ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ БАКТЕРИЙ РОДА PSEUDOMONAS Российский патент 2007 года по МПК C12N1/20 C12Q1/04 C12R1/38 

Питательная среда может быть использована в биотехнологии при культивировании бактерий рода Pseudomonas с целью получения биопрепаратов на основе этих микроорганизмов, обладающих антагонистической активностью по отношению к грибным фитопатогенам.

Известны штаммы бактерий рода Pseudomonas, обладающие антагонистической активностью по отношению к грибным фитопатогенам, используемые для получения препаратов против заболеваний пшеницы, вызываемых грибными фитопатогенами [1, 2].

Известна питательная среда LB [3], являющаяся одной из основных для культивирования бактерий рода Pseudomonas - продуцентов веществ с фунгицидной активностью [4, 5] и состоящая, г/л:

Пептон - 10

Дрожжевой экстракт - 5

Натрий хлористый - 10

Вода водопроводная до 1 л.

Недостатком питательной среды является высокая стоимость, так как в ее составе присутствует такой дорогостоящий компонент, как пептон (примерно, 700 руб/кг).

Известна питательная среда Кинг В, принятая за прототип, также применяемая для культивирования бактерий рода Pseudomonas. В нее входят пептон, глицерин, различные минеральные соли, г/л:

Пептон - 20

Глицерин - 10

К₂HPO₄ - 1,5

MgSO₄·7H₂O - 1,5

Вода дистиллированная до 1 л.

Ее недостатком также является высокая стоимость, связанная с наличием в ее составе такого дорогостоящего ингредиента, каким является пептон.

При промышленном производстве биопрепаратов на основе бактерий рода Pseudomonas, предназначенных для использования в растениеводстве, высокая стоимость питательной среды неизбежно приведет к удорожанию целевого продукта.

Технической задачей предполагаемого изобретения является удешевление питательной среды для культивирования бактерий рода Pseudomonas и увеличение выхода биомассы.

Поставленная техническая задача удешевления стоимости питательной среды для культивирования бактерий рода Pseudomonas и увеличения выхода биомассы решается использованием питательной среды следующего состава, г/л:

Автолизат отработанных пивных дрожжей 7-8 генерации (по сухому веществу) - 26,8

К₂HPO₄ - 1,5

MgSO₄·7H₂O - 1,5

Вода водопроводная до 1 л.

Отработанные пивные дрожжи 7-8 генерации не используются в производстве пива, так как клетки таких дрожжей уже не способны к осуществлению своей основной функции в процессе брожения; они также утрачивают и способность к размножению. Количество мертвых клеток в такой генерации достигает 89%, со слабой жизнедеятельностью - до 10%. В настоящее время отработанные пивные дрожжи не находят квалифицированного применения и, как правило, сливаются в канализацию. В то же время отработанные пивные дрожжи содержат в значительном количестве витамины группы В, РР и Е, а также все незаменимые аминокислоты.

Микробные культуры при их культивировании высокочувствительны к составу питательной среды. При удачном подборе всех компонентов по качественному и количественному составу, в частности набору аминокислот, среда обеспечивает достаточно быстрый рост и развитие популяции микроорганизмов и считается сбалансированной [6, 7]. В клеточном белке индивидуальные аминокислоты составляют 1-5% от всего белка, на основании чего можно приблизительно оценить количество аминокислот, необходимых в качестве факторов роста. Исключение составляет глутаминовая кислота и глутамин, которые количественно играют большую роль в аминокислотном метаболизме и содержание которых в среде должно значительно превышать содержание остальных аминокислот [8]. В таблице 1 приведен определенный нами аминокислотный состав отработанных пивных дрожжей различных фирм - производителей пива, а также образца коммерческого пептона, предназначенного для использования в составе некоторых питательных сред в микробиологии.

Как следует из данных таблицы 1, в составе отработанных пивных дрожжей в значительном количестве присутствует глутаминовая кислота, причем ее содержание в процентном отношении оказывается более высоким, чем в пептоне. Следует отметить также и более высокий уровень содержания по сравнению с пептоном и всех незаменимых аминокислот, что свидетельствует о более сбалансированном аминокислотном составе предложенного компонента питательной среды.

Предлагаемую питательную среду готовят следующим образом.

Для получения автолизата отработанные пивные дрожжи 7-8 генерации подвергают термической обработке при 100°С в течение часа.

