Изобретение относится к биотехнологии, пищевой промышленности и может быть использовано в производстве продуктов функционального питания, неферментированных продуктов, биологически активных добавок, фармпрепаратов, при приготовлении косметических и гигиенических средств.
Широкий ассортимент биологически активных и технологичных штаммов бифидобактерий дает возможность разрабатывать новые моно- и комплексные продукты функционального питания, лечебного питания и бакпрепараты, способные обеспечивать высокую колонизационную резистентность кишечника человека, восстанавливать его нормальную микрофлору, снижать заболеваемость различными кишечными инфекциями.
На настоящий момент разработан ряд бактерийных препаратов и продуктов лечебно-диетического питания, биологически активных добавок, неферментированных пищевых продуктов на основе отечественных штаммов бифидобактерий Bifidobacterium breve 79-88, В breve 79-119 (RU 2176270 C1, 27.11.2001, RU 2078815 С1, 10.05.1997).
Качество продуктов функционального питания и бакпрепаратов обусловлено свойствами штамма-продуцента, его специфической активностью и производственно-ценными свойствами.
Известный штамм Bifidobacterium breve 79-119, используемый для приготовления лечебно-профилактических бифидосодержащих препаратов, кисломолочных, неферментированных пищевых продуктов и биологически активных добавок, является наиболее близким аналогом к заявленному штамму. Штамм выделен из содержимого кишечника здорового грудного ребенка в 1979 г., хранится в лиофилизированном состоянии и депонирован под №153 в Государственной коллекции микроорганизмов - представителей нормальной микрофлоры человека (ГНКМ) Московского НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского. Характерной особенностью штамма является его способность активно размножаться на питательных средах, принятых в производстве бактерийных препаратов с высоким содержанием микробных клеток за 16-24 ч культивирования с образованием сгустка нежной консистенции. Штамм энергичный кислотообразователь. Кислотообразующая активность: к 16 ч - 156°Т, к 24 ч - 164°Т на гидролизатно-молочной среде, на стерильном молоке - до 114°Т и 120°Т соответственно (RU 2078814 С1, 10.05.1997).
Известный штамм недостаточно устойчив к повреждающим факторам агрессивных сред гастроинтестинального тракта (кислот, протеолитических ферментов) при прохождении бифидобактерий штамма в желудочно-кишечном тракте, что указывает на недостаточную его колонизирующую активность при прохождении пищеварительного тракта.
Задачей предлагаемого изобретения является выявление штамма Bifidobacterium breve 79-119-МБ, обладающего высокой кислотообразующей способностью, устойчивостью к широкому спектру антибиотиков, выраженной антагонистической и антиоксидантной активностью, биологической активностью, высокой жизнеспособностью и колонизирующими свойствами, что обеспечивает получение продуктов функционального питания, продуктов на его основе и бактериальных препаратов с высокими пробиотическими и лечебно-профилактическими свойствами.
Штамм В.breve 79-119-МБ получен из коллекционного штамма В.breve 79-119М путем последовательных циклов лиофилизационной сушки и восстановления на питательной тиогликолевой среде (50 циклов сушка-восстановление). Отбирали клоны по признаку максимального накопления биомассы бифидобактерий в стерильном обезжиренном молоке к 16 ч культивирования не менее lg 9, а также с выраженной антибиотической и антиоксидантной активностью: супероксиддисмутазная активность штамма не ниже 22,2 ед/мг белка.
В результате проведенной селекции получен штамм В breve 79-119-МБ, который депонирован и хранится во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов "ВНИИГенетика" за номером ВКПМ Ас-1691 и характеризуется следующими признаками:
Культурально-морфологические признаки.
Клетки представляют собой грамположительные полиморфные палочки, изящные, с У-образными раздвоениями на одном или двух концах; неподвижные, склонные к образованию скоплений. В печеночной среде Блаурокка образует колонии в виде комет. Логарифмическая фаза роста заканчивается к 24 ч. В жидких питательных средах растет по всей высоте объема, кроме зоны аэробиоза.
Физиолого-биохимические признаки.
