ШТАММ БИФИДОБАКТЕРИЙ Bifidobacterium infantis 73-15-МБ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ КИСЛО-МОЛОЧНЫХ, НЕФЕРМЕНТИРОВАННЫХ ПРОДУКТОВ, БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ДОБАВОК, БИФИДОСОДЕРЖАЩИХ ПРЕПАРАТОВ, КОСМЕТИЧЕСКИХ И ГИГИЕНИЧЕСКИХ СРЕДСТВ Российский патент 2005 года по МПК C12N1/20 A61K35/74 A61K7/00 A61K7/42 A23C9/12 A23L1/29 

Изобретение относится к биотехнологии, пищевой промышленности и может быть использовано в производстве продуктов функционального питания, неферментированных продуктов, биологически активных добавок, фармпрепаратов, при приготовлении косметических и гигиенических средств.

Известен штамм Bifidobacterium infantis 79-43, используемый для получения бифидосодержащих препаратов эубиотиков и продуктов лечебно-диетического питания. Штамм проявляет высокие технологические способности, активно наращивает микробную массу на питательных средах, принятых в производстве бактерийных препаратов за 16-24 ч культивирования с содержанием микробных клеток lg 7,88-8,03, обладает кислотообразующими и ингибирующими свойствами в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, устойчив к ряду антибиотиков (RU 2111248 С1, 20.05.1998).

В качестве ближайшего аналога предлагаемого изобретения выбран штамм Bifidobacterium infantis 73-15. Штамм выделен из содержимого кишечника здорового грудного ребенка, хранится в лиофилизированном состоянии и депонирован под №155 в Государственной коллекции микроорганизмов - представителей нормальной микрофлоры человека (ГНКМ) Московского НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н.Габричевского. Характерной особенностью штамма является его способность активно размножаться на питательных средах, принятых в производстве бактерийных препаратов с высоким содержанием микробных клеток за 16-24 ч культивирования с образованием сгустка нежной консистенции. Штамм энергичный кислотообразователь. Кислотообразующая активность: к 16 ч - 143°Т, к 24 ч - 167°Т на гидролизатно-молочной среде, на стерильном молоке - до 82°Т и 95°Т соответственно (RU 2112034 С1, 10.05.1997).

Известный штамм недостаточно устойчив к повреждающим факторам агрессивных сред гастроинтестинального тракта (кислот, протеолитических ферментов) при прохождении бифидобактерий штамма в желудочно-кишечном тракте, что указывает на недостаточную его колонизирующую активность при прохождении пищеварительного тракта.

Задачей предлагаемого изобретения является выявление штамма Bifidobacterium infantis 73-15-МБ, обладающего высокой кислотообразующей способностью, устойчивостью к широкому спектру антибиотиков, выраженной антагонистической и антиоксидантной активностью, биологической активностью, высокой жизнеспособностью и колонизирующими свойствами, что обеспечивает получение продуктов функционального питания, продуктов на его основе и бактериальных препаратов с высокими пробиотическими и лечебно-профилактическими свойствами.

Штамм В.infantis 73-15-МБ, получен из коллекционного штамма В.infantis 73-15 путем последовательных циклов лиофилизационной сушки и восстановления на питательной тиогликолевой среде (50 циклов сушка-восстановление). Отбирали клоны по признаку максимального накопления биомассы бифидобактерий в стерильном обезжиренном молоке к 14-18 ч культивирования не менее lg 9, а также выраженной антибиотической и антиоксидантной активностью: супероксиддисмутазная активность штамма не ниже 25,9 ед/мг белка микробной массы.

В результате проведенной селекции получен штамм В.infantis 73-15-МБ, который депонирован и хранится во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов "ВНИИГенетика" за номером ВКПМ Ас-1692 и характеризуется следующими признаками.

Культурально-морфологические признаки.

Клетки представляют собой грамположительные полиморфные палочки с бифуркацией или утолщением на 1-2 концах, склонные к образованию скоплений. В печеночной среде Блаурокка штамм образует колонии в виде комет. Логарифмическая фаза роста заканчивается к 24 ч. В жидких питательных средах растет по всей высоте объема, кроме зоны аэробиоза.

Физиолого-биохимические признаки.

Неподвижный, бесспорный облигатный анаэроб. Оптимальная температура выращивания 37,5-38,0°С, рН питательных сред 7,2-7,4. Каталазу не образует, желатину не разжижает. Сбраживает глюкозу с образованием уксусной и L(+)-изомера молочной кислоты без образования газа, закисляя среду выращивания до рН 4,1. Ферментирует лактозу, ксилозу, маннозу, вариабельно - маннит, инулин, не сбраживает арабинозу, целлобиозу, салицин, сорбит.