К дрожжевому автолизату добавляют минеральные компоненты, доводят объем полученной смеси до 1 л водопроводной водой и автоклавируют. Вносят посевной материал (40 мл культуры бактерий Pseudomonas). Штамм выращивают в течение 48 часов при 28-30°С с постоянной аэрацией. Затем определяют в культуральной жидкости титр известным методом разведении [9].

Пример 1. Готовят питательную среду следующего состава. К 26,8 г дрожжевого автолизата добавляют 1,5 г К₂НРО₄ и 1,5 г MgSO₄·7H₂O, доводят объем полученной смеси до 1 л водопроводной водой и автоклавируют. Затем в питательную среду засевают 40 мл культуры бактерий Pseudomonas aureofaciens ИБ 51 [1]. Ферментацию осуществляют в течение 48 часов при 28-30°С при постоянной аэрации. Титр культуральной жидкости в конце ферментации составляет 5·10¹¹ КОЕ/мл.

При аналогичных условиях проводится культивирование штамма Pseudomonas aureofaciens ИБ 51 на известной среде Кинг В. Численность микроорганизмов по окончании процесса культивирования составила 3·10¹⁰ КОЕ/мл.

Пример 2. Питательную среду готовят вышеописанным способом по примеру 1 и засевают 40 мл культуры Pseudomonas putida ИБ 17 [2]. Ферментацию проводят аналогичным способом по примеру 1. Титр культуральной жидкости в конце ферментации составляет 5·10¹¹ КОЕ/мл.

При аналогичных условиях проводится культивирование штамма Pseudomonas putida ИБ 17 на известной среде Кинг В. Численность микроорганизмов по окончании процесса культивирования составила 6·10¹⁰ КОЕ/мл.

В таблице 2 приведены результаты культивирования бактерий рода Pseudomonas на среде Кинг В (по прототипу) и предлагаемой среде. Как видно, наиболее высокий титр бактерий рода Pseudomonas поддерживается в пробах, где питательная среда содержит вместо пептона и глицерина автолизат отработанных пивных дрожжей 7-8 генерации.

Пример 3. Проверка сохранения антагонистической активности штамма Pseudomonas aureofaciens ИБ 51, выращенного на предлагаемой среде.

На пластинки глюкозопептонного агара (глюкоза - 5 г, пептон - 5 г, агар - 15 г, К₂НРО₄ - 2 г, КН₂РО₄ - 4 г, вода дистиллированная - 1 л) высевают сплошным газоном суспензию спор грибного фитопатогена (Bipolaris sorokiniana). Затем на эти же пластинки уколом сажают бактерии штамма Pseudomonas aureofaciens ИБ 51, выращенные на предлагаемой среде. Чашки инкубируют при 28°С в течение 3-х суток.

Учет антагонистической активности проводят по среднему диаметру зоны отсутствия или подавления роста тест-гриба вокруг колонии штамма. Для Bipolaris sorokiniana он составил 55 мм.

При аналогичных условиях производят учет антагонистической активности штамма Pseudomonas aureofaciens ИБ 51, культивирование которого происходило на известной среде Кинг В. Средний диаметр зоны подавления роста гриба составил 55 мм.

Пример 4. Проверку сохранения и учет антагонистической активности штамма Pseudomonas putida ИБ 17, выращенного на предлагаемой среде, проводят вышеописанным способом по примеру 3. Средний диаметр зоны подавления роста тест-гриба составил 22 мм.

При аналогичных условиях проводят учет антагонистической активности штамма Pseudomonas putida ИБ 17, культивирование которого производилось на известной среде Кинг В. Средний диаметр зоны подавления роста гриба составил 22 мм.

Результаты приведены в таблице 2 и свидетельствуют о сохранении антагонистического действия штаммов бактерий рода Pseudomonas, выращенных на предлагаемой среде, на тест-культуру фитопатогенного гриба Bipolaris sorokiniana.

Таким образом, применение предлагаемой питательной среды, содержащей в качестве источника аминокислот автолизат отработанных пивных дрожжей 7-8 генерации, для культивирования бактерий рода Pseudomonas, обладающих антагонистической активностью по отношению к грибным фитопатогенам, позволяет существенно снизить себестоимость биопрепаратов на основе этих микроорганизмов и повысить выход биомассы.

Литература

1. Патент РФ 2203945, 7 С12N 1/20, А01N 63/00 // (С12N 1/20, С12R 1:38). Штамм бактерий Pseudomonas aureofaciens для получения препарата против заболеваний пшеницы, вызываемых грибными фитопатогенами. / Логинов О.Н., Свешникова Е.В., Силищев Н.Н., Мелентьев А.И., Галимзянова Н.Ф., Бойко Т.Ф.; заявлено 17.08.2001; опубл. 10.05.2003. Бюл.13.

