СПОСОБ ПОДГОТОВКИ ПРЕПАРАТА ДНК ИЗ БАКТЕРИАЛЬНЫХ КЛЕТОК ДЛЯ ПОСТАНОВКИ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ Российский патент 2005 года по МПК C07H21/00 C12N1/06 C12Q1/68 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в лабораторной и исследовательской практике для получения образцов ДНК из клеток микроорганизмов, находящихся в объектах внешней среды и биологических пробах, с целью последующей постановки полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Генодиагностические методы исследования обладают высокой чувствительностью и специфичностью. Метод ПЦР включает в себя три основных этапа; выделение ДНК, реакцию амплификации и визуализацию результатов. Подготовка биологического материала для ПЦР предполагает разрушение клеток и очистку ДНК от белковых, липидных, полисахаридных и прочих примесей, способных ингибировать реакцию. Основное требование при генодиагностике связано с необходимостью ускорения и упрощения первой стадии анализа - выделения ДНК в пригодной для постановки ПЦР форме.

Методики экстракции ДНК варьируют в значительной степени: от простого кипячения до сложных химических и физических способов.

Известен способ выделения ДНК из клеток микроорганизмов и животных пригодной для постановки полимеразной цепной реакции (патент РФ №2129610, С 12 N 15/10, С 12 Р 19/34, С 07 Н 21/04, G 01 Н 33/48). Для выделения ДНК исследуемый образе помещают в лизирующе-осаждающий раствор, включающий в себя 38 мкл 3,45 МаОН; 0,36 М NaCl и 144 мкл 96% этанола; суспензию перемешивают и оставляют при комнатной температуре в течение 10-15 мин. Затем дважды центрифугируют и осадок сушат при комнатной температуре в течение 5-10 мин. К сухому осадку добавляют 15 мкл ТЕ буфера.

Известен способ выделения ДНК из клеток микроорганизмов и животных (патент РФ №2177035, С 12 N 15/10, С 12 Р 19/34, С 07 Н 21/04), включающий обработку клеток буферным раствором, содержащим соль - хаотроп (гуанидинтиоцианат или гуанидинхлорид) и детергент (саркозил), с последующим нагреванием реакционной смеси на кипящей водяной бане в течение 3-7 мин и осаждением центрифугированием. Осадок, полученный после центрифугирования, содержащий геномную ДНК, прочно ассоциированную с клеточными оболочками микроорганизмов, промывают и суспендируют в ТЕ буфере.

Недостатки данных способов

1. Трудоемкость и многоэтапность.

2. Длительность.

3. Многократное центрифугирование приводит к потерям ДНК.

4. Метод предложен в одном случае для получения ДНК из клеток микроорганизмов и животных, а в другом выделяют ДНК, прочно ассоциированную с клеточной стенкой, что сужает возможности их применения в лабораторной практике.

Известно, что разделение компонентов на отдельные фракции сложных смесей, белков и нуклеиновых кислот возможно с использованием электрофореза. Принцип электрофоретического фракционирования основан на свойствах иммунокомпетентных клеток, субклеточных фракций, белков, вирусов, бактерий обладать электрическим различным по величине зарядом, зависящим от биополимеров и ионного состава окружающей среды. Различия в электрофоретической подвижности служат основой для их разделения. Существуют различные методы проведения электрофореза. Так, в частности, из литературы известно, что зональный электрофорез в градиенте плотности может быть использован как в аналитических, так и в препаративных целях при исследовании белков, анализе белковых смесей, оценке гетерогенности препаратов различных белков, изучении взаимодействий между белками и низкомолекулярными веществами. Белки сыворотки крови можно разделить методом электрофореза в градиенте плотности сахарозы за 42 часа (Гааль Э., Медьеши Г., Верецкеи Л. Электрофорез в разделении биологических макромолекул, М.: Мир, 1982 - 446 с.).

