ВАКЦИННАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ТУБЕРКУЛЕЗНОЙ ИНФЕКЦИИ И ГЕНЕТИЧЕСКИЕ КОНСТРУКЦИИ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ДЕЙСТВУЮЩИХ КОМПОНЕНТОВ ЭТОЙ КОМПОЗИЦИИ Российский патент 2005 года по МПК A61K39/04 C12N15/63 C12N15/31 

Изобретение относится к области медицины, иммунологии, может быть использовано для лечения и профилактической вакцинации туберкулезной инфекции.

Исследования, проведенные Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ), показали, что проблема туберкулеза (ТБ) по-прежнему стоит чрезвычайно остро, о чем свидетельствует уровень инфицированности населения земного шара, составляющий свыше 1 миллиарда человек. Около 8 миллионов человек заболевают туберкулезом каждый год. При этом 44% болеют легочной формой этого заболевания. Около 2 млн. человек умирает ежегодно, что составляет 23% смертельных исходов в мировом масштабе и превышает 50% летальности в Африканских странах (Dye С., Scheele S., Dolin P., Pathania V. and Ravinglione M.С., 1999, JAMA, 282, 7, 677-686).

Проблема туберкулеза в глобальном масштабе становится еще более острой благодаря нескольким факторам, в числе которых появление полирезистентных штаммов M. tuberculosis. Анализ лекарственной устойчивости в 35 странах показал распространение приобретенной устойчивости к четырем анти-ТБ препаратам первого уровня: изониазиду, рифампину, этамбутолу и стрептомицину; с процентным распределением от 5.3% (Новая Зеландия) до 100% (Ивановская область, Россия) и средним уровнем 36% (Pablos-Mender A., Ravinglione M.С. et al., 1998, N.Eng.J.Med., 338,23,1641-1649).

Эпидемия синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД) еще более усложнила ситуацию с ТБ. По данным, опубликованным ВОЗ в 1997 году, 8% заболевших ТБ были инфицированы ВИЧ. У ВИЧ-инфицированных пациентов с ТБ инфекцией иммунодефицит ассоциирован с повышенной диссеминацией микобактерий и молниеносным течением заболевания. Комбинация ТБ и ВИЧ имеет очень плохой прогноз со средней продолжительностью выживания в течение двух месяцев (Ormerod L.P., Shaw R.J. and Mitchell D.M., 1994, Thorax, 49, 1, 1085-1089).

Для контроля за распространением ТБ и значительного снижения риска распространения этого заболевания необходимо создание эффективной вакцины и реагентов для специфичной диагностики. Единственная, имеющаяся в настоящее время, противотуберкулезная вакцина - это бацилла Кальметта Герена (bacillus Calmette Guerin-BCG) - БЦЖ, живой аттенуированный штамм вирулентной бычьей туберкулезной бациллы Mycobacterium bovis. На основании многообещающих результатов испытаний на животных моделях и испытаний на более чем трехстах детях с 1921 по 1924 гг. вакцина БЦЖ была внедрена в практику здравоохранения по всему миру в целях предотвращения распространения ТБ. С тех пор БЦЖ были вакцинированы несколько миллиардов человек. Хотя БЦЖ является наиболее распространенной вакциной в мире и действие ее направлено против самой главной причины смертности среди инфекционных заболеваний, она также является самой противоречивой вакциной. Оценки протективной активности БЦЖ по отношению к легочной форме ТБ варьируют от 0 до 80% (Fine P.E., 1995, Lancet, 346 (8986), 1339-1345). Более того, использование БЦЖ вакцины сопряжено с двумя дополнительными проблемами:

а) БЦЖ индуцирует реакцию гиперчувствительности замедленного типа (РГЗТ), которую невозможно отличить от заражения M.tuberculosis, и поэтому компрометирует применение туберкулиновой пробы в кожных тестах (PPD) для диагностики или в эпидемиологических целях,

б) БЦЖ, будучи живой вакциной, противопоказана для ВИЧ-инфецированных пациентов из опасения вызвать само заболевание (Lowrie D.В., Tascon R.E. and Silva С.L., 1995, Int.Arch. Allergy Immunol. 108 (4), 309-312).

