СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ IN VITRO НЕПЕРЕНОСИМОСТИ ПИЩЕВЫХ АНТИГЕНОВ Российский патент 2003 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к области медицины, в частности иммуноаллергологии, и предназначено для выявления непереносимости пищевых антигенов.

В настоящее время наиболее распространенными методами для выявления in vitro непереносимости пищевых антигенов являются способы, связанные с применением иммуноферментного анализа [1], флюоресцентных зондов [2].

Однако эти методы многостадийны, продолжительны по времени, требуют применения дорогостоящих тест-систем и использования реагентов, содержащих сильнодействующие или ядовитые вещества.

В последние годы более приемлемыми, менее токсичными для использования стали методы выявления пищевой непереносимости, связанные с исследованием клеток крови (см. пат. РФ 2094805, 1997, пат. РФ 2140085, 1999).

Наиболее близкими можно считать разработки, где проводились испытания пищевых антигенов в реакции торможения естественной миграции лейкоцитов [3], а также методом инкубации крови с пищевым аллергеном после инкубирования в физиологических условиях в течение 2 часов изучали морфологию эозинофилов [4].

Технической задачей изобретения является ускорение и упрощение способа выявления непереносимости пищевых аллергенов у взрослых и детей. Задача решается с помощью исследования изменения метаболического ответа гранулоцитов крови пациента на инкубацию их с пищевыми антигенами in vitro.

Изобретение осуществляют следующим образом.

Для исследования у пациентов берут венозную кровь, гепаринизируют, инкубируют ее с пищевым антигеном (ПА) в течение 15-20 минут при физиологических условиях, используют ПА в концентрации 1000, 5000 и 10000 PNU/1 мл. Для оценки результатов определяли процентное содержание гранулоцитов, активированных пищевыми антигенами с помощью проточного цитофлюориметра и методом хемилюминесценции.

Функциональную активность клеток у всех пациентов определяли в пробах с бактериальным активатором (Е. coli), а резервный метаболический потенциал в пробах с форболовым эфиром (ФМА). У всех обследованных лиц метаболический резерв и фагоцитарная активность были сохранены, что позволило использовать их пробы крови для разработки теста непереносимости ПА.

Исследовали непереносимость следующих пищевых антигенов: цельное яйцо, молоко, мандарин, треска, свинина, говядина, куриное мясо, пшеница, рис.

В качестве контрольных методов в сыворотке крови определяли уровень специфических антител класса Ig E в множественном аллергосорбентном хемилюминесцентном тесте и проводили реакцию агломерации лейкоцитов (РАЛ) с теми же пищевыми антигенами.

Результат исследования оценивали по процентному содержанию активированных пищевым антигеном гранулоцитов и коэффициент интенсивности активации ПА гранулоцитов (АПАГ). Всего было исследовано 20 пациентов в возрасте от 2 до 55 лет. У 15 пациентов в контрольных тестах (специфические Ig E и РАЛ) не выявлено непереносимости исследуемых ПА. У 5 пациентов обнаружены высокие титры специфических антител к ПА.

При статистической обработке результатов выявлено следующее.

1. В группе лиц с хорошей переносимостью ПА в тестах с концентрацией 1: 10000 процент активированных гранулоцитов составил М±m=3,403±0,590%, (n=59)
Коэффициент интенсивности активации клеток М±m=1,015±0,077%, (n=62)
В тестах с концентрацией ПА 1:5000 процент активированных гранулоцитов составил М±m=5,632±0,760%, (n=18)
Коэффициент интенсивности активации клеток М±m=1,134±0,128%, (n=18)
2. В группе лиц с непереносимостью ПА в тестах с концентрацией 1:10000 процент активированных гранулоцитов составил М±m=5,017±1,179%, (n=18)
Коэффициент интенсивности активации клеток М±m=1,53±0,109%, (n=18)
В тестах с концентрацией ПА 1:5000 процент активированных гранулоцитов составил М±m=11,06±1,0%, (n=45)
Коэффициент интенсивности активации клеток М±m=1,319±0,091%, (n=45)
В тестах с концентрацией ПА 1:1000 процент активированных гранулоцитов составил М±m=13,867±2,735%, (n=27)
Коэффициент интенсивности активации клеток М±m=1,251±0,101%, (n=27)
Коэффициент интенсивности АПАГ вычисляли как соотношение интенсивности активации гранулоцитов в пробе с ПА к нормальной пробе (таблица).

Чувствительность разработанного теста непереносимости пищевого антигена составляет 70%.

Специфичность - 93,55%.

Предсказательная ценность положительного результата - 95,12%.

Предсказательная ценность отрицательного результата - 82,9%.

