Набор олигонуклеотидных праймеров Ft 40 и способ определения бактерий Francisella tularensis (Варианты) Российский патент 2019 года по МПК C12N1/00 C12Q1/689 G01N33/569 

Изобретение относится к области медицины, биотехнологии, молекулярной биологии и может быть использовано для лабораторной диагностики туляремии, как в практическом здравоохранении, так и для научных исследований в области микробиологии, эпидемиологии и патогенеза туляремии.

Туляремия - зоонозная природно-очаговая инфекция, этиологическим агентом которой является Francisella tularensis, грамотрицательная внутриклеточная бактерия, регулярно вызывающая эпидемические вспышки, как среди животных, так и людей.

Вид F. tularensis имеет четыре подвида: holarctica, mediasiatica, novicida и tularensis. Особую опасность представляет F. tularensis subsp. tularensis. Установлено, что вдыхание 10 бактерий способно вызвать заболевание у человека (McCrumb F.R. 1961. Aerosol infection of man with Pasteurella tularensis. Bacteriological Reviews 25:262-267). Из-за высокой инфекционности при аэрогенном пути заражения F. tularensis классифицируется как биоагент 1 уровня опасности (категория А).

Несмотря на то, что «золотым» стандартом» для диагностирования туляремии все еще является культивирование микроорганизма, обычно оно не проводится из-за невысокой чувствительности и требовательности к условиям работы. Для обнаружения и идентификации F. tularensis испробованы такие методы, как биосенсоры, культивирование, иммунохроматографический анализ, ПЦР, биочипы на жидкой или твердой основе, методы аналитической химии (газовая хроматография, масс-спектрометрия и т.д.). Среди этих методов для обнаружения F. tularensis доминирующим является ПЦР. При мониторинге природных очагов туляремии и лабораторном исследовании материала на наличие F. tularensis только с использованием ПЦР возможно выявление единичных бактерий возбудителя туляремии (высокочувствительный и высокоспецифичный nested-вариант) (Татарников С.А., Мазепа А.В., Балахонов С.В. Оптимизация Nested-варианта полимеразной цепной реакции для мониторинга природных очагов туляремии. Инфекция и иммунитет. 2013. Т. 3. №2. С. 175).

Существующие коммерческие тест-системы и экспериментальные образцы диагностических препаратов позволяют охарактеризовать штаммы на наличие генетических детерминант, специфичных для вида F. tularensis, различных подвидов (гены chilf, RD1 и др.), штаммов разной вирулентности (pdpA, pdpD) и т.д. (Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней: Практическое руководство. Под редакцией Г.Г. Онищенко, В.В. Кутырева. - М.: ЗАО «Шико», 2013. - 560 с., Татарников С.А., Мазепа А.В., Дубровина В.И., Войткова В.В. Идентификация геномных областей pdpD и pdpA у туляремийного микроба разных подвидов. В книге «Биологическая безопасность в современном мире». 2009. С. 69-71).

Исследования молекулярно-генетической амплификационной технологии - loop-mediated isothermal amplification (LAMP) - показали высокую специфичность и амплификационную эффективность, которая достигается при изотермальных условиях реакции (Kaneko H., Kawana Т., Fukushima Е., Suzutani Т. Tolerance of loop-mediated isothermal amplification to a culture medium and biological substances. J. Biochem. Biophys. Methods. 2007. 70(3):499-501; Soto E., Hawke J.P., Fernandez D., Morales J.A. Francisella sp., an emerging pathogen of tilapia, Oreochromis niloticus (L.), in Costa Rica. J Fish Dis. 2009; 32(8):713-22). В LAMP используется 4 праймера, которые гомологичны шести участкам гена-мишени. Реакция протекает при постоянной температуре с использованием фермента, который катализирует реакцию синтеза новых цепей со смещением старых. Амплификацию и детектирование гена можно осуществить за одну стадию путем инкубации смеси образцов, праймеров, ДНК-полимеразы с функцией вытеснения цепей и субстратов при постоянной температуре (около 65°C). Эффективность амплификации очень высока, в течение 15-60 минут ДНК амплифицируется 10⁹-10¹⁰ раз. Из-за высокой специфичности присутствие амплифицированного продукта однозначно указывает на присутствие гена-мишени.