По данным Центра по контролю за инфекционной заболеваемостью (Атланта, США) наблюдается вырождение штаммов M.bovis, используемых для промышленного получения БЦЖ. Утрата протективных свойств БЦЖ, по мнению экспертов, обусловлена многолетними лабораторными пассажами штаммов без надлежащего контроля за качественными характеристиками.

Контроль за распространением туберкулезной инфекции невозможен без надежной противотуберкулезной вакцины, лишенной вышеперечисленных недостатков.

Завершение исследований по определению нуклеотидной последовательности генома M.tuberculosis открыло новые возможности по идентифицикации антигенов M.tuberculosis, которые могут стать кандидатами для производства улучшенных вакцин с универсальной эффективностью.

Развитие биотехнологии, в частности использование технологий ДНК клонирования и экспрессии, значительно облегчило идентификацию нескольких основных антигенов М.tuberculosis.

В результате скрининга библиотек рекомбинантных микобактерий с помощью моноклональных и поликлональных антител были идентифицированы и охарактеризованы несколько антигенов микобактерий (Young R.A., Mehra V., Sweetser D., Buchanan Т. et al., 1985, Nature, 316 96027), 450-452; Young R.A., Bloom В.R. et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci, USA 82(9), 2583-2587; Young D.B., Kent L. and Young R.A., 1987, Infect immunity, 55 (6), 1421-1425).

В последнее время наибольшее внимание уделялось секретируемым из инфицированных макрофагов белкам (антигенам) M.tuberculosis как перспективным компонентам вакцин.

Установлено, что иммунитет к ТБ включает несколько типов эффекторных клеток. Активация макрофагов цитокинами, такими как γ-интерферон, приводит к эффективному снижению внутриклеточного микобактериального размножения. Однако для полной защиты от ТБ требуется активация Т-лимфоцитов, таких как CD8+ или CD4+ Т-клеток.

Антигенная стимуляция Т-клеток требует представления молекулами главного комплекса гистосовместимости (ГКТС).

Считается, что секретируемые микобактериями из инфицируемых макрофагов белки легко доступны для протеолитической обработки и последующего представления в форме пептидного фрагмента, ассоциированного с рецепторами главного комплекса гистосовместимости (ГКГС).

Среди таких секретируемых белков были идентифицированы такие, как антигенный 85 комплекс белков (85А, 85В, 85С) (Wiker et al., 1992, Microbiol.Rev., 56, 648), белок в 6 кДа, названный ESAT6 (Andesson, 1994, Infect. Immunity, 62, 2536), липопротеин в 38 кДа с гомологией к Dhos, белок «теплового шока» GroEL в 65 кДа (Siva et al., 1994, Immunology, 82, 244), белок в 10 кДа CFP-10 (Mustafa A.S., 2001, Corrent Pharmaceutical Biotechnology, 2,157) и некоторые другие.

На основе таких белков или их пептидов был созданы ряд диагностических систем и вакцин, среди которых наиболее интересны те из них, которые созданы на основе секреторных белков ESAT6 или CFP-10, которые отсутствуют у M.bovis и большинства непатогенных микобактерий.

Так в Патенте WO00262248 описана диагностическая система на основе смеси пептидов ESAT6.

В заявке Заявителя №2003123149 описана диагностическая система на основе гибридного белка ESAT6-CFP-10.

Наиболее близким техническим решением к настоящему изобретению является вакцинная композиция для профилактики и лечения туберкулезной инфекции, содержащая инертный носитель и/или разбавитель и антигенный компонент в эффективном количестве, в качестве которого используют гибридный рекомбинантный белок ESAT6-85B (опубликованная заявка на патент США №2002176867).

Белок может быть получен генноинженерным путем - экспрессией соответствующих генов (нуклеотидных последовательностей до 75% соответствующим этим генам) в плазмидном векторе. Несмотря на то что в состав белка входят два секретируемых белка М.tuberculosis, протективная способность вакцины оказалось не большей, чем у БЦЖ. Низкая эффективность вакцины на основе гибридного белка ESAT6-85B, по нашему мнению, в недостаточном репертуаре антигенных детерминант, представленных в гибридном белке, необходимом для эффективной защиты от M.tuberculosis, а также в низкой эффективности презентации белка в контексте МНС для распознавания антигенных детерминант клетками иммунной системы.

