ШТАММ PSEUDOMONAS AUREOFACIENS ИБ 6 - ПРОДУЦЕНТ ЦИТОКИНИНОВ Российский патент 2005 года по МПК A01N63/00 C12N1/20 C12N1/20 C12R1/38 

Изобретение относится к области микробиологии и сельского хозяйства и может быть использовано для получения рост стимулирующих препаратов для растениеводства путем микробиологического синтеза.

Известны микроорганизмы, обитающие в ризосфере растений, способные синтезировать цитокинины, представляющие собой наиболее активные среди открытых рост регулирующих веществ. К таким микрорганизмам относятся представители родов Azotobacter /1-3/, Arthrobacter /4, 5/, Bacillus /6/, Pseudomonas /7/, Streptomyces /8/, Frankia species /9/. Использование фитогормонов микробного происхождения в растениеводстве может быть перспективно при наличии штамма продуцента, обеспечивающего достаточно высокий уровень секреции внеклеточных цитокининов.

Известен штамм Pseudomonas stutzeri 136, продуцент цитокининов /10/, однако уровень продукции цитокининов (содержание в культуральной среде) не известен.

Наиболее близким к заявляемому по продуцирующей способности является штамм Bacillus subtilis, образующий цитокинины в количестве 600-640 нг-экв. зеатина на 1 мл культуральной среды /6/. Недостатком упомянутого штамма является как относительно невысокий уровень накопления цитокининов, так и сравнительно невысокая скорость роста культуры В.subtilis ИБ 22 при ее культивировании.

Технической задачей изобретения является расширение перечня перспективных микроорганизмов - продуцентов цитокининов с получением нового штамма бактерий, превосходящего по уровню накопления цитокининов известные штаммы, и высокой скоростью роста при культивировании.

Поставленная задача достигается предлагаемым штаммом Pseudomonas aureofaciens ИБ 6, выделенным из образца сточных вод, отобранного в аэротенке биологических очистных сооружений ОАО "Орскнефтеоргсинтез". Штамм поддерживается в коллекции микроорганизмов Института биологии Уфимского научного центра РАН.

Культурально-морфологические признаки. Короткие, подвижные палочки, грамотрицательные, спор не образуют. Морфологию колоний на питательных средах определяли после 4-5 суток роста при 28°С. На мясо-пептонном агаре (МПА) - круглые с ровными краями, гладкие, слабовыпуклые, непрозрачные, ярко-оранжевые в центре с более светлой окантовкой, слизистой консистенции колонии, диаметр 5-6 мм, пигмент ярко-оранжевый, диффундирующий в среду. На МПА с 2% глицерина - колонии крупнее, интенсивнее окрашены, более интенсивная диффузия в среду пигмента. Пигментация на диагностических средах Кинга для флюоресцирующих псевдомонад: Кинг А - пигмент отсутствует; Кинг Б - образуется желто-зеленый флюоресцирующий пигмент. В жидких питательных средах (МПБ) образуется тонкая, сплошная, складчатая пленка. На МПА-косяках штрих обильный, сплошной с ровным краем.

Физиолого-биохимические признаки. По отношению к кислороду - аэроб, окислительный тип метаболизма. Не нуждается в факторах роста. Разжижает желатин. Пептонизирует и свертывает молоко. Образует леван из сахарозы, не гидролизует крахмал. Продуцирует каталазу, образует аргининдигидролазу. Гидролизует лецитин, Твин-80. Растет при 4°С, растет на МПБ с 3% NaCl. Усваивает с образованием кислоты глюкозу, ксилозу, сахарозу, арабинозу, рафинозу, фруктозу. В качестве источника углерода использует мальтозу, бутанол, гексанол, маннит, глицерин, бензойную кислоту, пропионовую кислоту, антраниловую кислоту, янтарную кислоту, оскетоглутаровую кислоту, пируват, лактат, цитрат, фенилаланин, серин, лейцин, аргинин, аланин, валин, триптофан, орнитин, пролин, лизин, тирозин. Не усваивает лактозу, этанол, пропанол, сорбит, ацетамид, малеиновую кислоту, адипиновую кислоту, оксалат, изомасляную кислоту, треонин, метионин, цистеин, гексан, декан, октадекан, формальдегид, фенол.

