СПОСОБ КОРРЕКЦИИ МОРФОЛОГИЧЕСКОГО СОСТОЯНИЯ ПЕЧЕНИ ОПУХОЛЕНОСИТЕЛЯ Российский патент 2006 года по МПК A61K31/702 A61K31/194 A61K31/375 A61P1/16 

Изобретение относится к экспериментальной медицине и биологии и касается нормализации морфологического состояния печени опухоленосителей.

При злокачественных новообразованиях различной этиологии выявлены циркуляторные сдвиги, дистрофические и атрофические процессы в печени [15]. Дистрофические изменения проявлялись в набухании, вакуолизации печеночных клеток и нарушении балочной структуры. Постоянно наблюдался выраженный полиморфизм и неравномерность окраски ядер печеночных клеток. Развитие лимфосаркомы (ЛФС) Плисса приводило к нарушению функциональных свойств митохондрий печени крыс [14]. В процессе роста и развития опухоли в клетках печени опухоленосителя наблюдалось нарушение энергетического обмена (снижение содержания АТФ) [7, 20], окислительно-восстановительных процессов [2, 7], происходило ослабление дыхания [2, 3, 7, 8, 17], снижение окислительного фосфорилирования [7, 18] и ускорение гликолиза [18].

Опухолевый рост не является чисто местным процессом, в него вовлекаются все органы и ткани, весь организм в целом. В печени организма, пораженного злокачественной опухолью, возникает ряд серьезных и взаимосвязанных нарушений в структуре гепатоцитов, разных сторонах их метаболизма и, как следствие этого, в функциональном состоянии печени опухоленосителей [1, 14, 15]. В печени опухоленосителей наряду с дистрофическими и некротическими изменениями очень рано начинают проявляться регенерационные процессы. Однако компенсаторно-восстановительные реакции в организме, пораженном злокачественным новообразованием, ограничены и не приводят к полному восстановлению всех нарушенных функций [1].

Для нормализации морфологического состояния печени используется хорионический гонадотропин [11], экстракт вытяжки коры надпочечников [16] и комплекс препаратов с экстрактом вытяжки коры свиных и фетальных надпочечников человека [10].

Однако известные средства разработаны и предложены для нормализации состояния печени не в условиях опухоленосительства, а при отравлении четыреххлористым углеродом.

В доступной нам литературе мы не обнаружили ни одного способа коррекции морфологического состояния печени опухоленосителей. В связи с этим выбрать прототип изобретения не представляется возможным.

В задачу предлагаемого изобретения положена разработка способа коррекции морфологического состояния печени опухоленосителей.

Поставленная задача достигается тем, что опухоленосителю ежедневно per os дают препарат «олигохит актив» из расчета 20-24 мг на 1 кг веса, общим курсом не менее 7 дней.

В источниках информации подобного способа коррекции морфологического состояния печени опухоленосителей лимфосаркомы Плисса не обнаружено. Поэтому авторы полагают, что техническое решение является новым и соответствует критерию «изобретательный уровень».

Способ коррекции морфологического состояния печени опухоленосителей лимфосаркомы Плисса осуществляли в эксперименте на 44 белых беспородных крысах.

Модель неоплазии создавали путем перевивки опухолевого штамма ЛФС Плисса, приобретенного в ОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН. ЛФС Плисса - экспериментальная опухоль, была получена в 1958 году после подкожной перевивки опухоли, возникшей у крысы, получавшей 3,3-дихлорбензидин. Кусочки опухолевой ткани диаметром 1 мм с 0,5-1 мл физиологического раствора вводились подкожно в область правого бедра.

Опухоль состоит из мягких, округлой формы клеток, большая часть которых занята крупным ядром. Хроматин располагается главным образом в периферической зоне ядра. Ядрышки крупные, гиперхромные. Цитоплазма опухолевых клеток отличается умеренной базофилией. Опухоль обладает ярко выраженным инфильтративным ростом. Инфильтрует пограничные соединительную и жировую ткань, а также мышцы. В опухоли встречаются очаги некроза, которые в отдельных участках сливаются.