Изобретательской задачей является расширение арсенала вакцинных средств для профилактики и лечения туберкулезной инфекции, а также повышение их эффективности за счет увеличения протективной способности антигенной композиции.

Поставленная задача решается тем, что предлагается вакцинная композиция для профилактики и лечения туберкулезной инфекции, содержащая инертный носитель, и/или разбавитель и антигенный компонент в эффективном количестве и отличающаяся тем, что в качестве последнего она содержит смесь гибридного рекомбинантного белка ESAT6-HSP70 M.tuberculosis и белка «теплового шока» HSP65 M.tuberculosis.

Композиция может содержать дополнительно тимоген (глютамил-триптофан) - фармакопейный препарат, представляющий собой неспецифический пептидный иммуномодулятор тимусного происхождения. Преимущественно соотношение белков ESAT6 - HSP70:HSP65 в патентуемой композиции находится в интервале 1:10 - 10:1, предпочтительно 1:1.

Белки HSP70 и HSP65 M.tuberculosis относятся к семейству белков «теплового шока» (БТШ), которые содержатся в любой ткани и в любом организме, а HSP70 и HSP65 классы - в клетках млекопитающих, бактерий и микобактерий, таких как M.leproe, M.tuberculosis, M.vaccoe, M.bovis и др.

Как установлено, белки «теплового шока» также распознаются Т-клетками и, следовательно, могут индуцировать протективный иммунитет (Mustafa A.S., 1999, Ind. J. Lepr, 71 (1), 75-86; Oftung F., Borka E. and Mustafa A.S., 1999, Fems Immunol. Med. Microbiol, 20 (4), 319-325; Pramod srivastava, Interaction of heat shock protein with peptides and antigen presenting cells, Annu Rev Immunol, 2002, 20, 395-425), в том числе, специфический противовирусный (противобактериальный) иммунитет, для чего создаются специальные «конструкции» по иммобилизации этих специфических антигенов с белками «теплового шока». Например, см. заявку РСТ 97/068916 Barriocs et al., Eur. J. Immunol, 22 1365-1372, 1994; К. Suzue et al. Journal of Immunology, 19, 159-164, 1999).

При этом в ряде случаев удается значимо усилить иммуногенность вирусных (или бактериальных) белков, то есть обеспечить адъювантный эффект (см. положительное решение по заявке РФ заявителя №2002128131/14).

Таким образом, разрабатывая новый вакцинальный антиген (гибридный белок ESAT6-HSP70 M.tuberculosis), заявитель исходил из определенных закономерностей, знаний и опыта, в том числе собственного, однако предсказать свойства и характеристики (особенно в количественном выражении) нового вещества из предшествующего уровня знаний не представляется возможным. Они установлены Заявителем впервые опытным путем. То же относится к синергическому эффекту (синергизм протективных свойств) вакцинной композиции в целом.

Указанная совокупность признаков изобретения нигде ранее не описана, таким образом, предлагаемое техническое решение отвечает критериям «изобретательский уровень» и «новизна».

Для получения белков ESAT6-HSP70 и HSP65 были разработаны соответствующие генетические конструкции.

Предлагается рекомбинантная плазмидная ДНК (рЕ HSP70), кодирующая синтез гибридного белка ESAT6-HSP70 М.tuberculosis, которая характеризуется тем, что она представляет собой вектор pQE30, имеющий размер 3461 нуклеотидных пар оснований, с lac-промотором, геном устойчивости к ампициллину и последовательности из 18 нуклеотидов, кодирующей 6 гистидиновых остатков, в которые оперативно встроены ген белка ESAT6, имеющий 288 нуклеотидов (между сайтами для рестриктаз BglII и BamHI) и ген белка «теплового шока» HSP70 M.tuberculosis, имеющий 1878 нуклеотидов (между сайтами для рестриктаз BamHI и HindIII).