2. Патент РФ 2213774, 7 С12N 1/20 // (С12N 1/20, С12R 1:40). Штамм бактерий Pseudomonas putida для получения препарата против заболеваний пшеницы, вызываемых грибными фитопатогенами. / Логинов О.Н., Свешникова Е.В., Силищев Н.Н., Мелентьев А.И., Галимзянова Н.Ф., Бойко Т.Ф., Исаев Р.Ф.; заявлено 25.03.2002; опубл. 10.10.2003. Бюл.28.

3. Патент РФ 2130265, 6 А01N 63/00 // (А01С 1/00). Способ борьбы с возбудителями заболеваний растений. / Дашкевич B.C., Дашкевич Н.Ю., Ашмарина Л.Ф., Шушаро А.И., заявлено 29.12.97; опубл. 20.05.99. Бюл.14.

4. King E.O., Ward M.K., Raney D.E. Two simple media for the demonstration of pyocyanin and fluorescin. // J.Lab. Clin. Med. - 1954. - V.44. - P.301-307.

5. Смирнов В.В., Киприанова Е.А. Бактерии рода Pseudomonas. Киев, «Наукова думка», 1990. - С.222.

6. Гуревич Ю.Л. Устойчивость и регуляция размножения в микробных популяциях. - Новосибирск, Наука, 1984. - С.28-29.

7. Манаков М.Н., Победимский Д.Г. Теоретические основы микробиологических производств. - М.: Агропромиздат, 1990. - С.180-181.

8. Перт С.Дж. Основы культивирования микроорганизмов и клеток. М.: Мир, 1978. - С.147-148.

9. Теппер Е.З., Шильникова В.К., Переверзева Г.И. Практикум по микробиологии. - М.: Дрофа, 2004. - 256 с.

Таблица 1Аминокислотный состав пептона и отработанных дрожжей различных пивоваренных производств Отработанные дрожжи (Уфа, Efes)Отработанные дрожжи (Стерлитамак, Шихан-Хайнекен)Отработанные дрожжи (Новотроицк, ПИТ)пептонТреонин5,56%5,45%5,25%2,09%Валин4,67%4,34%5,34%2,22%Метионин1,83%1,85%2,00%0,96%Изолейцин5,22%4,50%5,30%1,81%Лейцин6,93%6,31%7,03%2,98%Тирозин4,28%3,72%4,44%0,78%Фенилаланин4,97%4,86%5,37%2,34%Лизин11,07%10,57%11,71%4,85%Цистин1,24%1,72%1,55%0,23%Серин5,35%5,86%5,87%3,50%Глутаминовая к-та15,20%13,70%13,40%11,35%Пролин5,40%6,23%4,87%14,46%Глицин5,78%5,33%5,36%27,33%Аланин8,37%7,42%7,80%8,97%Гистидин3,34%2,00%3,47%0,75%Аргинин0,79%6,54%1,09%9,52%Аспарагиновая к-та10,00%9,60%10,15%5,86%

Таблица 2Численность и антагонистическое действие бактерий рода Pseudomonas, полученных при культивировании на различных питательных средахПитательная средаPseudomonas aureofaciens ИБ 51Pseudomonas putida ИБ 17Численность, КОЕ/млДиаметр зоны подавления роста тест-гриба, ммЧисленность, КОЕ/млДиаметр зоны подавления роста тест-гриба, ммПредлагаемая5·10¹¹555·10¹¹22Кинг В3·10¹⁰556·10¹⁰22

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при культивировании бактерий Pseudomonas. Питательная среда содержит в качестве источника аминокислот автолизат отработанных дрожжей 7-8 генерации, К₂НРО₄, MgSO₄×7Н₂О и водопроводную воду. Изобретение позволяет увеличить выход биомассы бактерий рода Pseudomonas. 2 табл.

Питательная среда для культивирования бактерий рода Pseudomonas, используемых для получения антифунгальных препаратов, содержащая источник аминокислот, К₂НРО₄, MgSO₄·7Н₂О и воду, отличающаяся тем, что в качестве источника аминокислот она содержит автолизат отработанных пивных дрожжей 7-8 генерации, а воды - воду водопроводную при следующем соотношении компонентов, г/л:

автолизат отработанных пивных дрожжей (по сухому веществу)26,8К₂НРО₄1,5MgSO₄·7H₂О1,5вода водопроводнаядо 1 л