Сквашивает стерильное молоко к 14-20 ч с образованием плотного сгустка.

Кислотообразующая активность: при культивировании на стерильном обезжиренном молоке титруемая кислотность достигает к 16 ч - 100°Т, к 20 ч - 160°Т, к 24 ч - 180°Т. Штамм максимально накапливает микробную массу бифидобактерий к 16 ч культивирования, достигая в 1 мл 8,3 lg КОЕ/см³ микробных клеток, максимально накапливает микробную массу бифидобактерий на тиогликолевой среде и кукурузно-лактозной среде к 20 ч культивирования, соответственно 2×10⁸ КОЕ/см³, но к 24 ч уже наблюдалось отмирание клеток.

Штамм растет на общепринятых в производстве питательных средах с накоплением биомассы не менее lg 8-9 микробного числа за 18-22 ч культивирования.

Антагонистические свойства, устойчивость к антибиотикам.

Штамм устойчив к антибиотикам: канамицину, линкомицину, амикоцину, ампициллину, бензилпенициллину, стрептомицину, тетрациклину, гентамицину, а также к сульфадимезину (таблица 1).

Определение уровня устойчивости штамма к антибиотикам проводили по методу серийных разведении в жидкой питательной среде - стерильном обезжиренном молоке. В питательную среду вводили различные концентрации стерильных растворов антибиотиков и 16-часовую культуру бифидобактерий в количестве 5%. Устойчивость определяли по изменению титруемой кислотности в образцах после 48 ч инкубирования при 37-38°С.

Таблица 1

Антибиотическая устойчивость штамма В. infantis 73-15-МБ

Антибиотики, единицы измерения активности, мкг/см³ДозаТитруемая кислотность молока после культивирования со штаммом, °ТАмпициллин25057-63Бензилпенициллин, ЕД/см³1000084-88Канамицин сульфат20120-124Линкомицин2577-79Стрептомицин1062-66Амикоцин сульфат1068-73Олеандомицин12,546-50Тетрациклин1044-48

Полученные данные свидетельствуют о том, что штамм В.infantis 73-15-МБ устойчив к наибольшим концентрациям следующих антибиотиков: к амикоцину, ампициллину, бензилпенициллину, канамицину, линкомицину, стрептомицину, тетрациклину, олеандомицину.

Штамм обладает выраженной антагонистической активностью к патогенным и условно патогенным микроорганизмам: Е.coli, S.aureus, Candida albikans, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Klebsiella pneumoniae, Shigella sonnei, Citrobacter freundii, Bacillus subtilis, которые наиболее часто являются причиной пищевых отравлений, возникающих при потреблении кисло-молочных продуктов (таблица 2).

Таблица 2

Сравнительные данные антагонистической активности штамма В.infantis 73-15-МБ и В.infantis 73-15

ШтаммЗоны задержки роста тест-культур (мм)бифидобактерийSh.SonneiSh.FlexneriE.coliS.aureusPr.vulgarisВ.infantis 73-1511121612,5716,5В.infantis 73-15-МБ11,611,91712,616,9

Анализ данных таблицы показывает, что заявляемый штамм обладает более высокой антагонистической активностью по отношению к основным тест-культурам.

У заявляемого штамма обнаружена выраженная антиоксидантная активность: супероксиддисмутазная активность штамма - 25,9+2,0 ед/мг белка микробной массы. Условия хранения заявляемого штамма.

Свежеприготовленный штамм В.infantis 73-15-МБ хранят на питательной среде с массовой долей сухих веществ 14-16% с добавлением защитной среды, содержащей сахарозу, желатозу, лимоннокислый натрий, высушивают сублимационным способом в ампулах. Штамм хорошо хранится при 6-8°С без потери титра активности в течение года.

Основным производственно-полезным признаком штамма В.infantis 73-15-МБ, отличающим его от штамма В.infantis 73-15, является то, что выращенная в стационарных условиях в стерильном обезжиренном молоке культура обладает выраженной супероксиддисмутазной активностью. СОД-активность штамма В. infantis 73-15-МБ составляет 25,9 ед/мг белка, содержащегося в микробной массе.

