СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ЛЕКАРСТВЕННОЙ АЛЛЕРГИИ Российский патент 2004 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к области медицины, а именно, к иммунологии, и может быть использовано при определении природы и механизмов аллергических реакций для адекватного подхода к использованию существующих методов лечения аллергии и поиска новых терапевтических приемов.

Эпидемиологические исследования показывают, что у каждого четвертого человека в той или иной степени проявляются симптомы аллергии при контакте с лекарственными препаратами, с веществами бытовой химии или промышленными аллергенами, при употреблении пищевых продуктов, а также при воздействии физическими факторами. Поэтому исследованию этиологии и патогенетических механизмов развития реакции гиперчувствительности в организме человека на тот или иной фактор и выбору методов последующего лечения больного отводится все более пристальное внимание. Одним из наиболее значимых аспектов в этом направлении являются исследования патогенеза гиперчувствительности в культурах клеточных клонов, сенсибилизированных к определенным факторам, например, к медикаментам.

В настоящее время известно множество методик лабораторной диагностики гиперчувствительности на основе тестирования с предполагаемым аллергеном, но все они разработаны под конкретный аллерген или группу предполагаемых аллергенов, имеют довольно узкую нишу применения и невысокую диагностическую эффективность. Так, часто используемые в аллергологических исследованиях “тест Шелли”, реакция пассивной гемагглютинации (РПГА), реакция преципитации, радиоаллерогосорбентный тест (PACT) и иммуноферментный метод (ИФА) для определения специфических IgE, IgGu, IgM предназначены для определения антител и не выявляют клеточно-опосредованных реакций гиперчувствительности.

Известный метод специфической аллергодиагностики, основанный на реакции клеточного типа к различным антигенам - реакция торможения миграции лейкоцитов (РТМЛ), достаточно эффективно определяет первую доиммунную фазу воспалительной реакции, выявляя целый комплекс хемокинов и адгезионных факторов, но не содержит информации об аллергическом процессе, а известный тест аллергической альтерации лейкоцитов может быть использован лишь для некоторых медикаментов (локальных анестетиков), когда не требуется предварительный метаболизм препарата и процессинг его в антиген представляющих клетках, к тому же этот метод основан на субъективной оценке результатов.

Известен способ диагностики аллергии по тесту торможения элиминации лейкоцитов (ТТЕЭЛ), который проводится “in vivo” при исследовании гиперчувствительности к лекарственным препаратам (Адо А.Д., Бондарева Г.П., Читаева В.Г. Феномен торможения миграции лейкоцитов in vivo и in vitro при лекарственной аллергии. - Стоматология, 1980г., 58, с.3-5). Как и в любом случае применения тестов “in vivo”, известный метод представляет потенциальную опасность для пациента, имеет противопоказания при воспалительных заболеваниях полости рта и у детей раннего возраста.

Наиболее близким из известных способов диагностики аллергии к описываемому является способ диагностики аллергии (Хальперн Б., Ки Н. и Амач Н. Тест трансформации лимфоцитов (ТТЛ) в специфической диагностике лекарственной аллергии. В кн.: Проблемы иммунологической реактивности и аллергии/Под ред. А.М.Чернуха и Л.М.Ишимовой. - М., 1971г, с. 136), включающий исследование примированных антигеном лимфоцитов. Известный метод основан на исследовании пролиферации сенсибилизированных медикаментом лимфоцитов в культурах мононуклеальных клеток периферической крови и предполагает определение количества бластных клеток - тест трансформации лимфоцитов (ТТЛ).

Обладая определенной диагностической информативностью (диагностическая эффективность при исследовании аллергии на пенициллин составляет 75%), известная методика имеет ограничения в применении, например, у больных с заболеваниями печени, ферментопатиями, с непереносимостью нестероидных противовоспалительных препаратов (НПВП) результаты ТТЛ, как правило, бывают отрицательными. ТТЛ также не распознает слабые антигенные сигналы, которые не приводят к пролиферации, как это происходит в случае перекрестной непереносимости веществ, имеющих в структуре аналогичные химические группы.

Кроме того, исследования известным способом занимают достаточно длительный срок (результаты ТТЛ просчитываются только на 4-7 сутки), трудоемки, поскольку требуют точного количественного исполнения, необходимого для объективного вычисления индекса активации относительно спонтанной пролиферации, и связаны с использованием радиоактивных веществ, а потому для его осуществления необходимы специально подготовленные исполнители, что сужает возможности распространения известной методики для широкого круга больных.

Таким образом, технический результат, получаемый при реализации описываемого изобретения, состоит в повышении эффективности диагностики аллергических заболеваний, расширении функциональных возможностей и доступности способа и сокращении сроков обследования.

Указанный технический результат достигается тем, что в способе диагностики аллергии, включающем исследование примированных антигеном лимфоцитов, что определяют количество лимфоцитов, активированных антигеном в культуре мононуклеарных клеток периферической крови цитофлуориметрическим методом с использованием моноклональных антител к мембранным молекулам активации лимфоцитов.