Наиболее близким техническим решением является способ выделения ДНК для проведения полимеразной цепной реакции с использованием электрофореза в свободном потоке (Корсуков В.Н., Гаранина С.Б., Куличенко А.Н., Меркулова Т.К., Синичкина Н.А., Попов Ю.А., Дроздов И.Г.// Детекция бруцелл с использованием полимеразной цепной реакции в пробах крови, обработанных ультразвуком и фракционированных по электрофоретической подвижности. Материалы VII съезда Всероссийского общества эпидемиологов и паразитологов. М. 1997.-T.I.- С. 382 - 383), заключающийся в том, что образец (в качестве образца использовали кровь) в объеме 1 мл, содержащий клетки бруцелл, обеззараживают добавлением мертиолята натрия в разведении 1:10000 с прогреванием при 56°С в течение 30 мин. Клетки разрушают воздействием ультразвука частой 44 кГц в течение 120 сек с использованием ультразвукового дезинтегратора УЗДН - 2Т. Разделение компонентов ультразвукового лизата по электрофоретической подвижности проводят с использованием непрерывного электрофореза в свободном потоке при напряжении 500 В, скорости протока разделительного буфера 500 мл/ч, скорости подачи образца 2 мл/ч на аппарате "Elphor-VAPS" (Bender Hobein GmbH, Германия).

В прототипе образец подается непрерывно в течение всего времени электрофоретического разделения с использованием специальной системы подачи в прямоугольную камеру, которая должна непрерывно охлаждаться при проведении электрофореза. Для проведения электрофореза необходимы два буфера: разделительный, непрерывно протекающий через разделительную камеру с постоянной заданной скоростью, и электродный, постоянно циркулирующий при заданной температуре в замкнутом контуре.

Применение непрерывного электрофореза в свободном потоке позволило освободиться от компонентов, ингибирующих ПЦР. В результате проведения электрофореза в разделительном буфере образец делится на ряд фракций, что приводит к уменьшению концентрации выделяемого вещества по сравнению с исходным образцом. Для повышения чувствительности метода ПЦР - диагностики необходимо увеличение концентрации выделенной ДНК, для чего вводят дополнительный этап концентрирования.

Недостатки способа

1. Сложность технологического процесса разделения образца, требующего дорогостоящего оборудования.

2. Уменьшение концентрации ДНК в процессе ее выделения, что вызывает введение дополнительного этапа концентрирования.

Задача - повышение концентрации очищенной ДНК, пригодной для постановки ПЦР, упрощение способа выделения, сокращение материальных затрат.

Задача решается тем, что предложен способ подготовки проб для ПЦР с использованием электрофореза в свободном потоке для разделения компонентов разрушенных клеток, образцов с оптимально подобранным температурным режимом, напряжением и временем разделения образца.

Предлагаемый способ выделения ДНК осуществляют следующим образом.

Образец, содержащий клетки бактерий, обеззараживают, разрушают и помещают на дно стеклянной трубки U - образной формы, предварительно заполненной охлажденным до + 4°С 0,033 М трис буфером рН 8,6. Разделение компонентов образца осуществляют с использованием электрофореза в свободном потоке при напряжении 100 В в течение 15 мин. Со стороны анода на границе раздела буфера и пробы отбирают 0,2 мл жидкости, содержащую ДНК.

Известно, что при электрофоретическом разделении в свободном потоке происходит конвекция, которая деформирует и смешивает разделяющиеся зоны. Для устранения данного явления применяют градиент плотности раствора и увеличение плотности буфера за счет понижения температуры с использованием термостатируемой бани (Гааль Э., Медьеши Г., Верецкеи Л. Электрофорез в разделении биологических макромолекул, М.: Мир, 1982 - 446 с.).

В заявляемом способе для того, чтобы свести к минимуму смешивание разделяющихся зон при подготовке образца для постановки ПЦР, разработан специальный режим разделения.

1. Используют буфер, предварительно охлажденный до + 4°С.

2. В образец добавляют сахарозу.

3. Оптимально подобраны время разделения и напряжение.

Таким образом, использование электрофореза в свободном потоке в заданном режиме позволяет осуществлять разделение пробы и получить высококонцентрированную ДНК, свободную от ингибирующих веществ, которую можно использовать для ПЦР.

Преимущества по сравнению с прототипом в отсутствии системы подачи образца и отбора фракций, системы охлаждения электрофоретической камеры, электродного буфера, получении более концентрированной ДНК, пригодной для постановки ПЦР, которые значительно упрощают процесс выделения и делают его более экономичным, эффективным.

Заявляемый способ предлагает более простое техническое решение - разделение происходит в круглом канале при отсутствии специальной системы охлаждения, образец подается до начала проведения электрофореза в полном объеме с добавлением сахарозы. Способ эффективен, так как позволяет выделить ДНК, пригодную для постановки ПЦР из малого количества исследуемого материала, позволяет уменьшить объем буферного раствора в 50 раз, снизить потери нуклеиновых кислот. Он прост в исполнении, не требует дорогостоящего оборудования, реактивов.

