СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КАЗАМИНОВЫХ КИСЛОТ Российский патент 2005 года по МПК C07K1/16 C07K4/12 

Изобретение относится к биотехнологии, генной инженерии и медицине, в частности к способам получения компонентов для питательных сред из гидролизатов животного белка.

Известен способ выделения активной фракции из ферментативно гидролизованного казеина методом гель-хроматографии на сефадексе G-25 и высушиванием сублимацией (Ибрагим Салам А. Гидролиз трипсином каппа казеина коровьего молока для получения стимуляторов роста Bifidobakterium longum. Chem. MicrobioL, Technol. Lebensm. - 1994. - 16, №3-4. С.69-72).

Известен также способ получения казаминовых кислот путем выделения активной фракции, включающей двойное экстрагирование сухого очищенного кислотно-гидролизованного казеина этанолом, распределительную хроматографию на бумаге, гелевую проникающую хроматографию на сефадексе G-15, затем G-10, кристаллизацию выпариванием в вакууме (Т.Керр, М.Вильямс и др. Очистка и выделение вещества, заменяющего никотиновую кислоту, из гидролизованного казеина. Журнал Молочная промышленность, Т.66, №4, апрель 1983. С.750-756).

Недостатками известных способов являются сложность технологического процесса и его использование только в аналитических целях.

Известен способ получения казаминовых кислот путем выделения активной фракции кислотно-гидролизованного казеина методом гель-хроматографии с последующим выпариванием элюента, причем, гель-хроматографии подвергают раствор неочищенного кислотно-гидролизованного казеина с содержанием общего азота 0,7-0,95 г в 100 мл раствора (RU 95112551, опубл.27.06.97, прототип).

Данный способ получения казаминовых кислот отличается простотой и невысокой себестоимостью, однако, функциональная активность получаемого продукта, зависящая от характеристики исходного продукта, вида элюента, марки сефадекса, а также режима выпаривания элюента не отличается стабильностью, а в ряде случаев совсем невысока.

Задача, решаемая заявленным изобретением, заключается в разработке простого и дешевого способа получения казаминовых кислот, отличающегося высокой ростстимулирующей активностью.

Поставленная в изобретении задача решена следующим путем.

Предложен способ получения казаминовых кислот, заключающийся в том, что раствор неочищенного кислотно-гидролизованного казеина с содержанием общего азота 0,7-0,95 г в 100 мл раствора и концентрацией кислотно-гидролизованного казеина 6-10% подвергают гель-хроматографии на сефадексе G-15, элюированию дистиллированной водой с последующим отбором активных фракций элюата и упариванием их под вакуумом.

Раствор неочищенного кислотно-гидролизованного казеина в дистиллированной воде с концентрацией 6-10% и с содержанием общего азота 0,7-0,95 г в 100 мл раствора представляет собой смесь белковых фракций и фракций иных примесей, которые методом гель-хроматографии на сефадексе G-15 могут быть разделены на дискретные белковые фракции и фракции иных примесей, поэтому раствор кислотно-гидролизованного казеина, как исходный продукт для получения казаминовых кислот, не требует предварительной очистки путем повторных многократных экстракций, повторной фильтрации, что значительно упрощает технологию получения казаминовых кислот и снижает себестоимость конечного продукта.

Отбор активных фракций элюата, соответствующих казаминовым кислотам, производят спектрофотометрией порций элюата (D₂₅₄), поскольку хроматографическая колонка настроена на полное отсутствие поглощения света при λ_{254 нм} получаемыми порциями элюата.

Параметры, характеризующие исходный раствор неочищенного кислотно-гидролизованного казеина и соответствующие 6-10% концентрации с содержанием общего азота 0,7-0,95 г в 100 мл раствора, являются оптимальными.

Экспериментальные данные подтверждают, что увеличение содержания общего азота в исходном растворе и увеличение концентрации кислотно-гидролизованного казеина в нем, делают его вязким и непригодным для разделения на фракции методом гель-хроматографии, уменьшение же концентрации и содержания азота снижает выход казаминовых кислот.