При этом в качестве антигена используют лекарственный препарат, разведенный в терапевтически допустимых пропорциях, а о развитии аллергической реакции судят по разнице процентного содержания CD69+ лимфоцитов и CD25+ лимфоцитов относительно отрицательного контроля.

Целесообразно аллергическую реакцию диагностировать по разнице относительно отрицательного контроля CD69+ лимфоцитов в 4% и более на первые сутки и/или CD25+ лимфоцитов в 6% и более на третьи сутки после введения антигена в пробу крови обследуемого пациента.

Установлено, что во многих случаях аллергическая реакция развивается не на само вещество, попадающее в организм, а на продукты его метаболизма в организме, и это, в свою очередь, затрудняет диагностику гиперчувствительности. Так, химически реактивные вещества - гаптены могут образовывать ковалентные связи с белками плазмы и превращаться в полный антиген (пенициллин, D-пеницилламин). Также химически нереактивные вещества (например, лекарства - лидокаин, сульфонамиды, карбамазепин, фенитоин и др.), не являющиеся гаптенами, могут метаболизироваться в печени при участии энзимов семейства цитохрома Р450 и превращаться в гаптены, гаптенизировать белки и пептиды, которые распознаются сенсибилированными Т-клетками как полные антигены. Например, при аутоиммунном гепатите, вызванном длительным приемом диуретика, продуцируются антитела, направленные против гаптенизированных метаболитов данного медикамента, ковалентно связанного с изоэнзимом CYP2C9, который преобразует прогаптен в реактивный метаболит. Способность к метаболизму выявлена у моноцитов крови, экспрессирующих высокий уровень энзима CYP1B1 цитохрома Р450 и у клеток Лангерганса в коже, содержащих изоэнзим CYP1A, которые могут участвовать в оксидации ксенобиотиков, в том числе лекарств. Эти клетки, а также тканевые макрофаги, большинство которых находится в печени и легочной ткани, являются профессиональными антиген-представляющими клетками (АПК).

Таким образом, тяжелые местные аллергические эффекты могут быть вызваны химически инертными веществами, а потому предварительное аллергическое тестирование и прежде всего лекарственных препаратов приобретает особо важное значение.

В то время как отмеченные выше проявления пролиферативных функций клеток периферической крови незначительны или вообще отсутствуют, начало экспрессии молекул активации на мембране стимулированных антигеном лимфоцитов имеет место и может быть зафиксировано цитофлуометрическим методом с использованием моноклональных антител к мембранным молекулам активации лимфоцитов.

Так, при гиперчувствительности к НПВП основную роль отводят продуктам метаболизма арахидоновой кислоты - лейкотриенам и интерлейкину-1 (ИЛ-1), которые при блокаде циклооксигеназ (СОХ-1 и СОХ-2) могут инициировать реакции гиперчувствительности. Известно, что СОХ-2 ассоциируется с воспалительными реакциями. Ингибиторы СОХ-2, к которым относятся и НПВП, ослабляют ранние и поздние события Т-клеточной активации, включая экспрессию мембранных молекул CD25 и CD71, но не CD69. Поэтому исследование экспрессии молекул на мембранах активированных лимфоцитов в ранних культурах МНПК (на первые сутки) особенно важно при тестировании пациентов с непереносимостью к НПВП.

Описываемый способ диагностики аллергии соответствует современным представлениям о патогенезе развития острых реакций на воздействие различных веществ, в частности, на прием лекарств, который включает иммунные и неиммунные механизмы развития поражения тканей в организме человека и применим как при антителозависимом (гуморальном), так и при антителонезависимом (клеточном) пути развития иммунопатологических процессов.

Способ диагностики аллергии осуществляют следующим образом.

У пациента с предполагаемым диагнозом гиперчувствительности на определенное вещество производят забор крови, которую помещают в пробирки с добавлением гепарина и проводят исследования in vitro. Для приготовления опытных образцов из гепаринизированной крови на градиенте плотности фиколл-гепак (плотность 1,077) посредством центрифугирования выделяют мононуклеары периферической крови (МНПК) и инкубируют их в иммунологических планшетах с U-образным дном в количестве 5х10⁴/лунку с добавлением в лунки 10%-ной сыворотки больного и аллергена в атмосфере 5% CО₂ при температуре 37°С в течение 72 часов в полной питательной среде (например, в составе: RПM1-1640, 300мг/мл L-глутамина, 0,01моль Hepes-буфера и 10% термоинактивированной сыворотки телят). При этом аллерген (например, медикамент) предварительно разводят в буферном растворе (PBS) либо питательной среде до концентраций, соответствующих терапевтическим, и добавляют в культуры клеток в следующих конечных разведениях: 1:1; 1:2; 1:10; 1:100 и 2:1.

