых, локтевых, лучезапястных, пястно-фаланговых и межфаланговых суставов, тазобедренных суставов, суставов голеней и стоп, серонегативный, быстро прогрессирующее течение, 2-я степень активности, функциональная способность больной - 3. При исследовании влияния олифена и циклоферона на тиолдисульфидное соотношение в крови (таблица), оказалось, что для данной больной оптимальным препаратом оказался циклоферон в разовой дозе 0,25 г (при добавлении циклоферона в этой дозе соотношение SH/SS повысилось с 1,24 до 2,56). Проведен курс лечения циклофероном по 2 мл 2%-ного раствора внутримышечно по схеме в 1,2,4,6,8,10,12,14,16,18 и 20-й дни. В результате проведенной терапии уже на 5-й день от начала терапии удалось снизить дозу ибупрофена с 3 (0,6 г) до 2 (0,4 г) таблеток в день, на 10-й день до 1 (0,2 г) таблетки, а к 16-му дню полностью отказаться от приема анальгетиков в связи с уменьшением болевого синдрома значительно повысилась двигательная активность больной; по лабораторным данным СОЭ уменьшилось с 39 до 24 мм/ч, а C-реактивный белок понизился с ++ до +.

Как показали проведенные эксперименты, предлагаемый способ является достаточно универсальным, позволяя тестировать препараты для лечения онкологических, вирусных, аутоиммунных и иных заболеваний. Срок скрининга оптимального препарата и его дозы составляет 2-3 ч.

Изобретение может быть использовано в медицине, а именно в способах скрининга лекарственных препаратов для подбора препарата и его оптимальной дозы для лечения конкретного больного. Выбор лекарственного препарата осуществляют на основе результатов культивирования цельной гепаринизированной крови больного в присутствии водных растворов препаратов сравнения. Культивирование проводят в течение 1 ч при температуре, близкой к 37^oC, причем введение тестируемого препарата в кровь осуществляют в дозе, соответствующей 1: 5000 от терапевтической. Анализируют соотношение -SH и -SS-групп в клеточной фракции крови больного после культивирования и в качестве искомого выбирают препарат с наибольшим соотношением -SH и -SS-групп в клеточной фракции у конкретного больного. Способ позволяет снизить время скрининга до нескольких часов, он применим для лечения вирусных, онкологических, аутоиммунных и иных заболеваний. 1 з.п. ф-лы, 1 табл.

1. Способ скрининга лекарственных препаратов для конкретного больного, включающий в себя культивирование компонентов крови больного с тестируемыми препаратами, анализ компонентов крови после культивирования и выбор оптимального препарата, отличающийся тем, что культивируют препарат цельной гепаринизированной крови больного, введение тестируемого препарата в кровь осуществляют в дозе, соответствующей 1 : 5000 от терапевтической, и в качестве искомой выбирают препарат с наибольшим соотношением -SH и -SS-групп в клеточной фракции у конкретного больного. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что культивирование проводят в течение 1 ч при 37^oC.