Облигатный анаэроб, оптимальная температура выращивания 37,5-38,0°С, рН 7,2-7,4. Каталазу не образует, желатину не разжижает. Сбраживает глюкозу с образованием уксусной и L(+)-изомера молочной кислоты без образования газа, закисляя среду выращивания до 4,1. Ферментирует лактозу, маннозу, целлобиозу, салицин, не ферментирует арабинозу, ксилозу, инулин, маннит, сорбит. Сбраживает молоко с образованием к 16-24 ч плотного сгустка.
Кислотообразующая активность: при культивировании на стерильном обезжиренном молоке титруемая кислотность достигает к 16 ч - 134°Т, к 20 ч - 148°Т, к 24 ч - 164°Т. Штамм максимально накапливает микробную массу бифидобактерий к 16 ч культивирования, достигая в 1 мл 8,3 lg 9 микробных клеток; максимально накапливает микробную массу бифидобактерий в стерильном обезжиренном молоке без ростовых факторов через 24 ч культивирования - 1-3 lg 9.
Штамм растет на общепринятых в производстве питательных средах с накоплением биомассы не менее lg 8-9 микробного числа за 18-22 ч культивирования.
Антагонистические свойства, устойчивость к антибиотикам:
Штамм устойчив к антибиотикам: канамицину, линкомицину, амикоцину, ампициллину, бензилпенициллину, стрептомицину, а также к сульфадимезину (таблица 1).
Определение уровня устойчивости штамма к антибиотикам проводили по методу серийных разведений в жидкой питательной среде - стерильном обезжиренном молоке. В питательную среду вводили различные концентрации стерильных растворов антибиотиков и 16-часовую культуру бифидобактерий в количестве 5%. Устойчивость определяли по изменению титруемой кислотности в образцах после 48 ч инкубирования при 37-38°С.
Полученные данные свидетельствуют о том, что штамм В.breve 79-119-МБ устойчив к наибольшим концентрациям следующих антибиотиков: к амикоцину, ампициллину, бензилпенициллину, канамицину, линкомицину, стрептомицину.
Штамм обладает выраженной антагонистической активностью к патогенным и условно патогенным микроорганизмам: Е.coli, S.aureus, Candida albikans, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Klebsiella pneumoniae, Shigella sonnei, Citrobacter freundii, Bacillus subtilis, которые наиболее часто являются причиной пищевых отравлений, возникающих при потреблении кисломолочных продуктов (таблица 2).
Сравнительные данные антагонистической активности штамма В.breve 79-119-МБ и B.breve 79-119
Анализ данных таблицы показывает, что заявляемый штамм обладает более высокой антагонистической активностью по отношению к основным тест-культурам.
У заявляемого штамма обнаружена выраженная антиоксидантная активность: супероксиддисмутазная активность штамма - 22,2 ед/мг белка микробной массы.
Условия хранения заявляемого штамма.
Свежеприготовленный штамм В.breve 79-119-МБ хранят на питательной среде с массовой долей сухих веществ 14-16% с добавлением защитной среды, содержащей сахарозу, желатозу, лимоннокислый натрий, высушивают сублимационным способом в ампулах. Штамм хорошо хранится при 6-8°С без потери титра активности в течение года.
Основным производственно-полезным признаком штамма В.breve 79-119-МБ, отличающим его от штамма В.breve 79-119, является то, что выращенная в стационарных условиях в стерильном обезжиренном молоке культура обладает выраженной супероксиддисмутазной активностью: СОД-активность штамма В.breve 79-119-МБ составляет 22,2±1,8 ед/мг белка, содержащегося в микробной массе.
Выявленная СОД-активность культуры бифидобактерий свидетельствует о том, что штамм обладает выраженным пробиотическим действием, которое может проявляться в условиях in vivo, так и in vitro. Высокая активность кислотообразования, устойчивость штамма к основным антибиотикам, способствует эффективному восстановлению нормальной микрофлоры кишечника уже в процессе антибиотикотерапии.