Одновременно готовят контрольные пробы:

- с добавлением фитогемагглютинина (ФГА) в качестве активатора лимфоцитов для контроля функциональной активности клеток - положительный контроль, и

- без медикамента - отрицательный контроль.

На первые и третьи сутки культивирования в пробах определяют процент CD69+ лимфоцитов и CD25+ лимфоцитов соответственно с помощью моноклональных антител, меченных флуоресцентными красителями на цитофлуометре, и сравнивают результаты, полученные в испытуемых образцах и в отрицательном контроле. При наблюдаемой разнице в количестве CD69+ лимфоцитов 4% и более и/или CD25+ лимфоцитов - 6% и более результат оценивают как положительный. Пригодность теста для пациента подтверждается положительной реакцией на ФГА.

В отличие от теста ТТЛ, результаты которого при реакциях на антиген просчитывают на 5-7 сутки, начало экспрессии молекул активации CD69 и CD25 на мембране стимулированных антигеном лимфоцитов проявляется уже на первые и третьи сутки соответственно.

Пригодность описываемого способа диагностики аллергии подтверждается испытаниями с использованием в качестве антигенов медикаментов, поскольку в аллергических реакциях на лекарственные препараты, как правило, участвуют основные механизмы иммунопатологических процессов в реакции гиперчувствительности.

Описываемым способом диагностики аллергии были обследованы три группы пациентов, из которых:

- первая группа состояла из 70 пациентов с установленной гиперчувствительностью к медикаментам,

- вторая группа - 14 здоровых студентов медицинского института (доноров), составивших группу контроля,

- третья группа - 6 пациентов с аллергическими заболеваниями без лекарственной непереносимости, поступивших для планового обследования.

Исследования проводились в соответствии с описанной выше методикой. В качестве аллергенов использовали нестероидные противовоспалительные препараты (НПВП) аспирин, анальгин и вольтарен. Состояние развития реакции гиперчувствительности определяли по разнице процентного содержания СD69+ лимфоцитов и СD25+ лимфоцитов в культурах МНПК в опыте и в отрицательном контроле. Статистическая обработка результатов проводилась по парному критерию Стьюдента.

Результаты исследований представлены в таблице 1, из которой следует, что при сравнении средних показателей активированных лимфоцитов в культурах клеток в ответ на причинный медикамент у пациентов с лекарственной гиперчувствительностью процент CD69+ лимфоцитов в первые сутки культивирования и CD25+ лимфоцитов на третьи сутки культивирования были достоверно выше контроля, а также аналогичных показателей у здоровых доноров и пациентов с аллергическими заболеваниями без лекарственной непереносимости.

При парном сравнении показателей в опыте и контроле средняя разница в процентном содержании CD69+ лимфоцитов в первые сутки культивирования составила 8,67±4,56%, а CD25+ лимфоцитов на третьи сутки культивирования - 17,0±11,1%, и разницы были достоверными. С использованием парного критерия Стьюдента определены нижние границы разницы показателей: 4 и 6% соответственно.

Оценку диагностических характеристик описываемого метода проводили на пробах пациентов первой и второй групп. Для этого исследовали пробы с добавлением НПВП либо других лекарственных препаратов (ЛП) и по известным методикам определяли специфичность, чувствительность и диагностическую эффективность метода.

Для сравнения использованы данные, характеризующие способ диагностики аллергии по прототипу - тест трансформации лимфоцитов (ТТЛ). Результаты оценки, приведенные в таблице 2, свидетельствуют о преимуществах описываемого способа диагностики аллергии по сравнению с прототипом.

Таким образом, описанный способ диагностики аллергии позволяет с большой степенью эффективности и надежности уточнить причинный аллерген и своевременно назначить патогенетическую терапию. При этом обследования проводятся in vitro, исключая контакт пациента с веществами, способными вызвать обострение заболевания.

Использование: в области медицины, а именно, в иммунологии. Способ диагностики аллергии проводят путем определения количества лимфоцитов, активированных антигеном в культуре мононуклеарных клеток периферической крови цитофлуориметрическим методом с использованием моноклональных антител к лимфоцитам, и при разнице относительно отрицательного контроля CD69+ лимфоцитов 4% и более на первые сутки или CD25+ лимфоцитов 6% и более на третьи сутки после введения антигена в пробу крови пациента диагностируют аллергическую реакцию. Способ предусматривает повышение эффективности диагностики аллергических заболеваний, расширение функциональных возможностей и доступности способа и сокращение сроков обследования. 2 табл.

Способ диагностики лекарственной аллергии, включающий исследование примированных антигеном лимфоцитов, отличающийся тем, что определяют количество лимфоцитов, активированных антигеном в культуре мононуклеарных клеток периферической крови цитофлуориметрическим методом с использованием моноклональных антител к лимфоцитам и при разнице относительно отрицательного контроля CD69+ лимфоцитов 4% и более на первые сутки или CD25+ лимфоцитов 6% и более на третьи сутки после введения антигена в пробу крови обследуемого пациента диагностируют аллергическую реакцию.