Выявленная СОД-активность культуры бифидобактерий свидельствует о том, что штамм обладает выраженным пробиотическим действием, которое может проявляться в условиях как in vivo, так и in vitro. Высокая активность кислотообразования, устойчивость штамма к основным антибиотикам способствует эффективному восстановлению нормальной микрофлоры кишечника уже в процессе антибиотикотерапии.

Заявляемый штамм может быть использован в качестве биологически активного начала пробиотической направленности при производстве различных форм бактерийных препаратов, биологически активных добавок к пище, кисло-молочных продуктов, неферментированных пищевых продуктов, в приготовлении косметических и гигиенических средств. При этом повышается биологическая ценность продуктов функционального питания и препаратов, приготовляемых на его основе. Употребление в пищу продуктов, использующих заявленный штамм, способствует колонизации слизистой кишечника, вытеснению патогенной и условно патогенной микрофлоры, коррегированию кишечного дисбактериоза и способствует восстановлению бифидофлоры.

Установлено, что штамм В.infantis 73-15-МБ не является бактериогенным и не обладает бактериоциноустойчивостью к штаммам бифидобактерий вида В.bifidum и В.longum, что позволяет использовать его при совместном культивировании в заквасках, в составе комплексного бакпрепарата или консорциума бифидобактерий.

Использование заявленного штамма в производстве кисло-молочных, неферментируемых продуктов, биологически активных добавок, бифидосодержащих препаратов, косметических и гигиенических средств, например: кремов, салфеток, лосьонов, тампонов, питательных масок, женских прокладок, мыла, косметического молока и т.п., обеспечивает пробиотический и бактериологический эффект, способствует восстановлению нормальной микрофлоры, кожных и слизистых покровов, а также направлено на расширение арсенала аналогичных средств.

Пример 1. Использование штамма В.infantis 73-15-МБ в составе заквасок для приготовления кисло-молочных продуктов.

1-ый пассаж - Лиофилизированный штамм бифидобактерий в количестве 0,1 г (1 доза) сухой биомассы титруют методом десятикратных разведении до 10^-9 и выращивают при 37,5-38°С до появления отдельных колоний в последних разведениях. Или 1 дозу сухой биомассы вносят в емкость с питательной средой и выращивают до появления отдельных колоний в последних разведениях. Или 1 дозу сухой биомассы штамма вносят в емкость с питательной средой и выращивают до получения биомассы с содержанием клеток не менее 10⁸/мл.

2-ой пассаж - Выросшую культуру объемом не более 10% вносят в среду выращивания и культивируют до получения биомассы с содержанием микробных тел не менее 10⁸/мл.

3-ий пассаж - (продукт) Полученную биомассу в объеме не более 5% вносят в стерильное молоко и культивируют до образования сгустка, который разливают в емкости и охлаждают. Полученный продукт содержит в 1 мл не менее 10⁸ живых бифидобактерий.

Пример 2. Использование штамма В.infantis 73-15-МБ в составе биологически активной добавки.

1-ый пассаж - Лиофилизированный штамм активизируют путем посева в питательную среду и выращивают при 37-38,5°С до получения биомассы с содержанием клеток не менее 10⁸/мл.

2-ой пассаж - Выросшую культуру в объеме не более 10% вносят в питательную среду и культивируют до получения биомассы с количеством клеток не менее 10⁸/мл.

3-пассаж - Полученную маточную культуру в количестве не более 5% вносят в питательную среду и выращивают при 37,5-38°С.

Получение биологически активной добавки - Выросшая биомасса представляет собой жидкий концентрат с высоким, не менее 10⁸/мл титром бифидобактрий. В концентрат можно вносить различные бифидогенные факторы, способствующие стабилизации свойств культуры и лучшей приживляемости штамма в организме. Концентрат, разлитый в емкости, можно непосредственно использовать в качестве биологически активной добавки лечебно-профилактического действия. Можно получить сухую биологическую активную добавку, для этого к биомассе 3-его пассажа добавляют защитные среды высушивания (сахарозожелатиновую, обезжиренное молоко), суспензию замораживают при температуре не менее -45°С, лиофилизируют, укупоривают и получают сухой концентрат с содержанием бифидобактерий не менее 10⁷/мл, который можно использовать в качестве биологической добавки, внося ее в пищевом сырье непосредственно перед употреблением.

Пример 3. Использование штамма В.infantis 73-15-МБ для получения бифидосодержащего препарата.

1-ый пассаж - Лиофилизированный штамм активизируют путем посева в питательную среду и выращивают при 37-38,5°С до получения биомассы с содержанием клеток не менее 10⁸/мл.