Заявляемый штамм может быть использован в качестве биологически активного начала пробиотической направленности при производстве различных форм бактерийных препаратов, биологически активных добавок к пище, кисломолочных продуктов, неферментированных пищевых продуктов, в приготовлении косметических и гигиенических средств. При этом повышается биологическая ценность продуктов функционального питания и препаратов, приготовляемых на его основе. Употребление в пищу продуктов, использующих заявленный штамм, способствует колонизации слизистой кишечника, вытеснению патогенной и условно патогенной микрофлоры, коррегированию кишечного дисбактериоза, и способствует восстановлению бифидофлоры.
Установлено, что штамм В.breve 79-119-МБ не является бактериогенным и не обладает бактериоциноустойчивостью к штаммам бифидобактерий вида В.bifidum, что позволяет использовать его при совместном культивировании в заквасках, в составе комплексного бакпрепарата или консорциума бифидобактерий.
Использование заявленного штамма в производстве кисломолочных, неферментированных продуктов, биологически активных добавок, бифидосодержащих препаратов, косметических и гигиенических средств, например: кремов, салфеток, лосьонов тампонов, питательных масок, женских прокладок, мыла, косметического молока и т.п., обеспечивает пробиотический и бактериологический эффект, способствует восстановлению нормальной микрофлоры, кожных и слизистых покровов, а также направлено на расширение арсенала аналогичных средств.
Пример 1. Использование штамма B.breve 79-119-МБ в составе заквасок для приготовления кисломолочных продуктов.
1-й пассаж. Лиофилизированный штамм бифидобактерий в количестве 0,1 г (1 доза) сухой биомассы титруют методом десятикратных разведений до 10-9 и выращивают при 37,5-38°С до появления отдельных колоний в последних разведениях. Или 1 дозу сухой биомассы вносят в емкость с питательной средой и выращивают до появления отдельных колоний в последних разведениях. Или 1 дозу сухой биомассы штамма вносят в емкость с питательной средой и выращивают до получения биомассы с содержанием клеток не менее 108/мл.
2-й пассаж. Выросшую культуру объемом не более 10% вносят в среду выращивания и культивируют до получения биомассы с содержанием микробных тел не менее 108/мл.
3-й пассаж (продукт). Полученную биомассу в объеме не более 5% вносят в стерильное молоко и культивируют до образования сгустка, который разливают в емкости и охлаждают. Полученный продукт содержит в 1 мл не менее 108 живых бифидобактерий.
Пример 2. Использование штамма B.breve 79-119-МБ в составе биологически активной добавки.
1-й пассаж. Лиофилизированный штамм активизируют путем посева в питательную среду и выращивают при 37-38,5°С до получения биомассы с содержанием клеток не менее 108/мл.
2-й пассаж. Выросшую культуру в объеме не более 10% вносят в питательную среду и культивируют до получения биомассы с количеством клеток не менее 108/мл.
3-й пассаж. Полученную маточную культуру в количестве не более 5% вносят в питательную среду и выращивают при 37,5-38°С.
Получение биологически активной добавки. Выросшая биомасса представляет собой жидкий концентрат с высоким, не менее 108/мл, титром бифидобактрий. В концентрат можно вносить различные бифидогенные факторы, способствующие стабилизации свойств культуры и лучшей приживляемости штамма в организме. Концентрат, разлитый в емкости, можно непосредственно использовать в качестве биологически активной добавки лечебно-профилактического действия. Можно получить сухую биологическую активную добавку, для этого к биомассе 3-го пассажа добавляют защитные среды высушивания (сахарозожелатиновую, обезжиренное молоко), суспензию замораживают при температуре не менее -45°С, лиофилизируют, укупоривают и получают сухой концентрат с содержанием бифидобактерий не менее 108/мл, который можно использовать в качестве биологической добавки, внося ее в пищевом сырье непосредственно перед употреблением.
Пример 3. Использование штамма B.breve 79-119-МБ для получения бифидосодержащего препарата.
1-й пассаж. Лиофилизированный штамм активизируют путем посева в питательную среду и выращивают при 37-38,5°С до получения биомассы с содержанием клеток не менее 108/мл.
2-й пассаж. Выросшую культуру в объеме не более 10% вносят в питательную среду и культивируют до получения биомассы с количеством клеток не менее 108/мл.