Таким образом, предлагается также рекомбинантная плазмидная ДНК (pQE HSP65), кодирующая синтез белка HSP65 M.tuberculosis, которая характеризуется тем, что она представляет собой вектор pQE30, имеющий 3461 н.п.о., с lac-промотором, геном устойчивости к ампициллину и последовательности из 18 нуклеотидов, кодирующей 6 гистидиновых остатков, в который оперативно встроен ген белка «теплового шока» HSP65 M.tuberculosis, имеющий 1623 нуклеотида (между сайтами для рестриктаз KpHI и HindIII).

Предложенные генетические конструкции позволяют устойчиво экспрессировать указанные белки, обеспечивают технологичность методов их выделения и очистки, высокую чистоту целевых белков.

Сущность изобретения поясняется с помощью графических материалов:

Фиг.1 содержит схему получения плазмиды PQE30-ESAT-dnak (pE HSP70) для получения гибридного белка ESAT6-HSP70 М. tuberculosis,

Фиг.2 содержит данные о молекулярной массе гибридного белка ESAT6-HSP70 М.tuberculosis методом электрофореза,

Фиг.3 содержит данные о чистоте выделяемого гибридного белка ESAT6-HSP70 М.tuberculosis на электрофореграмме по Леммли в 12% ПААГ,

Фиг.4 содержит схему получения плазмиды PQE30-groEL2 (pQE HSP65) для получения белка HSP65,

Фиг.5 содержит данные о молекулярной массе гибридного белка HSP65 М.tuberculosis методом электрофореза,

Фиг.6 иллюстрирует протективную активность HSP65, гибридного белка ESAT6-HSP70 M.tuberculosis, предлагаемой композиции и композиции, содержащей дополнительно тимоген в сравнении с протективной акттивностью вакцины БЦЖ на модельном эксперименте in vivo.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример I.

Получение продуцента гибридного белка, содержащего гибридный белок ESAT6-DnaK (Hsp70) M.tuberculosis.

1. ПЦР-амплификация гена esat-6 M. tuberculosis.

Ген esat-6 был амплифицирован на ДНК М. tuberculosis H37Rv с помощью праймеров ES-F и ES-R

Инициирующий кодон находится в одной рамке считывания с последовательностью 6HIS tag, терминирующий кодон отсутствует.

2. Клонирование последовательности гена esat-6 в рекомбинантном векторе - продуценте DnaK.

Был использован ранее полученный вектор pQE30-dnaK-Y (см. схему), обеспечивающий экспрессию белка DnaK., слитого с последовательностью 6HIS на N-конце. ПЦР фрагмент гена esat-6 был обработан рестриктазами BamHI и BglII и клонирован в BamHI сайте плазмиды pQE30-dnaK-Y. Рекомбинанты, имеющие вставку в правильной ориентации, были идентифицированы при помощи рестрикционного анализа. Схема патентуемой конструкции приводится на Фигуре 1. Следует отметить, что рекомбинантная плазмида pQE30-esat-6-dnaK обеспечивает продукцию гибридного белка 6HIS-esat6-DnaK.

Схема получения плазмиды pQE30-esat-dnaK (рЕ HSP70) (см. Фиг.1).

3. Продукция Esat6-DnaK

Синтез гибридного белка Esat6-DnaK (HSP70) индуцировали при помощи IPTG следующим способом.

Ночную культуру DLT1270/ pQE30-esat-dnaK, выращенную в LB-бульоне, разводили 1:100 и выращивали в LB-бульоне на качалке до OD₆₀₀=0.5. Затем вносили 0.1 тМ IPTG и продолжали выращивание в течение 3 часов.

Продукцию белка контролировали при помощи SDS-PAGE. Наблюдали синтез белка ожидаемой молекулярной массы, выход составлял 50-70% (см. Фиг.2).

Пример II.

Протокол выделения рекомбинантного белка ESAT6-HSP70 из биомассы штамма-продуцента E.coli из телец включения рефолдингом.

1. Буферные растворы.

А. 0.05 М трис-HCl буфер, 0,4 М NaCl, 0.1% твин-20, 2 мМ PMSF, рН8,0.

В. 0.05 М трис-HCl буфер, 0,4 М NaCl, pH 8,0.

С. 0.1 М трис-HCl буфер, 6 М гуанидинхлорид, pH 8,0.

