СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВОЗДЕЙСТВИЯ НА ОРГАНИЗМ ПИЩЕВОГО ПРОДУКТА Российский патент 2005 года по МПК G01N33/50 

Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологии, аллергологии, диетологии, и может применяться для диагностики аллергических заболеваний, непереносимости или полезности пищевых продуктов для любого живого организма (человека или животных).

Известен способ диагностики аллергии реакциями нейтрофилов крови (В.А.Фрадкин, 1985), основанный на показателе повреждения нейтрофилов.

Известен также способ диагностики пищевой аллергии двойным слепым провокационным тестом с использованием плацебо - ДСПТИП (Bock S.A. et al. Double-blind, placebo-controlled food challenge (DBPCFC) as an office procedure: a manual //J.Allergy Clin. Immunol. - 1988. - Vol.82. - P.986), который заключается в постановке теста на подозрительный в отношении аллергии пищевой продукт при употреблении небольшого его количества испытуемым человеком повторно в возрастающих дозах (начиная от дозы 125-500 мг с последующим удвоением дозы через каждые 15-60 минут) и определении реакции организма. Если дозу продукта в 10 г пациент переносит без развития реакции, результат теста считают отрицательным; если при наличии аллергии после употребления конкретного пищевого продукта у человека появляются симптомы заболевания (диспепсия, одышка, тахикардия, гипотония, крапивница, диарея и др.), тест считают положительным.

Недостатком описанных способов является неспецифичность теста с повреждением нейтрофилов крови и отсутствие регламентации для его использования при определении непереносимости пищевых продуктов. Кроме того, тестирование с употреблением подозрительных на аллергию пищевых продуктов in vivo занимает длительный период времени (в день тестируется реакция на один или небольшое число пищевых аллергенов) и может способствовать развитию побочных реакций или осложнений для пациента.

Наиболее близким по сути к заявляемому является способ диагностики аллергических заболеваний (см. патент РФ № 2098826, МПК 6 G 01 N 33/53, 33/48, опубл. 10.12.1997 г.) путем постановки нагрузочного теста с антигеном теофиллином in vitro и одновременного определения показателей крови, по изменению которых проводят диагностику, при этом одновременно с постановкой теста с теофиллином в качестве антигена для определения показателей крови проводят реакцию спонтанного розеткообразования с эритроцитами барана и при количестве розеткообразующих нейтрофилов, равном 1067 в 1 мкл крови и ниже, а теофиллинрезистентных Т-лимфоцитов - 27% и ниже, - диагностируют аллергическое заболевание.

Основным недостатком этого способа является недостаточная информативность для диагностики различных форм аллергических заболеваний, а также существенная неспецифичность метода оценки иммунных нарушений, что сужает область его практического применения. При этом не разработаны условия для диагностики пищевой аллергии и непереносимости пищевых продуктов, не определены условия для объективной оценки возможного полезного влияния тестируемого вещества на организм.

В основу изобретения поставлена задача такого усовершенствования способа диагностики аллергии, пищевой непереносимости и полезности пищевых продуктов, при котором за счет использования в качестве антигена тестируемого вещества и определения в качестве показателей крови тиол-дисульфидного соотношения (ТДС) расширяется область диагностики различных видов аллергии, в том числе и пищевой. Кроме того, появляется возможность диагностики непереносимости пищевых продуктов или их полезного влияния на исследуемый организм. Предлагаемый способ позволяет проводить одновременное тестирование практически неограниченного количества аллергенов in vitro, что является еще и абсолютно безопасным для пациента.

Поставленная задача достигается тем, что в способе определения воздействия на организм пищевого продукта путем постановки нагрузочного теста с антигеном in vitro и одновременного определения показателей крови, по изменению которых проводят диагностику, согласно изобретению в качестве антигена используют тестируемое вещество, а в качестве изменения показателей крови определяют тиол-дисульфидное соотношение (ТДС) по отношению к контрольному измерению, осуществляемому после введения в кровь физиологического раствора, при этом ТДС определяют многократно в течение времени инкубации, достаточного для выявления ранней и/или поздней реакции организма, но не менее чем в течение 24 часов, причем в процессе определения ТДС в кровь повторно вводят тестируемое вещество в интервале времени 0,5 часа, 1 час, 3,0 часа, а каждую последующую дозу тестируемого вещества увеличивают в 2, 4 и 8 раз, соответственно; для определения аллергической реакции или пищевой непереносимости тестируемого вещества оценивают величину уменьшения площади под кривой (AUC - Area Under the Curve) зависимости ТДС от времени инкубации; для определения полезного влияния тестируемого вещества оценивают величину увеличения площади под кривой зависимости ТДС от времени инкубации. Площадь под кривой рассчитывали с использованием метода трапеций (Каркищенко Н.Н., Хоронько В.В., Сергеева С.А., Каркищенко В.Н. Методы вычисления площади под кривой. В кн.: Фармакокинетика. - \Феникс\, Ростов-на-Дону, 2000. - С.154-158).