Изобретение иллюстрируется следующими конкретными примерами на пациентах - добровольцах.

ПРИМЕР 1. Больная Г., 46 лет, жалобы на кожный зуд, сыпь, которые беспокоят в течение длительного времени. Пациентка обследована с помощью заявленного метода: была взята венозная кровь, гепаринизирована и проинкубирована в течение 15 минут с каждым из следующих ПА: яйцо цельное, молоко коровье, свинина, говядина, пшеница. Исследование проводили в разведении антигена 1:5000 PNU с помощью хемилюминесцентного анализа. Уровень процентного содержания активированных гранулоцитов оказался выше нормы практически по всем испытуемым антигенам, что позволило выявить непереносимость пациенткой вышеперечисленных пищевых продуктов. Исследование с помощью выявления специфических IgE к тем же пищевым антигенам показало наличие их более 10,0 UI/мл.

ПРИМЕР 2. Больная М., 42 года, видимых клинических признаков пищевой непереносимости не выявлено. Было проведено исследование по заявленному способу (цитофлюориметрический метод выявления активированных гранулоцитов), а также для сравнения - определение специфических антител класса Ig E. Результаты исследования показали, что по заявленному способу выявляется непереносимость антигенов пшеницы, что было подтверждено последующими наблюдениями за пациенткой. Специфических Ig E к испытуемым пищевым антигенам выявлено не было.

ПРИМЕР 3. Больной К., 38 лет. Было проведено исследование на непереносимость следующих пищевых антигенов: яйцо цельное, говядина, молоко коровье, мандарин, мясо куриное. По результатам исследования у пациента выявлена непереносимость цитрусовых, яиц, говядины и коровьего молока. Из исследованных антигенов не обнаруживается реакция крови пациента на белки мяса птицы.

ПРИМЕР 4. Больная П., 32 года. Обследована по заявленному методу в тесте со следующими антигенами: яйцо цельное, молоко коровье, мандарин, треска, свинина, говядина, курица, пшеница, рис. У данной пациентки выявлена непереносимость мандарина, курицы, пшеницы и риса.

ПРИМЕР 5. Больной Я. , 54 года. Обследован по заявленному способу (флюоресцентный метод) со следующими антигенами: яйцо цельное, молоко коровье, мандарин, треска, свинина, говядина, курица, пшеница. У этого пациента наблюдается непереносимость антигенов яйца и пшеницы.

Таким образом, настоящее изобретение позволило создать достаточно простой и удобный метод для быстрого определения непереносимости человеком конкретных пищевых продуктов.

Источники информации
1. Гервазиева В.Б. и др. Использование твердофазного иммуноферментного анализа для определения аллергенспецифических Ig Е - антител. ЖМЭИ, 1987, 9, 33-35.

2. Кириллов М. А. Диагностики специфической сенсибилизации и функциональнoгo состояния мембран лейкоцитов при аллергических заболеваниях у детей с использованием флюоресцентных зондов. Канд. дисс. Л., 1991.

3. Потемкина А.М., Гизатуллина Н.Р. Тест торможения естественной миграции лейкоцитов в диагностике пищевой аллергии. Казанский медицинский журнал. 1993. 5, 353-355.

4. Е.С. Нишева и др. Способ диагностики аллергии с помощью изучения морфологии эозинофилов. Клиническая лабораторная диагностика. 1995, 2, 29-31.

Изобретение относится к области медицины, в частности к иммуноаллергологии, и предназначено для выявления непереносимости пищевых антигенов. Сущность изобретения состоит в том, что проводят инкубирование антигена с клетками гепаринизированной крови пациента, при этом используют антиген в разведении 1:5000 PNU, оценивают метаболическую активацию гранулоцитов по их процентному содержанию после инкубации. При увеличении этого показателя по сравнению с нормой выявляют непереносимость этого пищевого антигена. Техническим результатом изобретения является создание способа, достаточно простого и удобного для быстрого определения непереносимости пищевых продуктов. 2 з.п. ф-лы, 1 табл.

1. Способ выявления in vitro непереносимости пищевого антигена, включающий его инкубирование с клетками гепаринизированной крови пациента, отличающийся тем, что исследование ведут в венозной крови, инкубирование проводят с антигеном в разведении 1:5000 РNU, оценивают метаболическую активацию гранулоцитов по процентному содержанию их после инкубации и при увеличении этого показателя в сравнении с нормой выявляют непереносимость пищевого антигена. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что инкубацию проводят в физиологических условиях в течение 15-20 мин. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что метаболическую активацию гранулоцитов оценивают с помощью проточного цитофлюориметра или регистрируют на хемилюминометре.