СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ПРОСТЕЙШИХ В ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ Российский патент 2005 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству и гинекологии, паразитологии, гематологии, венерологии.

По данным литературы известны способы выявления клеток простейших из крови (Пяткин К.Д., Маркова Н.С., Трофимова Н.Д. Руководство к практическим занятиям по медицинской микробиологии. М.: Медицина, 1969, с.289-293). Сущность их в том, что после забора крови проводят ее центрифугирование, отделение осадка, изготовление мазков и их окрашивание.

Недостатком данных способов является то, что они не позволяют выявлять измененные и атипичные клетки простейших, в частности трихомонад, которые по морфологическому виду, принимая округлую или амебовидную форму, очень сходны с лимфоидными клетками крови.

Технический результат предлагаемого способа заключается в повышении точности выявления измененных и атипичных клеток простейших путем разрушения морфологически сходных с ними лимфоидных клеток.

Данный результат достигается тем, что в исследуемый материал вводят биологически активное вещество - протеолитический фермент пепсин (трипсин), разрушающий белковый компонент мембран лимфоидных клеток и эритроцитов периферической крови (Бырдаров С.В. Экспериментальная микробиология. София. "Медицина и физкультура", 1965, с.412-419).

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом. Кровь, взятую из вены пациента, не менее 2,0 мл смешивают с 15 Ед/мл гепарина. Затем кровь разливают в центрифужные пробирки, в количестве не более 1 мл в каждую. Пробы центрифугируют 20-30 минут при 3000 об/ мин. После образовавшуюся жидкую часть-плазму сливают, а осадок, содержащий форменные элементы крови, лимфоидные клетки и клетки простейших, в частности трихомонад, подвергают действию пепсина. Для этого пепсин добавляют в 1% концентрации в двойном количестве по отношению к образовавшемуся осадку. Раствор пепсина должен быть подогретым до температуры +37 градусов С. Это повышает активность действия фермента и лучшую сохранность клеток простейших. Далее полученную смесь осадка и фермента помещают в термостат для последующей инкубации при температуре +37 градусов С на 24-48 часов. Для повышения активного разрушения клеток крови через каждые 12 часов добавляют новую дозу фермента, предварительно слив старую. Фермент находится на поверхности осадка, диффундирует внутрь и разрушает клетки крови. Далее из обработанной таким образом смеси делают мазки на предметном стекле, высушивают на воздухе, фиксируют 3 минуты в 98% этаноле, снова высушивают и окрашивают 1% водным метиленовым синим в течение 1-2 мин. В исследуемом материале после инкубации в течение 24-48 часов сохраняются остатки клеток крови в виде обломков, среди которых хорошо заметны клетки трихомонад округлой или амебовидной формы.

Предлагаемый способ обеспечивает выявление измененных и атипичных - округлых и амебовидных, а также неправильных форм трихомонад, различных по размеру, путем разрушения морфологически сходных с ними клеток периферической крови.

Это происходит под действием пепсина или других протеолитических ферментов (трипсина), которые разрушают белково-липидную мембрану лимфоидных клеток и вызывают активный лизис эритроцитов, но клетки простейших - трихомонад сохраняются, так как их оболочка содержит антипротеолитические вещества (антитрипсин и другие), что обеспечивает устойчивость простейших к разрушительному действию ферментов.

Данный способ имеет большое значение при диагностике трихомониаза, когда инфекция находится в генерализованной форме, протекая асимптомно и латентно, а возбудитель имеет атипичную форму, которую трудно обнаружить при обычных микроскопических способах.

Эффективность метода дает возможность его широкого использования не только в научных исследованиях, но и в практическом здравоохранении врачами - лаборантами и биологами клинических лабораторий как достаточно дешевого и доступного.

Пример: больная В.Т.Н., возраст 53 года, поступила 25.02.03, выписана 28.03.03. Диагноз: Bl. ovarii sinistrae, 3 стадия, Т3 No Mo. Состояние после 4-х курсов химиотерапии, асцит, канцероматоз висцеральной и париетальной брюшины. Сопутствующие заболевания: Cr.gl. mammae, dextrae в 1998 году. Состояние после комплексного лечения. Трихомонадный кольпит. Операция 12.03.03. Ляпаротомия. Удаление левых придатков матки. Дренирование брюшной полости.

Производили забор крови из локтевой вены в количестве 5,0 мл, кровь смешивали с антикоагулянтом, далее пробы центрифугировали, сливали жидкую часть, а к полученному осадку добавляли двойное количество 1% раствора пепсина. После инкубирования в течение 24 часов из обработанной таким образом смеси делали мазки, высушивали на воздухе, фиксировали 3 минуты в 98% этаноле, снова высушивали и окрашивали 1% водным метиленовым синим в течение 1-2 мин. В приготовленных мазках среди обломков клеток крови грязно-сине-зеленого цвета хорошо заметны клетки трихомонад, имеющие размер лимфоцита, сине-зеленого цвета с ярко выраженной более интенсивно окрашенной оболочкой.

Изобретение относится к области медицины. Способ характеризуется тем, что кровь центрируют, к полученному осадку вводят биологически активное вещество, протеолитический фермент - пепсин (трипсин), осадок окрашивают 1% водным метиленовым синим и выявляют среди разрушенных клеток крови хорошо заметные округлые и амебовидные неправильной формы клетки трихомонад сине-зеленого цвета с ярко выраженной и более интенсивно окрашенной оболочкой. Изобретение обеспечивает повышение точности выявления измененных и атипичных клеток простейших путем разрушения морфологически сходных с ними лимфоидных клеток.

Способ выявления измененных и атипичных клеток трихомонад в периферической крови путем проведения окрашивания и микроскопирования, отличающийся тем, что кровь центрифугируют, к полученному осадку добавляют двойное количество 1%-ного раствора протеолитического фермента, затем осадок в виде мазков окрашивают 1%-ным водным метиленовым синим и среди разрушенных клеток крови выявляют хорошо заметные округлые и амебовидные неправильной формы клетки трихомонад сине-зеленого цвета с ярко выраженной и более интенсивно окрашенной оболочкой.