Штамм устойчив к ампицилину (5000 мкг/мл), стрептомицину (500 мкг/мл), эритромицину (100 мкг/мл), чувствителен к гентамицину (100 мкг/мл).

Штамм хранится на косяках МПА в холодильнике с пересевом на свежие косяки через 2-4 месяца, а также в лиофильно-высушенном состоянии.

Штамм идентифицирован по определителю Bergey's Manual of Determinative Bacteriology.

Состав среды LB для культивирования, г/л: пептон - 10,0; дрожжевой экстракт - 5,0; натрий хлористый - 10,0; вода водопроводная до 1 л.

Образование заявляемым штаммом цитокининов характеризуется следующим примером.

Пример 1. Бактерии Pseudomonas aureofaciens ИБ 6 выращивают на среде вышеупомянутого состава путем культивирования на установке УВМТ 12-250 при 160 об/мин при 28-30°С. На поздней логарифмической фазе роста или в начале стационарной фазы биомассу отделяют от культуральной жидкости центрифугированием при 10000 об/мин и супернатант анализируют на содержание цитокининов методом непрямого конкурентного иммуноферментного анализа /11/. Результаты анализа представлены в табл. 1 и показывают, что культуральная жидкость штамма Pseudomonas aureofaciens ИБ 6 достоверно и в значительной степени ингибирует реакцию антиген-антитело, что свидетельствует о наличии в культуральной среде цитокининов, эквивалентно 680 нг-экв. зеатина/мл культуральной среды, превышающий аналогичный показатель по штамму-прототипу.

Таблица 1
Иммунореактивность культуральной жидкости и содержание цитокининов штамма Pseudomonas aureofaciens ИБ 6 в тест-системе для определения цитокининовШтаммСодержание цитокининов OD₄₉₂нг-экв./млPseudomonas aureofaciens ИБ 60,38±0,09680,0Bacillus subtilis ИБ-22 (по прототипу)0,50±0,09647,0Контроль*1,55±0,200,0*Контроль - питательная среда до внесения в нее культуры бактерий

Высокая продуктивность заявляемого штамма подтверждается следующим примером.

Пример 2. Культуру бактерий штамма Pseudomonas aureofaciens ИБ 6 культивируют, как описано в примере 1; через 1, 2, 4, 6, 8 и 12 часов отбирают пробы культуральной жидкости и общепринятыми методами определяют число жизнеспособных клеток в 1 мл жидкости. Для сравнения с прототипом аналогичные процедуры проводят с культурой Bacillus subtilis ИБ-22 (состав питательной среды приведен в /6/). Результаты приведены в табл. 2 и свидетельствуют о более высокой продуктивности заявляемого штамма, выражающейся в более высокой скорости роста микроорганизмов по сравнению с штаммом по прототипу.

Таблица 2
Продуктивность штаммов Pseudomonas aureofaciens ИБ 6 и Bacillus subtilis ИБ-22Время ферментации, чЧисло жизнеспособных клеток (КОЕ), млрд./мл Pseudomonas aureofaciens ИБ 6Bacillus subtilis ИБ-22 (по прототипу)07,0*10⁵1,0*10⁵19,0*10⁷5,0*10⁵21,0*10⁹4,2*10⁶42,0* 10⁹8,0*10⁶65,0*10⁹1,1*10⁷89,0*10⁹7,6*10⁷124,0*10¹⁰2,3*10⁸241,4*10¹⁰8,3*10⁹321,5*10¹⁰9,0*10⁹

Дополнительным преимуществом заявляемого штамма Pseudomonas aureofaciens ИБ 6 является способность синтезировать при культивировании не только цитокинины, но и ауксины, также представляющие собой рост регулирующие вещества. Анализ культуральной жидкости штамма на содержание ауксинов /12/ показал их наличие в количестве 511 нг в 1 мл культуральной жидкости.