3-й пассаж. Полученную маточную культуру в количестве не более 5% вносят в питательную среду и выращивают при 37,5-38°С.
Получение бифидосодержащего препарата. Выросшая биомасса представляет собой жидкий концентрат с высоким, не менее 108/мл, титром бифидобактрий. К биомассе 3-го пассажа добавляют защитные среды высушивания (сахарозожелатиновую, обезжиренное молоко), суспензию замораживают при температуре не менее -45°С, лиофилизируют, укупоривают и получают сухой концентрат с содержанием бифидобактерий не менее 108/мл, который можно использовать в качестве бифидосодержащего препарата.
Пример 4. Использование штамма B.breve 79-119-МБ для получения кваса или сока.
1-й пассаж. Лиофилизированный штамм в количестве 0,1 г сухой биомассы активизируют путем посева в питательную среду. Выращивают при 37,5-38°С до получения биомассы с содержанием микробных клеток не менее 108/мл.
2-й пассаж. Выросшую культуру в объеме не более 10% вносят в питательную среду и культивируют до получения биомассы с содержанием клеток не менее 108/мл.
3-й пассаж (получение продукта). Выросшую биомассу в объеме не более 5% вносят в хлебный квас или сок после их пастеризации из расчета, чтобы содержание бифидобактерий в 1 мл кваса или сока составило не менее 108. Квас или сок охлаждают и употребляют без последующего брожения.
Пример 5. Использование штамма B.breve 79-119-МБ для получения косметического средства.
1-й пассаж. Лиофилизированный штамм в количестве 0,1 г сухой биомассы активизируют путем посева в питательную среду. Выращивают при 37,5-38°С до получения биомассы с содержанием микробных клеток не менее 108/мл.
2-й пассаж. Выросшую культуру в объеме не более 10% вносят в питательную среду и культивируют до получения биомассы с содержанием клеток не менее 108/мл.
3-й пассаж (получение косметического средства). Выросшую биомассу в объеме не более 5% вносят в биореактор с тиогликолевой средой и инкубируют при 37,5-38°С при слабом перемешивании до достижения титра бифидобактерий 109 клеток/мл. Впоследствии полученную суспензию клеток разрушают нагреванием в автоклаве. Полученную взвесь биологически активных компонентов охлаждают и смешивают с кремовой основой в соотношении 1:2-1:20 в зависимости от назначения изготовляемого крема.
Изобретение относится к биотехнологии, пищевой и медицинской промышленности и может быть использовано в производстве продуктов функционального питания пробиотического назначения, гигиенических и косметических средств. Штамм Bifidobacterium breve 79-119-МБ получен путем последовательных циклов лиофилизационной сушки и восстановления на питательной тиогликолевой среде (50 циклов сушка-восстановление). Отбирали клоны по признаку максимального накопления биомассы бифидобактерий в стерильном обезжиренном молоке к 16 ч культивирования не менее lg 9, а также с выраженной антиоксидантной активностью: супероксиддисмутазная активность штамма не ниже 22,2 ед/мг белка микробной массы. Штамм депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов "ВНИИГенетика" за номером ВКПМ Ас-1691. Штамм активно размножается в питательных средах с накоплением необходимого титра жизнеспособных бактерий, обладает высокой кислотообразующей способностью и антагонистической активностью в отношении патогенной и условно патогенной микрофлоры, проявляет выраженную антиоксидантную активность. Супероксиддисмутазная активность культуры свидетельствует о выраженном пробиотическом действии, проявляемом в условиях in vivo и in vitro. Использование штамма в производстве кисломолочных, неферментированных продуктов, биологически активных добавок, бифидосодержащих препаратов, косметических и гигиенических средств, обеспечивает пробиотический и бактериологический эффект, способствует восстановлению нормальной микрофлоры, кожных и слизистых покровов, а также направлено на расширение арсенала аналогичных средств. 2 табл.
Штамм бифидобактерий Bifidobacterium breve 79-119-МБ, ВКПМ Ac-1691, используемый для приготовления кисло-молочных, неферментированных продуктов, биологически активных добавок, бифидосодержащих препаратов, косметических и гигиенических средств.