Известно об использовании подобного метода для выявления присутствия Francisella piscicida, этиологического агента франциселлеза атлантической трески (Gadus morhua) (Caipang С.М., Kulkarni A., Brinchmann M.F., Korsnes K., Kiron V. Detection of Francisella piscicida in Atlantic cod (Gadus morhua L) by the loop-mediated isothermal amplification (LAMP) reaction. Vet J 2010; 184(3): 357-61). Для детекции гена GroEL возбудителя был разработан набор праймеров (два внешних и два внутренних). Подбор условий LAMP показал оптимальную температуру реакции 63°C в течение 1 ч с использованием бактериальной геномной ДНК в качестве матрицы. Продукты реакции визуализировали в ультрафиолетовом свете и анализировали с помощью электрофореза в агарозном геле. Метод оказался высоко специфичен для обнаружения F. piscicida и в 100 раз более чувствителен, чем обычная ПЦР. Применение LAMP-анализа возможно не только для ДНК штаммов, но и для суспензий органов атлантической трески. Однако для патогенных для человека видов F. tularensis информации о разработанных праймерах и (или) диагностических LAMP-тестах в открытых источниках не обнаружено.

Известен фермент для проведения петлевой изотермической амплификации - Bst-полимераза, выделенная из Bacillus stearothermophilus (Nagamine K., Watanabe K., Ohtsuka K., Hase Т., Notomi Т., 2001. Loop-mediated isothermal amplification reaction using a non-denatured template. Clin. Chem., 47: 1742-1743). Bst-полимераза активна при температуре до 66°C, но оптимальной для нее является температура 60°C. Успех изотермической амплификации зависит от активности ферментов по вытеснению цепи и от их способности проходить такие сложные области ДНК, как шпильки.

Однако, в научных публикациях есть сообщения о появлении ложно-положительных сигналов при работе с Bst-полимеразой.

Проведенный поиск по патентным базам и научно-техническим источникам информации показал отсутствие сведений об отечественных наборах, предназначенных для выявления F. tularensis методом петлевой изотермической амплификации. Поэтому, существует необходимость создания такого диагностикума для быстрой, чувствительной и специфичной детекции ДНК туляремийного микроба.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является разработка высокоспецифичных олигонуклеотидных праймеров для быстрого, специфичного и чувствительного способа выявлении бактерий вида F. tularensis в биологических образцах, основанного на петлевой изотермической амплификации фрагмента гена-мишени.

Технический результат достигается тем, что предложен набор оригинальных праймеров SEQ ID №:2 (прямой внешний праймер Ft40-F3 F. tularensis);

SEQ ID №:3 (обратный внешний праймер Ft40-B3 F. tularensis);

SEQ ID №:4 (прямой внутренний праймер Ft40-FIP F, tularensis);

SEQ ID №:5 (обратный внутренний праймер Ft40-BIP F. tularensis) для способа детекции туляремийного микроба, при котором используется фермент SD-полимераза (Ignatov К.В., Barsova E.V., Fradkov A.F., Blagodatskich K.A., Kramarova T.V., Kramarov V.M. A strong strand displacement activity of thermostable DNA polymerase markedly improves the results of DNA amplification. BioTechniques. 2014; 57:81-7) в реакции петлевой изотермической амплификации в следующих условиях: предварительный прогрев смеси 92°C - 2 мин, амплификация 60°C - 60 мин, детекция продукта амплификации осуществляется при помощи электрофореза в агарозном геле по характерной электрофореграмме (вариант 1) или окрашивания продуктов реакции амплификации с помощью интеркалирующего красителя SYBR Green I (вариант 2)

Технический результат также достигается благодаря использованию в качестве целевой мишени гена ISFtu2, кодирующего инсерционный элемент, который присутствует в нескольких копиях только у F. tularensis.

Обоснование выбора олигонуклеотидных праймеров и ДНК-мишени.

В геноме туляремийного микроба обнаружены последовательности инсерционного элемента ISFtu2, который присутствует только у данного микроорганизма (Thomas R., Johansson A., Neeson В., Isherwood D., Sjostedt A., Ellis J., Titball R.W.. Discrimination of human pathogenic subspecies of Francisella tularensis by using restriction fragment length polymorphism. J. Clin. Microbiol. 2003. 41:50-57). Выбранный ген ISFtu2 присутствует в геноме вирулентных для человека подвидов F. tularensis в нескольких копиях. Последовательность SEQ ID №1 (ген-мишень ISFtu2) для подбора праймеров с целью детекции ДНК возбудителя туляремии методом петлевой изотермической амплификации была получена из базы GenBank NCBI (National Center for Biotechnology Information, США).