Упаривание порций элюата, содержащих активные фракции кислотно-гидролизованного казеина, производят при температуре элюата не более 55°С, поскольку повышение температуры влияет на функциональную активность конечного продукта, в частности, приводит к снижению ростстимулирующих свойств казаминовых кислот. Известно, что на сефадексах разных марок могут быть получены разные результаты.

Марка сефадекса G-15, использование дистиллированной воды в качестве элюента, а также исходный раствор неочищенного кислотно-гидролизованного казеина с содержанием общего азота 0,7-0,95 г в 100 мл раствора и концентрацией 6-10% позволяют именно в таком сочетании характеристик получить порции элюата, содержащие максимальное количество аминокислот и пептидов. Данные результаты получены экспериментальным путем.

Изобретение иллюстрируется чертежами.

На фиг.1 показана схема установки для осуществления данного способа, на фиг.2 - хроматограмма разделения элюата на фракции.

Установка для осуществления заявленного способа представляет собой герметичную систему, включающую индикатор расхода элюента А, ресивер В, манометр С, дозирующую камеру D, хроматографическую колонку Е, коллектор фракций F, спектрофотометр G, отметчик фракций I, самописец Н, которые технологически связаны между собой.

1,2,3,4,5,6,7 и 8 - задвижки, посредством которых осуществляют наличие либо отсутствие технологических связей между модулями А, В...Н установки для выполнения стадий заявленного способа получения казаминовых кислот.

Способ получения казаминовых кислот включает следующие операции:

- гель-хроматография неочищенного кислотно-гидролизованного казеина с содержанием общего азота 0,7-0,95 г в 100 мл раствора и концентрацией 6-10% на сефадексе G-15;

- элюирование дистиллированной водой фракций элюата;

- отбор активных фракций элюата спектрофотометрией порций элюата (D₂₅₄);

- упаривание активных фракций элюата под вакуумом и при температуре не более 55°С.

Заявленный способ осуществляют следующим образом. В дозирующую камеру D под давлением подают раствор неочищенного кислотно-гидролизованного казеина с содержанием общего азота 0,7-0,95 г 100 мл раствора и концентрацией 6-10% и посредством элюирующего раствора - дистиллированной воды - вытесняют его в хроматографическую колонку Е. Индикацию и отбор активных фракций элюата проводят, используя спектрофотометрию получаемых порций элюата. Коллектор F производит автоматический отбор фракций, спектрофотометр G - непрерывную регистрацию оптической плотности порций элюата, а самописец Н вычерчивает хроматограмму разделения элюата на фракции. Отбирают пробирки с порциями элюата, соответствующие активным фракциям, идентифицированным по поглощению света при строго определенной длине волны, которые затем подвергают высушиванию под вакуумом.

Пример конкретного выполнения.

Для гель-хроматографии использовали стеклянную хроматографическую колонку, которую заполняли сефадексом G-15.

В качестве элюирующего растворителя использовали дистиллированную воду (pH_1-2 O_c=7,0). Колонку считали готовой к работе при полном отсутствии поглощения света при λ_{254 нм} получаемыми порциями элюата.

Раствор неочищенного кислотно-гидролизованного казеина с содержанием общего азота 0,7-0,95 г в 100 мл раствора и концентрацией 6-10% подают в дозирующую камеру D и посредством элюирующего растворителя - дистиллированной воды - под давлением 0,5 кгс/см² вытесняют его в хроматографическую колонку, что обеспечивает расход элюента 6 мл/мин.

Элюцию активных фракций элюата производили в указанном выше режиме, используя спектрофотометрию получаемых порций элюата (D₂₅₄) для построения хроматограммы разделения элюата на фракции (фиг.2).

Содержавшие активные фракции порции элюата, идентифицированные по поглощению света при λ_{254 нм}, объединяли и затем высушивали под вакуумом при температуре не более 55°С.