Морфологические изменения в печени крыс с лимфосаркомой Плисса проявлялись в дискомплексации печеночных балок, полиморфизме гепатоцитов и их ядер. Наблюдались округление и некоторое обособление Купферовских клеток с отчетливой гиперхромией их ядер, очаговые некрозы, размеры которых колебались, занимая в одних участках лишь одну, в других несколько клеток. Выявлялось гидропическое перерождение клеток печени: цитоплазма клеток становилась очень светлой и разреженной, но ядра располагались центрально, границы клеток были четко очерчены. В ответ на дистрофические изменения и гибель паренхимы отмечены воспалительные процессы в печени. Для коррекции морфологического состояния печени при опухолевом росте необходимо стимулировать эндогенные возможности организма, направленные на снижение токсического воздействия опухоли на организм.

На 3 сутки развития опухоли (размер ее к этому времени составлял 1 см в диаметре) все экспериментальные животные были разделены на 7 групп:

1 группа - интактная (8 крыс). Животные не подвергались никаким воздействиям.

2 группа - контрольная (6 крыс). Животные с ЛФС, без воздействия.

3 группа - животные с ЛФС, которые с 3 дня развития опухоли начинали пить по 30-40 мл раствора янтарной кислоты с концентрацией 800 мг/л в течение 7 дней.

4 группа - животные с ЛФС, которые с 3 дня развития опухоли начинали пить по 30-40 мл водного раствора «олигохит сукцината» с концентрацией 800 мг/л в течение 7 дней.

5 группа - животные с ЛФС, которые с 3 дня развития опухоли начинали пить по 30-40 мл раствора аскорбиновой кислоты с концентрацией 800 мг/л в течение 7 дней.

6 группа - животные с ЛФС, которые с 3 дня развития опухоли начинали пить по 30-40 мл водного раствора «олигохит аскорбата» с концентрацией 800 мг/л в течение 7 дней.

7 группа - животные с ЛФС, которые с 3 дня развития опухоли начинали пить по 30-40 мл водного раствора «олигохит актив» с концентрацией 800 мг/л в течение 7 дней.

Комплекс изучаемых препаратов был выбран не случайно.

В физиологических условиях янтарная кислота диссоциирована, поэтому название ее аниона - сукцинат часто применяют как синоним термина «янтарная кислота».

Исследования последних лет показали наличие у сукцината биологической активности с уникальным сочетанием проявлений: по отношению к здоровому организму он выступает в роли адаптогена, а при наличии патологических проявлений демонстрирует нетипично высокий для адаптогенов терапевтический эффект [4]. Сукцинат является нормальным клеточным метаболитом, играет большую роль в обеспечении энергетического баланса в клетке [3, 4], обладает антигипоксическим [6], антиоксидантньм [4] и радиопротекторным [5] действиями, устраняет метаболический ацидоз, ослабляет токсическое действие ряда лекарственных средств [19]. Показано применение сукцината в лечении онкологических больных [3].

Аскорбиновая кислота стимулирует процесс образования коллагена, этим способствуя поддержанию нормальной проницаемости капилляров; принимает участие в обменных процессах, являясь переносчиком водорода; контролирует белковый обмен; влияет на скорость образования ДНК; контролирует биохимические реакции в клетках центральной нервной системы; оказывает стабилизирующее действие на молекулы адреналина путем их защиты от окисления; повышает фагоцитарные свойства крови за счет нарастания фагоцитарной активности лейкоцитов.

В последние годы в различных областях медицины широко применяется хитозан и его производные. Хитозан получают путем переработки морских ракообразных, а после ферментативного расщепления высокомолекулярного хитозана образуется новый, водорастворимый продукт - олигосахарид хитозана (олигохит^ТМ). В таком виде он легко абсорбируется в кишечнике и быстро попадает в системный кровоток, а затем с током крови доносится к «органам-мишеням».

Олигохит сукцинат (ОС) представляет собой комплекс олигосахарид хитозана и сукцината посредствам ионной связи, которая в желудочно-кишечном тракте легко распадается на составляющие компоненты, а олигохит усиливает всасывание сукцината [9]

Олигохит актив (ТУ 9289-004-57184729-03) представляет собой водорастворимый продукт, в котором олигосахарид хитозана (0,25 г), сукцинат (0,05 г) и аскорбат (0,05 г) находятся в ионной связи друг с другом.

Животных всех экспериментальных групп забивали на 10 день развития опухоли и 7 день получения препаратов.

Для гистологического исследования кусочки печени всегда брали из правой боковой доли печени крыс и фиксировали в 10% нейтральном формалине. На гистологических срезах, окрашенных гематоксилином и эозином, наряду с визуальным описанием паренхимы печени для объективной оценки эффекта вводимых препаратов проводили количественное изучение гепатоцитов методами морфометрического анализа, основанного на принципах стереологии с использованием окулярной морфометрической сетки Стефанова С.Б., содержащей 25 узлов, при увеличении микроскопа 10×40×1,5, с использованием рекомендаций по количественной морфологии биоктатов органов пищеварения [12].