В экспериментах использовали штаммы F. tularensis, используя для выделения ДНК обеззараженные суспензии микроорганизма в концентрациях от 1×10⁶ м.к./мл до 1×10¹ м.к./мл. Апробация праймеров была осуществлена на наборе штаммов возбудителей туляремии из коллекции микроорганизмов Иркутского научно-исследовательского противочумного института Сибири и Дальнего Востока Роспотребнадзора.

Чувствительность реакции амплификации с праймерами оценивалась при исследовании проб ДНК, выделенных из десятикратных разведений чистых культур возбудителей туляремии.

Изобретение иллюстрируется следующими графическими материалами (табл. 1-4, фиг. 1-3) и примерами (1-3).

Таблица 1. Характеристика подобранных олигонуклеотидных праймеров для детекции возбудителя туляремии.

Таблица 2. Результаты амплификации ДНК штаммов возбудителя туляремии с набором LAMP-праймеров SEQ ID №2; SEQ ID №3, SEQ ID №4; SEQ ID №5 с помощью SD-полимеразы.

Таблица 3. Оценка специфичности набора LAMP-праймеров SEQ ID №2; SEQ ID №3, SEQ ID №4; SEQ ID №5.

Таблица 4. Результаты определения чувствительности набора LAMP-праймеров SEQ ID №2; SEQ ID №3, SEQ ID №4; SEQ ID №5 с помощью SD-полимеразы. Использована ДНК из штаммов F.tularensis ssp. holarctica И-393.

Фиг. 1. Последовательность SEQ ID №1 - нуклеотидная последовательность ISFtu2 из генома штамма Francisella tularensis subsp. tularensis SCHU S4. Серыми прямоугольниками выделены участки отжига праймеров и комплементарные им последовательности.

Фиг. 2 Определение специфичности LAMP-праймеров SEQ ID №2; SEQ ID №3, SEQ ID №4; SEQ ID №5 для детекции F. tularensis с помощью SD-полимеразы и ДНК гетерологичных штаммов.

Обозначения: 1 - маркер молекулярного веса ДНК (100-1000 п.н.), 2 - ДНК F. tularensis I-393, 3 - ДНК Y. pestis И-1251, 4 - ДНК Y. pseudotuberculosis И-226, 5 - ДНК Y. enterocolitica И-132, 6 - ДНК Escherichia coli 52, 7 - ДНК Bacillus anthracis И-362, 8 - отрицательный контроль LAMP (вода).

Фиг. 3. Результаты определения чувствительности набора LAMP-праймеров SEQ ID №2; SEQ ID №3, SEQ ID №4; SEQ ID №5 с помощью SD-полимеразы.

Обозначения: 1-6: ДНК выделена набором «Рибопреп», 1 - ДНК из взвеси бактерий 10⁶ м.к./мл, 2 - 10⁵ м.к./мл, 3 - 10⁴ м.к./мл, 4 - 10³ м.к./мл, 5 - 10² м.к./мл, 6 - 10 м.к./мл.

8-12: ДНК выделена термолизисом: 8 - ДНК из взвеси бактерий 10⁶ м.к./мл, 9 - 10⁵ м.к./мл, 10 - 10⁴ м.к./мл, 11 - 10³ м.к./мл, 12 - 10² м.к./мл, 13 - 10 м.к./мл. 14 - отрицательный контроль LAMP (вода), 7 - маркер молекулярного веса ДНК (100-1000 п.н.).

Фиг. 4. Результаты определения чувствительности набора LAMP-праймеров SEQ ID №2; SEQ ID №3, SEQ ID №4; SEQ ID №5 с помощью SD-полимеразы и окрашивания продуктов реакции SYBR Green I.

Обозначения: 1-7: ДНК выделена термолизисом: 1 - ДНК из взвеси бактерий 10⁶ м.к./мл, 2 - 10⁵ м.к./мл, 3 - 10⁴ м.к./мл, 4 - 10³ м.к./мл, 5 - 10² м.к./мл, 6 - 10 м.к./мл, 7 - отрицательный контроль LAMP (вода).

Примеры конкретного выполнения.

Пример 1. Методика конструирования олигонуклеотидных праймеров для детекции ДНК возбудителей туляремии методом петлевой изотермической амплификации.