D. 0.05 М трис-HCl буфер, 6 М мочевины, 0.4 М NaCl, pH 8.0.

Е. 0.01 М трис-HCl буфер, 0.15 М NaCl, pH 8.0.

2. Получение телец включения.

500 мкл биомассы суспендируют в 5 мл буфера А, обрабатывают ультразвуком при 0°С (1 мин, 5×5 с, 22 кГц, 225 Вт). Гомогенат центрифугируют 10 мин при 13000 об/мин (центрифуга Jouan BR4) и при +4°С. Супернатант отбрасывают, осадок промывают 2 раза буфером А и 3 раза буфером В, каждый раз суспендируя осадок ультразвуком и центрифугируя при указанных выше условиях. Осадок хранят при -18°С.

3. Получение экстракта белка.

Тельца включения растворяют с помощью ультразвука в 5 мл буфера С, раствор центрифугируют 20 мин при 13000 об/мин (центрифуга Jouan) и при +4°С, осадок отбрасывают.

4. Рефолдинг.

Супернатант из п.Ш разбавляют при перемешивании в 50 мл холодного (+4°С) буфера D и после перемешивания диализуют (3×3 л, 18-8-18 ч) против предварительно охлажденного (+4°С) буфера Е. Диализат центрифугируют 1 ч (+4°С, 5000 об/мин, центрифуга Jouan BR4), осадок отбрасывают, супернатант фильтруют через мембранный фильтр (капрон) с размером пор 0,22 мкм. В фильтрате определяют содержание белка по методу ВСА, аликвотируют в пенициллиновые флаконы по 2 мл, замораживают при -70°С и лиофильно высушивают.

Типичная электрофореграмма белка HSP70-ESAT6 в 12%-ном ПААГ по Лэммли (см. Фиг.3).

Пример III.

Получение продуцента GroEL2 (HSP65) М.tuberculosis.

1. Клонирование в pQE30.

Ген groEL2 M tuberculosis был амплифицирован из геномной ДНК штамма H37RV с помощью праймеров:

(KpnI сайт, использованный для клонирования, подчеркнут, ATG кодон гена groEL2 выделен жирным шрифтом.)

(HindIII сайт, использованный для клонирования, подчеркнут, последовательность, комплементарная терминирующему кодону TGA, выделена жирным шрифтом.)

Полученный ПЦР фрагмент размером 1.65 kb был обработан KpnI + HindIII и клонирован между KpnI и HindIII сайтами pQE30. Полученную рекомбинантную плазмиду pQE30-groEL2 поддерживали в штамме E.coli DLT1270, содержащем хромосомно-интегрированную копию lacI-репрессора.

Схема конструкции pQE30-groEL2 (pQE HSP65) (см.Фиг.4).

2. Продукция GroEL2 (HSP65).

Синтез GroEL2 индуцировали при помощи IPTG следующим способом.

Ночную культуру DLT1270/ pQE30-groEL2, выращенную в LB-бульоне, разводили 1:100 и выращивали в LB-бульоне на качалке до OD₆₀₀=0.5. Затем вносили 0.1 mM IPTG (можно меньше) и продолжали выращивание в течение 2 часов.

Продукцию белка контролировали при помощи SDS-PAGE (см Фиг.5). Наблюдали синтез белка ожидаемой молекулярной массы.

Пример IV.

Вакцинная композиция, содержащая смесь гибридного белка ESAT6-HSP70 и HSP65 из M.tuberculosis.

Смесь представляет собой белый порошок, хорошо растворимый в воде, физиологическом растворе и фосфатно-буферном физиологическом растворе Дильбекко.

Композицию хранят в асептических условиях в запаянных стеклянных капсулах в отсутствие кислоты, в сухом или растворенном в указанных растворителях виде.

Композицию при соотношении белков 1:1 используют для иммунотерапии по примеру 6 в широком диапазоне доз от 0,01 до 10 мкг.

Композицию при соотношении белка, ESAT6-HSP70 M.tuberculosis и белка HSP65 M.tuberculosis 98:1 используют для иммунизации в дозе 0,1 мкг, а при соотношении этих белков 3:97 - в дозе 10 мкг по примеру 6.

Пример V.