На площади препарата, ограниченной сеткой, подсчитывали количество нормальных ядер гепатоцитов округлой или овальной формы, хорошо структурированных, с четкими ядрышками.

Доверительный интервал колебания средней арифметической величины при р=0,05 определяли по формуле и таблицам Р.Б.Стрелкова [13].

При статистической обработке результатов для оценки значимости цифровых данных использовали t-критерий Стьюдента.

Анализ состояния паренхимы патологически измененной печени животных-опухоленосителей разных экспериментальных групп показал наиболее выраженную степень нормализации структуры печени животных, получавших комплекс «олигохит актив» из расчета 20-24 мг на 1 кг веса, общим курсом не менее 7 дней.

Морфологические изменения в печени крыс с лимфосаркомой Плисса проявлялись в дискомплексации печеночных балок, полиморфизме гепатоцитов и их ядер. Наблюдались округление и некоторое обособление Купферовских клеток с отчетливой гиперхромией их ядер, очаговые некрозы, размеры которых колебались, занимая в одних участках лишь одну, в других несколько клеток. Выявлялось гидропическое перерождение клеток печени: цитоплазма клеток становилась очень светлой и разреженной, но ядра располагались центрально, границы клеток были четко очерчены. В ответ на дистрофические изменения и гибель паренхимы отмечены воспалительные процессы в печени.

Морфологические исследования показали, что у крыс-опухоленосителей количество ядер гепатоцитов на тест-площади препарата резко снижено по сравнению с интактными: 3,4±0,3 и 8,3±0,5 (см. таблицу).

У животных, получавших сукцинат, наблюдалась слабая дистрофия гепатоцитов с очагами некрозов, незначительной круглоклеточной инфильтрацией в области сосудов, но, по сравнению с опухоленосителями, при визуальной оценке гистологических препаратов большинство паренхиматозных клеток печени были хорошо окрашены, с крупными ядрами. Морфометрические исследования не выявили достоверных различий в количестве нормальных ядер гепатоцитов (4,1±0,4) у животных этой группы по сравнению с крысами-опухоленосителями, не подвергавшимися воздействию препарата.

Исследования показали, что при использовании «олигохит сукцината» на фоне сходных морфологических изменений в печени крыс после введения только сукцината отмечали отделение стенок синусоидов от балок печени и расширение пространств Диссе. У отдельных крыс наблюдали диффузную мелкокапельную жировую инфильтрацию. Отмеченное расширение перисинусоидальных пространств может быть следствием циркуляторной недостаточности и повышенной проницаемости стенок синусоидов. Местами наблюдали скопление лимфоцитов, свидетельствующие об очаговых некрозах клеток печени.

Морфометрические исследования показали достоверное увеличение числа нормальных ядер гепатоцитов у этих крыс - 4,6±0,4 по сравнению с опухоленосителями (3,4±0,3).

Морфологическая картина печени животных, получавших аскорбиновую кислоту, была сходной с морфологической картиной печени животных, получавших сукцинат. Однако наблюдалось повышение активности соединительной ткани, проявляющееся в пролиферации клеток Купфера. По сравнению с животными контрольной группы достоверно увеличивалось количество нормальных ядер гепатоцитов до 4,5±0,2.

При введении препарата олигохит аскорбат также наблюдали повышение активности клеток Купфера.

Важно отметить, что изменение состояния клеток Купфера отражает многие неспецифические и специфические реактивные сдвиги в ткани печени. К наиболее часто наблюдаемым неспецифическим реакциям в печени относятся округление и некоторое обособление купферовских клеток с отчетливой гиперхромией их ядер.

Вместе с тем, в этой группе экспериментальных животных по сравнению с животными контрольной группы нормализуется паренхима печени: клетки и ядра гепатоцитов хорошо окрашены, дистрофические изменения и нарушения микроциркуляторного русла не выражены. Количество нормальных гепатоцитов на тест-площади препарата увеличилось в 1,59 раза по сравнению с контрольными животными и составило 5,32±0,36. Но положительный эффект отмечали лишь в 66,7% случаев (у 4 крыс из 6 в группе).