Причинно-следственная связь между предлагаемой совокупностью признаков и достигаемыми медицинскими результатами состоит в следующем.

Каждый биологический индивидуум имеет неповторимый генотип, который реализуется индивидуальным спектром биохимических и ферментативных реакций, в том числе и для взаимодействия с продуктами питания, пищевыми добавками, лекарственными или иными употребляемыми веществами. В зависимости от возможного результата такого взаимодействия реакция на организм может быть оценена как полезная, вредная или индифферентная. Установить объективные критерии такого влияния на биохимические процессы помогает именно предлагаемый способ, который позволяет оценить воздействие тестируемых экзогенных веществ на характер протекающих окислительно-восстановительных процессов, баланс про-антиоксидантного состояния, а также уровень неспецифической резистентности и адаптационных возможностей организма через оценку состояния тиол-дисульфидного обмена. По своей сути, тиол-дисульфидное соотношение в крови на уровне макроорганизма отражает интегральный биохимический баланс здоровье-болезнь. Вещества, способствующие повышению восстановительных процессов в организме, потенциально могут играть роль полезных для здоровья факторов, а влияющие в обратном направлении, - наоборот, усугублять недостаточность адаптационных механизмов или способствовать ухудшению биохимического и физиологического гомеостаза, а также развитию патологических процессов.

Для выбора диагностических критериев проводили исследования у 37 лиц с аллергическими заболеваниями, а также у 78 пациентов с отсутствием аллергии с использованием комплекса биохимических тестов и методов аллергологической диагностики in vitro. Для выявления аллергии к различным аллергенам (пыльцевым, бытовым, лекарственным, инфекционным, пищевым) применяли скарификационный метод, а также нагрузочный тест с конкретным антигеном в крови in vitro. При постановке нагрузочного теста у пациента производили забор крови из локтевой вены в объеме 15 мл, смешивали ее с 5% раствором цитрата натрия. Затем нитратную кровь инкубировали с различными аллергенами, причем через 30 минут, 1 час и 3 часа после начала инкубации в пробирку с кровью повторно добавляли последовательно увеличенную в 2, 4 и 8 раз, соответственно, дозу конкретного аллергена. Одновременно перед началом инкубации, а затем через 30 минут, 1 час, 3 часа и 24 часа инкубации крови с аллергеном определяли содержание тиоловых (-SH) и дисульфидных (-SS-) групп в лизате цельной крови методом амперометрического титрования с нитратом серебра, после чего вычисляли тиол-дисульфидное соотношение:

([-SH]/[-SS-]=ТДС).

Таким образом, исследовали ТДС в крови в динамике с интервалами в 30 минут, 1 час, 3 часа, 24 часа инкубации при эскалационном повышении вводимой в кровь in vitro дозы тестируемого аллергена, начиная от 1 дозы (исходно), затем - 2 дозы (добавляемых в кровь через 30 минут после инкубации 1 дозы), затем - 4 дозы (добавляемых через 30 минут после 2 доз) и, наконец, добавляли еще 8 доз аллергена (через 2 часа после предыдущего введения 4 доз аллергена); всего за исследование в кровь вводилось 1+2+4+8=15 доз тестируемого аллергена. В контроле вместо аллергена в аналогичные интервалы времени вводился физиологический раствор (отрицательный контроль) или в аналогичном режиме увеличивающиеся дозы гистамина (положительный контроль). После этого строили график зависимости величины ТДС от времени инкубации и сравнивали площади под этой зависимостью по сравнению с контрольными показателями (Δ AUC). Диагностику аллергии или пищевой непереносимости осуществляли на основании уменьшения площади под кривой зависимости \ТДС - время инкубации\ по сравнению с отрицательным контролем. Одновременно учитывали степень такого снижения по сравнению с положительным контролем (т.е. в реакции с гистамином). При максимальном уменьшении площади под кривой вплоть до уровня положительного контроля реакция на антиген расценивалась как проявление аллергии, а при менее выраженном снижении - как пищевая непереносимость. Положительное влияние антигена или пищевого аллергена на окислительно-восстановительный баланс и неспецифическую резистентность оценивали по увеличению площади под кривой зависимости \ТДС - время инкубации\ по сравнению с отрицательным контролем.

Клинико-лабораторные сопоставления выявили, что при аллергическом воздействии у больных наблюдалось уменьшение площади под кривой \ТДС - время инкубации\ по сравнению с отрицательным контролем на 80-140% (Δ AUC в пределах -40%-+20%), и этот показатель приближался к положительному контролю (в реакции с гистамином). При отсутствии аллергии, но с наличием клинических признаков непереносимости пищевых продуктов показатели Δ AUC колебались в пределах 60-30%. Полезное влияние пищевых продуктов расценивалось при показателях Δ AUC не менее 100%. Кроме того, уменьшение Δ AUC в пределах от 99% до 60% не имело существенной отрицательной реакции на организм и было оценено нами как индифферентное.