Вакцинная композиция, содержащая смесь гибридного белка ESAT6-HSP70, HSP65 из M.tuberculosis и тимоген.

Композиция представляет собой композицию по примеру 4 и тимоген в количестве 10 мкг.

Пример VI.

Изучение протективного эффекта вакцинной композиции на модели туберкулезной инфекции in vivo.

Мышей иммунизировали подкожно три раза соответствующим вакцинным препаратом без адъюванта с двухнедельным интервалом. Через 10 недель после первой вакцинации мышей заражали M.tuberculosis, для чего их инфицировали внутривенно введением бактерий M.tuberculosis H37RV, суспендированных в растворе PBS в объеме 0,2 мл и в количестве 5×10⁴ микробных тел. Через 6 недель после заражения мышей забивали, легкие и селезенка исследовались на наличие M.tuberculosis. Для этого органы гомогенизировались в стерильном буфере и последовательные разведения высевались на чашки с агаром Мидлбрюк.

Цифры представлены на графике как log₁₀ КОЕ (см.Фиг.6). Одну дозу БЦЖ (5×10⁴) вводили подкожно один раз.

Тимоген вводился в количестве 10 мкг на одно животное во всех экспериментах. Значение КОЕ _(lg10) при концентрации смеси 0,1 мкг при соотношении белков (ESAT6-HSP70:HSP65) 98:2 составляет 4,9, а при концентрации 10 мкг - при их соотношении 3:97 составляет 4,6.

Изобретение относится к области медицины и иммунологии. Предложена вакцинная композиция для профилактики и лечения туберкулезной инфекции. Композиция содержит смесь гибридного рекомбинантного белка ESAT-HSP70 M.tuberculosis и белка HSP65 М.tuberculosis и инертный носитель. Кроме того, предложенная композиция может дополнительно содержать тимоген. Предложены также рекомбинантные плазмидные ДНК рЕ HSP70 и pQE HSP65, кодирующие соответствующие белки. Предложенная вакцинная композиция повышает эффективность лечения и профилактики туберкулезной инфекции. Генетические конструкции позволяют устойчиво экспрессировать указанные белки и повысить чистоту выхода целевых белков. Изобретение может быть использовано для лечения и профилактики туберкулеза. 3 н. и 2 з.п. ф-лы, 6 ил.

1. Вакцинная композиция для профилактики и лечения туберкулезной инфекции, содержащая инертный носитель и/или разбавитель и антигенный компонент в эффективном количестве, отличающаяся тем, что в качестве последнего она содержит смесь гибридного рекомбинантного белка ESAT6-HSP70 M.tuberculosis и белка HSP65 М.tuberculosis.2. Вакцинная композиция по п.1, отличающаяся тем, что дополнительно содержит тимоген.3. Вакцинная композиция по п.1, отличающаяся тем, что соотношение белка ESAT6-HSP70 M.tuberculosis и белка HSP65 М.tuberculosis составляет 1:1.4. Рекомбинантная плазмидная, ДНК (рЕ HSP70), кодирующая синтез гибридного белка ESAT6-HSP70 M.tuberculosis, которая характеризуется тем, что она представляет собой вектор pQE30, имеющий размер 3461 нуклеотидных пар оснований, с lac-промотором, геном устойчивости к ампициллину и последовательности из 18 нуклеотидов, кодирующей 6 гистидиновых остатков, в которых оперативно встроены ген белка ESAT6, имеющий 288 нуклеотидов (между сайтами для рестриктаз Bgl II и BamHI) и ген белка "теплового шока" HSP70 M.tuberculosis, имеющий 1878 нуклеотидов (между сайтами для рестриктаз BamHI и HindIII).5. Рекомбинантная плазмидная ДНК (pQE HSP65), кодирующая синтез белка HSP65 M.tuberculosis, которая характеризуется тем, что она представляет собой вектор pQE30, имеющий размер 3461 н.п.о, с lac-промотором, геном устойчивости к ампициллину и последовательности из 18 нуклеотидов, кодирующей 6 гистидиновых остатков, в который оперативно встроен ген белка "теплового шока" HSP65 M.tuberculosis, имеющий 1623 нуклеотида (между сайтами для рестриктаз KpHI и HindIII).