На основе анализа in silico нуклеотидных последовательностей возбудителя туляремии, присутствующих в базе данных Genbank, для конструирования прямого и обратного внешних праймеров F3 и В3, прямого и обратного внутренних праймеров FIP и BIP был выбран участок генома F.tularensis размером 744 п.н. (GenBank NCBI, GeneID: 3192483), кодирующего инсерционный элемент. К участку гена SEQ ID №1 (фиг. 1) подобраны праймеры SEQ ID №2; SEQ ID №3, SEQ ID №4; SEQ ID №5. Расчетная длина предполагаемого ампликона, фланкируемого праймерами SEQ ID №2; SEQ ID №3, составила 201 п.н. (табл. 1). На Фиг. 1 показаны участки отжига праймеров и комплементарные им последовательности, которые выделены прямоугольниками серого цвета.

При выборе олигонуклеотидных праймеров использовали программу для расчета праймеров он-лайн Primer Explorer 5 (http://primerexplorer.jp/lampv5e/index.html). При подборе праймеров руководствовались требованиями к олигонуклеотидам, используемым в LAMP. Анализ формирования вторичных структур (димеров, шпилек) выбранными праймерами проводили с помощью компьютерной программы mfold (http://unafold.rna.albanv.edu/?q=mfold/DNA-Folding-Form). Структуры всех олигонуклеотидов сравнивались с помощью информационного ресурса NCBI BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) с последовательностями ДНК, размещенными в базе данных GenBank. При проведении этого анализа олигонуклеотиды с существенной гомологией с ДНК каких-либо других организмов исключали. Для определения специфичности праймеров моделировали ПЦР in silico в отношении секвенированных геномов микроорганизмов с помощью In silico PCR amplification (http://insilico.ehu.es/PCR/). Показана теоретическая пригодность праймеров для успешной инициации реакции амплификации и гибридизации.

Пример 2. Амплификация специфических фрагментов ДНК с помощью разработанных праймеров для детекции возбудителя туляремии методом петлевой изотермической амплификации.

Реакционная смесь объемом 50 мкл содержала 1х SD-буфер (РусЭнзим, Россия), 40 ед. SD-полимеразы (РусЭнзим, Россия), 3,5 мМ MgCl₂, 0,5 мМ каждого дНТФ, 4 праймера: 0,2 мкМ SEQ ID №2 (Ft40F3), 0,2 мкМ SEQ ID №3 (Ft40B3), 0,8 мкМ SEQ ID №4 (Ft40BIP), 0,8 мкМ SEQ ID №5 (Ft40FIP), 5 мкл матрицы. Реакцию проводили при температуре 60°C в течение 60 мин с предварительным прогревом при температуре 92°C в течение 2 мин на амплификаторе Терцик (ДНК-Технология). Электрофорез продуктов LAMP проводили в 1,2% агарозном геле в ТАЕ-буфере. Визуализацию осуществляли на УФ-трансиллюминаторе при длине волны 312 нм. (Вариант 1) Результат амплификации каждого штамма F. tularensis считался положительным в случае появления полос в виде лестницы (Вариант 1). Таблица 2 отображает результаты, полученные при амплификации ДНК штаммов возбудителя туляремии с набором праймеров, подобранных к последовательности SEQ ID №1.

По варианту 2 детекцию продуктов LAMP проводили с помощью окрашивания амплификатов интеркалирующим красителем SYBR Green I. Покраска образцов проводилась непосредственно после проведения реакции путем добавления красителя в реакцию до конечной концентрации 10х. Визуализацию осуществляли на УФ-трансиллюминаторе при длине волны 312 нм. Результат амплификации каждого штамма F. tularensis считался положительным в случае появления ярко-зеленого окрашивания после добавления S YBR Green I к амплификатам.

Пример 3. Определение специфичности и чувствительности реакции амплификации с помощью разработанных олигонуклеотидных праймеров к последовательности SEQ ID №1 для идентификации ДНК возбудителя туляремии.

Специфичность и чувствительность реакции амплификации с разработанными специфичными праймерами SEQ ID №2, SEQ ID №3, SEQ ID №4, SEQ ID №5 оценивалась при исследовании проб ДНК, выделенных из бактериальных взвесей клеток F. tularensis. Штаммы франциселл выращивали на чашках Петри с «FT-агаром» с добавлением полимиксина В (100 мкг/мл) в течение 48 ч при температуре (37+1)°C. Готовили бактериальные взвеси клеток в 2 мл 0,9% стерильного раствора натрия хлорида по отраслевому стандартному образцу мутности 10 единиц ГИСК им. Л.А. Тарасевича (ОСО 42-28-59-85 П), что соответствует 5×10⁹ м.к./мл для туляремийного микроба. Затем разводили в 0,9% стерильном растворе натрия хлорида таким образом, чтобы концентрация возбудителей туляремии составляла от 1×10⁶ до 1×10¹ м.к./мл. Испытаны два метода выделения ДНК: термоэкстракция (обеззараженные пробы прогревались при температуре 99°C в твердотельном термостате «Термит» в течение 30 мин) и выделение ДНК при помощи набора реагентов «Рибопреп» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора) в соответствии с инструкцией по применению.