Выполненные исследования показали (см. таблицу № 3), что у лиц с аллергическими заболеваниями или пищевой непереносимостью наблюдается достоверное снижение площади под кривой зависимости \ТДС - время инкубации\ по сравнению с показателями у людей, у которых отсутствуют такие нарушения. Установлено, что у пациентов с наличием симптомов пищевой непереносимости, не проявляющейся клиническими признаками аллергии (в том числе и при отсутствии положительных скарификационных проб с аллергенами), имела место различная степень уменьшения площади под кривой \ТДС - время инкубации\ по сравнению с отрицательным контролем, однако не достигавшая таковых показателей в положительном контроле. Это отражает, по-видимому, различный характер биохимической реакции крови на тот или иной пищевой продукт у конкретного индивидуума.

Представленные результаты динамики средних величин подтверждаются данными корреляционного анализа. У больных с аллергией выявлена достоверная отрицательная связь зависимости площади под кривой \ТДС - время инкубации\ (r - 0,89) по сравнению с контролем. Выявленные результаты дают основание диагностировать in vitro как наличие пищевой аллергии, так и выявить непереносимость конкретных пищевых продуктов у лиц с отсутствием положительных реакций при аллергологических (скарификационных, иммунологических) тестах с пищевыми аллергенами. Кроме того, способ позволяет также оценить степень положительного влияния конкретного пищевого продукта на состояние окислительно-восстановительных процессов и уровень неспецифической резистентности организма.

Пример 1.

Больной С., 49 лет. Предъявляет жалобы на зуд и высыпания на коже головы и груди, которые впервые появились около 1 года назад. Конкретной связи между течением заболевания и каким-либо аллергеном или пищевой непереносимостью установить не удавалось. Объективно: общее состояние удовлетворительное, кожные покровы чистые, на коже волосистой части головы и в области грудины определяется папулезная сыпь, сухость кожи. Проведено исследование влияния на больного пищевых продуктов путем постановки аллергологических внутрикожных проб с пищевыми аллергенами, положительной реакции не выявлено. Поставлен клинический диагноз: аллергический дерматит головы и груди. Учитывая анамнез, отсутствие явных причин аллергической реакции со стороны кожи, проведено пробное тестирование крови путем постановки нагрузочного теста с антигенами - тестируемыми веществами, в качестве которых использовались пищевые аллергены (всего исследовались аллергены 50 пищевых продуктов (таблицы 1.1, 1.2, 1.3, 1.4 - прилагаются). Выявлено значительное уменьшение (по сравнению с отрицательным контролем) площади под кривой зависимости \ТДС - время инкубации\ при нагрузочном тесте с казеином коровьего молока (уменьшение на 111%) и с белком куриного яйца (уменьшение на 105%), что соответствовало уровню положительного контроля с гистамином (уменьшение на 122%), т.е. по сути аллергической реакции. Определялось также менее выраженное снижение Δ AUC (в пределах 59-28% по сравнению с отрицательным контролем) при тестировании еще 9 пищевых продуктов (рыба карп, минтай, хек, тыква, овсяная, ячменная, гречневая крупа, малина, зеленый чай), что расценено, как показатели их непереносимости. Среди 12 пищевых продуктов (желток куриного яйца, рисовая и пшенная крупа, ржаная мука, свекла, яблоко, банан, смородина, слива, виноград, лук, кофе) выявлено минимальное снижение Δ AUC (в пределах 99-60% по сравнению с отрицательным контролем), которое было расценено как индифферентное действие. И, наконец, при тестировании еще 27 пищевых продуктов отмечалось увеличение показателя Δ AUC выше отрицательного контроля (принятого за 100%), что предполагало их полезное влияние на организм.

После исключения из питания аллергенных пищевых продуктов (элиминационная диета) и употребления преимущественно продуктов с прогностически полезным действием на организм (включая и индифферентные), признаки аллергического дерматита регрессировали в течение 4-х недель без применения какого-либо дополнительного лечения.

Пример 2.