Заявляемый способ подготовки образца может быть использован в качестве первого этапа в ПЦР - диагностике и доступен для широкого практического применения.

Проведенный анализ патентной и специальной литературы показал, что данный способ отличается не только от прототипов, но и от других технических решений в данной области, так как нами не найден способ подготовки проб для ПЦР, в котором использован электрофорез в свободном потоке.

Пример 1. Пробы крови, содержащие клетки бактерий туляремийного микроба Francisella tularensis 15 НИИЭГ, согласно методическим указаниям МУ 3.5.5.1034-01 «Обеззараживание исследуемого материала, инфицированного бактериями I-IV групп патогенности, при работе методом ПЦР» обеззараживают добавлением мертиолята натрия в разведении 1:10000 с прогреванием при 56°С в течение 30 мин. Добавляют лизирующий буфер с гуанидинтиоционатом и прогревают при температуре 65°С в течение 15 минут.

В 0,5 мл пробы добавляют 0,2 г сахарозы и с помощью пастеровской пипетки ее растворяют. Стеклянную трубку диаметром 9 мм U - образной формы заполняют 0,033 М трис буфером рН 8.6, охлажденным до температуры +4°С. Для улучшения качества разделения образец пастеровской пипеткой переносят на дно трубки. Разделение компонентов лизата по электрофоретической подвижности проводят при напряжении 100 В в течение 15 мин. После электрофореза на границе раздела образца и электрофоретического буфера со стороны анода пастеровской пипеткой отбирают 200 мкл образца, содержащего ДНК бактерий.

Способ может быть дополнен этапом концентрирования ДНК, что позволяет повысить чувствительность. Концентрирование методом преципитации этанолом позволяет определять туляремийный микроб в концентрации 5×10² м. кл./мл.

Пример 2. Пробы мочи, содержащие клетки туляремийного микроба Francisella tularensis 15 (НИИЭГ), анализировали аналогично описанному в примере 1.

Пример 3. Пробы почвы, суспендированной в 0,033 М трис буфере рН 8,6, содержащие клетки туляремийного микроба Francisella tularensis 15 НИИЭГ, анализировали аналогично описанному в примере 1.

Пример 4. Пробы почвы, суспендированной в 0,033 М трис буфере рН 8,6, содержащие клетки чумного микроба тамм Yersinia pestis EV НИИЭГ, анализировали аналогично описанному в примере 1.

Для сравнительного анализа ставились результаты ПЦР с ДНК, полученной согласно способу, взятому в качестве прототипа, с использованием непрерывного электрофореза в свободном потоке при исходной концентрации образца 2×10² м. кл./мл. Результаты регистрации амплификации были отрицательными.

В заявляемом способе предлагаемые режимы являются необходимыми и достаточными для достижения поставленной задачи - выделение ДНК, пригодной для постановки ПЦР, а именно:

1. Напряжение, равное 100 В, - при разделении компонентов клеток необходимое и достаточное.

2. Время проведения электрофореза 15 минут, достаточное для разделения образца.

Таким образом, разработан эффективный более экономичный способ подготовки образцов для постановки ПЦР, позволяющий работать при соблюдении санитарно-эпидемиологических правил СП 1.3.1285-03 "Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)" и согласно методическим указаниям МУ 3.5.5.1034-01 "Обеззараживание исследуемого материала, инфицированного бактериями I-IV групп патогенности, при работе методом ПЦР".

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в лабораторной и исследовательской практике для получения препарата бактериальной ДНК. Способ получения препарата ДНК предусматривает разделение компонентов предварительно разрушенных бактериальных клеток электрофорезом в трубке U-образной формы и отбор фракции, содержащей ДНК, на границе раздела буфера и пробы. Применение изобретения позволяет упростить процесс получения препарата бактериальной ДНК для постановки полимеразной цепной реакции.

Способ подготовки препарата ДНК из бактериальных клеток для постановки полимеразной цепной реакции, включающий взятие образца, обеззараживание, разрушение бактериальных клеток, с последующим выделением ДНК электрофорезом в свободном потоке, отличающийся тем, что в образец добавляют сахарозу, электрофоретическое разделение компонентов клеток осуществляют в трубке U-образной формы, предварительно заполненной охлажденным до +4°С буфером, при напряжении 100 В в течение 15 мин, на границе раздела буфера и пробы отбирают фракцию, содержащую ДНК.