Выход высушенных активных фракций элюата - казаминовых кислот - составил 90%. Казаминовые кислоты представляют собой однородный порошок белого цвета. По составу это смесь аминокислот и пептидов с молекулярной массой до 2200 D, наличием которых и обусловлена ростстимулирующая активность казаминовых кислот. Содержание общего азота составляет 12%, аминного азота - 0,7%.

Стимулирующие ростовые качества полученных казаминовых кислот определяли путем введения их в состав питательной среды и выращивания на ней тест-культур микроорганизмов.

Способность стимулировать рост микроорганизмов (ауксотрофных мутантов E.coli) оценивали по значениям оптической плотности (D_{540-560 нм}) культуры клеток в питательных средах М-9 с содержанием казаминовых кислот, составляющих 1%, полученных заявленным способом, сравнивали со значениями оптической плотности (D_{540-560 нм}) культуры клеток в питательной среде М-9 с 1% казаминовых кислот фирмы «Difco», поскольку способ получения казаминоьых кислот - прототип, в зависимости от конкретных условий его осуществления позволяет получить конечный продукт с нестабильными характеристиками, в то время как казаминовые кислоты фирмы «Difco» отличаются довольно высокой ростстимулирующей активностью. Поэтому сравнительная характеристика ростстимулирующей способности казаминовых кислот, полученных заявленным способом, и казаминовых кислот фирмы «Difco» может свидетельствовать о решении поставленной задачи - разработке простого и дешевого способа получения казаминовых кислот, отличающихся высокой ростстимулирующей активностью.

Измерение оптической плотности питательной среды проводили на фотоэлектрокалориметре при длине волны 540-560 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм.

Согласно закону Бугера-Ламберта-Бера, выражающего зависимость между светопропусканием раствора и его концентрацией, чем выше концентрация культуры клеток организмов в питательной среде, тем выше ее ростстимулирующая активность.

Сравнительная характеристика ростстимулирующей активности казаминовых кислот, полученных заявленным способом, и казаминовых кислот фирмы «Difco» представлена в табл.

Заявленный способ получения казаминовых кислот отличается простотой и невысокой себестоимостью конечного продукта при высокой его функциональной активности и позволяет получать казаминовые кислоты не только для анализа, но и наладить промышленный выпуск продукции, например, на предприятиях, производящих гидролизат казеина кислотного, который, минуя стадию ионообменной очистки, сразу же подвергают гель-хроматографии.

Изобретение относится к биотехнологии, генной инженерии и медицине, в частности к способам получения компонентов для питательных сред из гидролизатов животного белка. Предложен способ получения казаминовых кислот методом гель-хроматографии неочищенного кислотно-гидролизованного казеина с содержанием общего азота 0,7-0,95 г в 100 мл раствора и концентрацией 6-10% на сефадексе G-15, элюирование дистиллированной водой фракций элюата, отбор активных фракций элюата спектрофотометрией порций элюата (D₂₅₄), упаривание активных фракций под вакуумом и при температуре не более 55°С. Метод позволяет упростить и удешевить технологический процесс получения казаминовых кислот, а также получать казаминовые кислоты, обладающие высокой ростстимулирующей активностью. 1 з.п. ф-лы, 2 ил., 1 табл.

1. Способ получения казаминовых кислот путем выделения активной фракции из раствора неочищенного кислотно-гидролизованного казеина с содержанием общего азота 0,7-0,95 г в 100 мл раствора методом гель-хроматографии с последующим выпариванием элюента, отличающийся тем, что гель-хроматографию осуществляют на сефадексе G-15 с использованием в качестве элюента дистиллированной воды, при этом концентрацию неочищенного кислотно-гидролизованного казеина в растворе берут 6-10%, а выпаривание элюента производят при температуре не более 55°С.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что выделение активной фракции производят спектрофотометрией порций элюата (Д₂₅₄).