Учитывая, что возбудитель туляремии относится к агентам I группы патогенности, пробоподготовку и обеззараживание материала для проведения ПЦР осуществляли согласно МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности» и МУ 3.1.2007-05 «Эпидемиологический надзор за туляремией».

Специфичность разработанных праймеров оценена на коллекции из 15 штаммов, из которых 10 штаммов Francisella tularensis (табл. 2) и 5 штаммов гетерологичных микроорганизмов (Yersinia pestis, Y. pseudotuberculosis, Y. enterocolitica, Escherichia coli, Bacillus anthracis) (табл. 3). Оценка специфичности показала отсутствие продуктов амплификации с ДНК гетерологичных штаммов (фиг. 2).

Чувствительность праймеров оценивали с помощью проб ДНК, выделенных из десятикратных разведений штаммов F. tularensis. Анализ результатов показал, что чувствительность разработанных праймеров составила 1×10³ м.к/мл (табл. 4, фиг. 3, фиг. 4).

Таким образом, разработанные праймеры могут быть использованы для обнаружения ДНК возбудителя туляремии и позволяют в короткий срок с высокой чувствительностью и специфичностью детектировать возбудителя туляремии в пробах чистых культур. В результате проведенной оценки установлено, что выбранные праймеры для детекции возбудителей туляремии методом петлевой изотермической реакции обладают 100% специфичностью и чувствительностью - 1×10³ м.к./мл.

Изобретение относится к областям биотехнологии, молекулярной биологии и медицинской микробиологии. Описан набор олигонуклеотидных праймеров для реакции петлевой изотермической амплификации (LAMP), который позволяет амплифицировать специфические для бактерий вида Francisella tularensis фрагменты ДНК из целевого гена, имеющего нуклеотидную последовательность SEQ ID №1. Описанный набор олигонуклеотидных праймеров включает: праймер FIP - «Ft40», имеющий нуклеотидную последовательность SEQ ID №2, праймер BIP - «Ft40», имеющий нуклеотидную последовательность SEQ ID №3, праймер F3 - «Ft40», имеющий нуклеотидную последовательность SEQ ID №4, праймер В3 - «Ft40», имеющий нуклеотидную последовательность SEQ ID №5. Заявленное изобретение позволяет в течение 1-2 часов с высокой специфичностью детектировать наличие возбудителя туляремии - Francisella tularensis в пробах чистых культур в концентрациях от 10-1000 мк в мл (в зависимости от штаммов). 3 н.п. ф-лы, 4 ил., 4 табл., 3 пр.

1. Набор олигонуклеотидных праймеров Ft40 для определения бактерий Francisella tularensis методом петлевой изотермической амплификации, содержащий олигонуклеотиды SEQ ID №2; SEQ ID №3; SEQ ID №4; SEQ ID №5, комплементарные к целевому гену-мишени lSFtu2 бактерий вида Francisella tularensis, кодируемому последовательностью SEQ ID №1.

2. Способ определения бактерий Francisella tularensis методом петлевой изотермической амплификации (LAMP), отличающийся тем, что в реакции амплификации участка последовательности целевого гена-мишени ISFtu2 бактерий вида Francisella tularensis используют набор олигонуклеотидных праймеров по п. 1, причем синтез и накопление в одной пробирке фрагментов гена-мишени происходит при 60°C в течение максимум 60 мин, а определение целевого гена-мишени проводят с помощью электрофореза в агарозном геле по характерной электрофореграмме.

3. Способ определения бактерий Francisella tularensis методом петлевой изотермической амплификации (LAMP), отличающийся тем, что в реакции амплификации участка последовательности целевого гена-мишени ISFtu2 бактерий вида Francisella tularensis используют набор олигонуклеотидных праймеров по п. 1, причем синтез и накопление в одной пробирке фрагментов гена-мишени происходит при 60°C в течение максимум 60 мин, а определение целевого гена-мишени проводят с помощью окрашивания продуктов реакции амплификации интеркалирующим красителем SYBRGreenI, а результат амплификации каждого штамма F. tularensis считают положительным в случае появления ярко-зеленого окрашивания.