Введение «олигохит актива» стимулировало у животных выраженные регенерационные процессы, о чем свидетельствовало большое количество двуядерных гепатоцитов с увеличенными гиперхромными ядрами, с плотной базофильной цитоплазмой. Большинство ядер гепатоцитов содержали 2-3 крупных ядрышка.

Морфометрические исследования подтвердили, что количество нормальных ядер гепатоцитов у животных, получавших комплексный препарат «олигохит актив» увеличивается до 5,52±0,28 (контрольная группа 3,4±0,3). Важно отметить, что в этой экспериментальной группе животных выявлен 100% положительный эффект. В среднем количество нормальных гепатоцитов увеличилось по сравнению с животными-опухоленосителями без воздействия в 1,65 раза.

Таким образом, сравнительное изучение биологического действия различных веществ на модели патологически измененной печени опухоленосителей выявило наибольший выраженный эффект на нормализацию структуры печени при введении животным-опухоленосителям комплекса «олигохит актив», что позволяет предложить данный способ для коррекции морфологического состояния печени опухоленосителей (табл.1).

Таблица 1.
Изменение количества нормальных ядер гепатоцитов крыс различных экспериментальных групп.Группы животныхКоличество нормальных ядер гепатоцитов, M±ZИнтактные6,60±0,24Опухолевые, без воздействия3,35±0,10Опухолевые, получавшие сукцинат4,13±0,20*Опухолевые, получавшие «олигохит сукцинат»4,62±0,25*Опухолевые, получавшие аскорбат4,52±0,21*Опухолевые, получавшие «олигохит аскорбат»5,32±0,36* (эффект у 66,7% животных)Опухолевые, получавшие «олигохит актив»5,52±0.28* (эффект у 100% животных)* различия достоверны при р<0,05 по сравнению с группой животных-опухоленосителей «без воздействия».

Пример №1.

Крысе №13, весом 200 г ввели подкожно в область правого бедра 0,5 мл физиологического раствора с кусочками опухолевого штамма лимфосаркомы (ЛФС) Плисса диаметром 1 мм, приобретенного в НИИ Экспериментальной диагностики и терапии опухолей РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН (г.Москва).

На третьи сутки развития опухоли (размер ее к этому времени составил 0,7 см в диаметре) крыса стала получить в поилке водный раствор содержимого капсулы препарата «олигохит актив» с концентрацией 800 мг/л. Каждый день в течении 7 дней крыса выпивала от 30 до 40 мл раствора, что составляло 20-24 мг на 1 кг веса. Раствор в поилке меняли на свежеприготовленный каждый день в 10 утра.

Через 10 дней после перевивки опухолевого штамма ЛФС Плисса и 7 дней получения препарата «олигохит актива» провели декапитацию крысы под эфирным наркозом. Опухоль была 3×3 см, весом 9 г. Для гистологического исследования взяли кусочек печени из правой боковой доли, зафиксировали в 10% нейтральном формалине. После приготовления парафиновых срезов печени толщиной 4-6 мкм их окрасили гематоксилином с эозином по общепринятой методике. На площади препарата, ограниченного сеткой, оказалось 5.4±0.48 нормальных ядер гепатоцитов округлой или овальной формы, хорошо структурированных, с четкими ядрышками.

Под влиянием препарата усиливалась пролиферативная активность гепатоцитов. Количество нормальных ядер гепатоцитов увеличилось в 1,6 раза по сравнению с опухоленосителями, не получавшими препараты.

Вместе с тем нормализовалась паренхима печени: клетки и ядра гепатоцитов были хорошо окрашены, дистрофические изменения в гепатоцитах и нарушение микроциркуляционного русла не были выражены. На препаратах печени этой крысы было отмечено большое количество двуядерных печеночных клеток, гепатоцитов с увеличенными гиперхромными ядрами, содержащими по 2-3 крупных ядрышка, что свидетельствует о выраженных репарационных процессах в печени.

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ:

1. Баличева Л.В. Структурно-метаболические и функциональные изменения в печени опухоленосителей // Актуальные вопросы современной онкологии. - 1973. - вып.3. - С.91-111.

2. Гонский Я.Н., Береговская Н.Н. Энергообеспечивающее и свободнорадикальное окисление при опухолевом процессе // Нарушение биоэнергетики в патологии и пути их восстановления - М., 1993. - С.21-26.

3. Козырева Е.В. Использование янтарной кислоты и других компонентов энергетического обмена в лечении онкологических больных // Сб. статей «Янтарная кислота в медицине, пищевой промышленности и сельском хозяйстве». - Пущино, 1997. - С.113-118.