2-ой пассаж - Выросшую культуру в объеме не более 10% вносят в питательную среду и культивируют до получения биомассы с количеством клеток не менее 10⁸/мл.

3-пассаж - Полученную маточную культуру в количестве не более 5% вносят в питательную среду и выращивают при 37,5-38°С.

Получение бифидосодержащего препарата - Выросшая биомасса представляет собой жидкий концентрат с высоким, не менее 10⁸/мл титром бифидобактрий. К биомассе 3-его пассажа добавляют защитные среды высушивания (сахарозожелатиновую, обезжиренное молоко), суспензию замораживают при температуре не менее -45°С, лиофилизируют, укупоривают и получают сухой концентрат с содержанием бифидобактерий не менее 10⁸/мл, который можно использовать в качестве бифидосодержащего препарата.

Пример 4. Использование штамма В.infantis 73-15-МБ для получения кваса или сока.

1-ый пассаж - Лиофилизированный штамм в количестве 0,1 г сухой биомассы активизируют путем посева в питательную среду. Выращивают при 37,5-38°С до получения биомассы с содержанием микробных клеток не менее 10⁸/мл.

2-ой пассаж - Выросшую культуру в объеме не более 10% вносят в питательную среду и культивируют до получения биомассы с содержанием клеток не менее 10⁸/мл.

3-ий пассаж (получение продукта) - Выросшую биомассу в объеме не более 5% вносят в хлебный квас или сок после их пастеризации из расчета, чтобы содержание бифидобактерий в 1 мл кваса или сока составило не менее 10⁸. Квас или сок охлаждают и употребляют без последующего брожения.

Пример 5. Использование штамма В.infantis 73-15-МБ для получения косметического средства.

1-ый пассаж - Лиофилизированный штамм в количестве 0,1 г сухой биомассы активизируют путем посева в питательную среду. Выращивают при 37,5-38°С до получения биомассы с содержанием микробных клеток не менее 10⁸/мл.

2-ой пассаж - Выросшую культуру в объеме не более 10% вносят в питательную среду и культивируют до получения биомассы с содержанием клеток не менее 10⁸/мл.

3-ий пассаж (получение косметического средства) - Выросшую биомассу в объеме не более 5% вносят в биореактор с тиогликолевой средой и инкубируют при 37,5-38°С при слабом перемешивании до достижения титра бифидобактерий 10⁹ клеток/мл. Впоследствии полученную суспензию клеток разрушают нагреванием в автоклаве. Полученную взвесь биологически активных компонентов охлаждают и смешивают с кремовой основой в соотношении 1:2-1:20 в зависимости от назначения изготовляемого крема.

Изобретение относится к биотехнологии, пищевой и медицинской промышленности и может быть использовано в производстве продуктов функционального питания пробиотического назначения, гигиенических и косметических средств. Штамм Bifidobacterium infantis 73-15-МБ получен путем последовательных циклов лиофилизационной сушки и восстановления на питательной тиогликолевой среде (50 циклов сушка-восстановление). Отбирали клоны по признаку максимального накопления биомассы бифидобактерий в стерильном обезжиренном молоке к 16 ч культивирования не менее lg 9, а также с выраженной антиоксидантной активностью: супероксиддисмутазная активность штамма не ниже 25,9 ед/мг белка микробной массы. Штамм депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов "ВНИИГенетика" за номером ВКПМ Ас-1692. Штамм активно размножается в питательных средах с накоплением необходимого титра жизнеспособных бактерий, обладает высокой кислотообразующей способностью и антагонистической активностью в отношении патогенной и условно патогенной микрофлоры, проявляет выраженную антиоксидантную активность. Супероксиддисмутазная активность культуры свидетельствует о выраженном пробиотическом действии, проявляемом в условиях in vivo и in vitro. Использование штамма в производстве кисло-молочных, неферментированных продуктов, биологически активных добавок, бифидосодержащих препаратов, косметических и гигиенических средств обеспечивает пробиотический и бактериологический эффект, способствует восстановлению нормальной микрофлоры, кожных и слизистых покровов, а также направлено на расширение арсенала аналогичных средств. 2 табл.

Штамм бифидобактерий Bifldobacterium infantis 73-15-МБ, ВКПМ Ac-1692, используемый для приготовления кисло-молочных, неферментированных продуктов, биологически активных добавок, бифидосодержащих препаратов, косметических и гигиенических средств.