Больной И., 47 лет. Предъявляет жалобы на то, что после употребления в пищу некоторых пищевых продуктов (фрукты, мясо) появляется чувство тяжести в подложечной области, метеоризм, учащенный стул. Эпизодически появляется зуд и сыпь на коже кистей. Данные явления обычно длятся от нескольких часов до суток. Четкой связи между приемом какого-либо пищевого продукта и указанными жалобами выявить не удавалось. Гастроэнтерологическое обследование патологических изменений со стороны желудочно-кишечного тракта не выявило. Проведены скарификационные пробы с пищевыми аллергенами, реакции оценены как отрицательные. Исследование крови путем постановки нагрузочного теста с набором пищевых аллергенов (всего - 52 пищевых продукта, графики и таблицы 2.1, 2.2, 2.3, 2.4 - прилагаются) выявило уменьшение (по сравнению с отрицательным контролем) площади под кривой зависимости \ТДС - время инкубации\ при нагрузочном тесте с антигеном мяса свинины (уменьшение на 56%, что соответствовало Δ AUC=44%) и с антигеном груши (уменьшение на 44%, Δ AUC=56%), не достигавшее, однако, величин положительного контроля (Δ AUC в реакции с гистамином = -3%), что расценено как проявление не аллергии, а пищевой непереносимости. Наблюдалось менее выраженное уменьшение Δ AUC (в пределах 99-60%) при тестировании еще 11 пищевых продуктов (рыба карп, минтай, гречневая и рисовая крупа, кукурузная мука, картофель, капуста, орех грецкий, дыня, смородина, вишня), расцененное как индифферентное действие. Выявлено также повышение (в пределах ΔAUC≥100%) показателей ТДС-теста с 39 продуктами питания.

Исходя из полученных результатов, пациенту было рекомендовано употребление только тех пищевых продуктов, которые способствовали в тесте in vitro увеличению или, как минимум, не способствовали уменьшению показателя ТДС в крови, что отражало, по-видимому, их положительное влияние на окислительно-восстановительный баланс и уровень неспецифической резистентности макроорганизма. Применение такой индивидуальной диеты в течение 4-х недель способствовало полному восстановлению нормального самочувствия пациента, повышению работоспособности, хорошей переносимости употребляемой пищи.

Вследствие реализации предлагаемых отличий, которые по своей сути являются новыми критериями для оценки влияния на живой организм тестируемого вещества, диагностики пищевой аллергии или пищевой непереносимости, обеспечиваются следующие преимущества предлагаемого способа: 1) способ осуществляется простым и доступным методом, что может быть выполнимо не только в иммунологической или аллергологической, но и в любой общеклинической лаборатории;

2) отсутствует опасность провоцирования у пациента побочных или аллергических реакций; 3) способ позволяет проводить одновременное тестирование практически неограниченного количества аллергенов;

4) методика тестирования крови с помощью ТДС-реакции на аллергены позволяет выявлять и дифференцировать не только аллергическую реакцию, но также неиммунологические формы аллергии или непереносимость пищевых продуктов;

5) установление количественных характеристик изменения показателей кривой зависимости \ТДС - время инкубации\ как критерия оценки пищевой непереносимости позволяет повысить точность диагностики по сравнению с прототипом, где такие критерии отсутствуют.

Изобретение относится к области иммунологии и может быть использовано для определения воздействия на организм пищевого продукта. Сущность изобретения состоит в том, в пробе крови определяют тиол-дисульфидное соотношение (ТДС), инкубируют ее с единичной дозой антигена конкретного пищевого продукта, при этом через 30 минут, 1 час и 3 часа после начала инкубации повторно добавляют последовательно увеличенную в 2, 4 и 8 раз, соответственно, дозу антигена и определяют ТДС с интервалами в 30 минут, 1 час, 3 часа и 24 часа инкубации, строят график зависимости величины ТДС от времени инкубации и вычисляют значение площади под кривой зависимости величины ТДС от времени инкубации. Техническим результатом является разработка способа, позволяющего определить аллергию, пищевую непереносимость или полезность пищевого продукта. 3 з.п. ф-лы, 3 табл.

1. Способ определения воздействия на организм пищевого продукта, заключающийся в том, что в пробе крови определяют тиол-дисульфидное соотношение (ТДС), инкубируют ее с единичной дозой антигена конкретного пищевого продукта, при этом через 30 мин, 1 ч и 3 ч после начала инкубации повторно добавляют последовательно увеличенную в 2, 4 и 8 раз соответственно дозу антигена и определяют ТДС с интервалами в 30 мин, 1 ч, 3 ч и 24 ч инкубации, строят график зависимости величины ТДС от времени инкубации и вычисляют значение площади под кривой зависимости величины ТДС от времени инкубации.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что при уменьшении площади под кривой зависимости ТДС от времени инкубации до значений, полученных при инкубации с гистамином в качестве антигена (положительного контроля), определяют аллергическое действие тестируемого пищевого продукта.3. Способ по п.1, отличающийся тем, что при уменьшении площади под кривой зависимости ТДС от времени инкубации по сравнению с отрицательным контролем, определяют непереносимость тестируемого пищевого продукта.4. Способ по п.1, отличающийся тем, что при увеличении площади под кривой зависимости ТДС от времени инкубации по сравнению с отрицательным контролем, определяют полезное действие тестируемого пищевого продукта.