4. Кондрашова М.Н. Выясненные и наметившиеся вопросы на пути исследования регуляции физиологического состояния янтарной кислоты // Терапевтическое действие янтарной кислоты. - Пущино, 1976. - С.4-12.

5. Косенко Е.А., Каминский Ю.Г. Янтарнокислый натрий - радиопротектор // Сб. статей «Янтарная кислота в медицине, пищевой промышленности и сельском хозяйстве». - Пущино, 1997. - С.128-133.

6. Лукьянова Л.Д. Новые подходы к созданию антигипоксантов метаболического действия // Вестник РАМН.- 1999. - №3. - С.18-25.

7. Морозкина Т.С. Системное действие опухоли на процессы энергетического обмена хозяина: Автореф. дис. д-ра мед. наук. - Минск, 1978. - 42с.

8. Мосиенко B.C., Загоруйко Л.И., Тодор И.Н. Особенности кислородного обмена при опухолевом процессе // Эксперим. онкология. - 1985. - Т.7, №5. - С.8-14.

9. Олигосахарид хитозана сукцинат. - Доступно по www.oligopharm@sandy.ru.

10. Садовникова И.В., Шиленок И.Г., Садовникова В.В., Мухина И.В., Панина Н.А., Иванова Н.Л. Способ стимуляции регенерации печеночной ткани. Патент РФ на изобретение №2185835 от 27.07.2002 г.

11. Солопаева И.М. Хорионический гонадотропин в биологии и медицине. Монография. - Н.Новгород: Изд-во ННГУ им. Н.И.Лобачевского, 2000. - 192 с.

12. Солопаева И.М., Стефанов С.Б., Жданова Т.Ф. Количественная морфология биоктатов органов пищеварения / Методич. рекомендации. - Горький, 1982. - 16 с.

13. Стрелков Р.Б. Метод вычисления стандартной ошибки и доверительного интервала средних арифметических величин с помощью таблиц. - Сухуми: Алашара, 1966. - 12 с.

14. Туровецкий В.Б., Авакян Э.А. Нарушение функциональных и конформационно-динамических свойств митохондрий печени крыс при развитии лимфосаркомы Плисса // Известия АН СССР «Серия биологическая». - 1981. - №6. - С.930-933.

15. Чурсина М.А., Сысоева Т.В. Изменения печени при новообразованиях различной локализации // Здравоохранение Туркменистана. - 1971. - №1 (133). - С.6-8.

16. Шиленок И.Г., Садовникова И.В., Садовникова В.В., Панина Н.А., Журавлев В.А. Теоретическое обоснование использования экстрактов коры надпочечников при патологии печени // Российский гастроэнтерологический журнал. - 1998. - №2. - С.93.

17. Durig J., Fiedler W., de-Wit M., Steffen M., Hossfeld D.K. Lactic acidosis and hypoglycemia in a patient with high-grade non-Hodgkin's lymphoma and elevated circulating TNF-alpha // Ann.Hematol. - 1996. - Vol.72, №2. - P.97-99.

18. Liu K.J., Henderson Т.О., Kleps R.A., Reyes M.C., Nyhus L.M. Gluconeogenesis in the liver of tumor rats // J. Surg. Res. - 1990. - Vol.49, №2. - P.179-185.

19. Neuzil J., Zhao M., Ostermann G. alpha-Tocopheryl succinate, an agent with in vivo anti-tumour activity, induces apoptosis by causing lysosomal instability // Biochem. J. - 2002. - Vol.362, №3. - Р.709-715.

20. Tsuburaya A., Blumberg D., Burt M., Brennan M.F. Energy depletion in the liver and in isolated hepatocytes of tumor-bearing animals // J.Surg.Res. - 1995. - Vol.59, №4. - P.421-427.

Изобретение относится к медицине и биологии и заключается в том, что опухоленосителю per os ежедневно дают препарат «олигохит актив» из расчета 20-24 мг на кг веса, общим курсом не менее 7 дней. Способ позволяет устранить дистрофические изменения в гепатоцитах, вызванные нарушениями обмена в организме опухоленосителя, улучшить пролиферативную активность гепатоцитов и восстановить микроциркуляцию. 1 табл.

Способ коррекции морфологического состояния печени опухоленосителя, заключающийся в том, что опухоленосителю per os ежедневно дают препарат «олигохит актив» из расчета 20-24 мг на 1 кг веса, общим курсом не менее 7 дней.