Таким образом, получен новый штамм бактерий Pseudomonas aureofaciens ИБ 6 - продуцент цитокининов с высоким уровнем накопления этих рост регулирующих веществ в культуральной жидкости и высокой скоростью роста при культивировании.

Список литературы

1. Arshad M., Frankenberger W. Microbial production of plant hormones // Plant and Soil. - 1991. - V.133. - P.1-8.

2. Barea J.M., Brown M.E. Effects of plant growth produced by Azoto-bacter paspali related to synthesis of plant growth regulating substances //J. Appl. Bacteriol. - 1974. - V.40. - P.583-599.

3. Azcon R., Barea J. Synthesis of auxins, gibberellins and cytokinins by Azotobacter vinelandii and Azotobacter bijerinkii related to effects produced on tomato plants //Planta Soil. - 1975. - V.43. - P.609.

4. Blondeau R. Nature d'une cytokinine presente dans les cultures de certains Arthrobacter //C. R. Acad. Sci. -1974. -V. D. 297. -P. 1571-1574.

5. Blondeau R. Contribution a l'etude au niveau de la rhisosphere //These doct. sci. nat. Lill. - Univ. Soet. Techn. - 1985. - P.212-215.

6. Патент RU 2178970, МКИ А 01 N 63/00. Штамм Bacillus subtilis ИБ-22 - продуцент цитокининов /Мелентьев А.И., Кудоярова Г.Р., Веселов С.Ю., Архипова Т.Н., Гильванова Е.А., Усанов Н.Г., Кузьмина Л.Ю., Симонян М.В., Бюл. №4, опубл. 10.02.2002.

7. Мишке И.В. Микробные фитогормоны в растениеводстве. - Рига: Зинатне, 1988. - 151 с.

8. Coppolla S., Giannattasio H. Activita citockinica in un actimicete rizosherico //Boll. Sci. Ital. Biol. Sper. - 1968. - V.44. - P.1913-1915.

9. Stevens G.A., Berry F.M. Cytokinin secretion by Frankia sp. HFPAr13 in defined medium//Plant Physiol. - 1988. - V.87. - P.15-16.

10. A.c. 1096279 СССР, МКИ С 12 N 1/00. Штамм бактерий Pseudomonas stutzeri 136 N 1686 продуцент цитокининов /Мишке И.В., Тевелева М.К., Бюл. №21, опубл. 07.06.84.

11. Кудоярова Г.Р., Веселов С.Ю., Каравайко Н.Н., Гюли-заде В.З., Чередова Е.П., Мустафина А.Р., Мошков И.Е., Кулаева О.Н. Иммуноферментная система для определения цитокининов //Физиология растений. - 1990. - Т.37, вып.1. - С.193-199.

12. Kudoyarova G., Veselov S., Mustafina A., Egutkin N., Gyuli-Zade V., Kof E. Modified solvent partitioning scheme providing increased specificity and rapidity of immunoassay for IAA // Physiol. Plantarum, 1992, v.86, p.93-96.

Изобретение относится к области микробиологии и сельского хозяйства и может быть использовано для получения рост стимулирующих препаратов для растениеводства путем микробиологического синтеза. Штамм бактерий Pseudomonas aureofaciens ИБ 6 превосходит по уровню накопления цитокининов известные штаммы. Штамм выделен из образца сточных вод из аэротенка биологических очистных сооружений и поддерживается в коллекции микроорганизмов Института биологии УНЦ РАН под номером ИБ 6. Штамм образует при росте на среде LB цитокинины в количестве 680 нг-экв. зеатина на 1 мл среды. 1 табл.

Штамм бактерий Pseudomonas aureofaciens KM ИБ УНЦ РАН ИБ 6 - продуцент цитокининов.