Металлопротеиназа Советский патент 1990 года по МПК C12N9/52 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к энзимологии, касается получения нового фермента, относящегося к протеолитическим ферментам и может найти применение в медицине при лечении ран, окогов,

других повреждений кожи и для полу чения культуры клеток.

Целью изобретения является получение нового фермента, обладаняцёго таким комплексом свойств, который за счет простого способа веделения, позволяет получить дешевый фермент.

Изобретение заключается в том, что бактерию Xantomonas sp. ВКМ В-124 выращивают на. питательной среде, содержащей источники углерода, азота, фосфора, а целевой продукт, вьщеляют из культуральной среды известными методами.

Из известных методов могут быть использованы дробное ацето- ном, фракционирование сульфатом аммония,. )иоиообменную хроматографию на ДЕАЕ-сефадексе и хроматографию -на сефадексе G-75,

Nd Si

По гучениый фермент является элект- рофорётически гомсзген шм и имеет следующие характеристшш; мол,м.28000 (при определении методом гель- фильтращш на сефадексе G-75), оптимум молярности 0,01-0,5 М, изозлект- ртсеская точка 5,0 (при определении Методом изоэлектрофокусирования в полиакриламвдпом геле и носителе ти- па амфолии с интервалом рН 3-10, оптимум температуры реакции.60 С, оптимум рН 8,0 (в трис-НС1 буфере при , субстрат - казеин), термостабильность при 40-46 С в течение 15 мин 100%, активность падает с 50 С (в трис-HCl буфере при рН 8,0), при 60°С - до, 50% (условия те же), константа Михаэлиса 3,2 мг/мл (субстрат казеин), ингибиторы ЭДТА (5x10 М) на 95%, не ингибируется ингибиторами сериновьк и тиоловых протеаз, в частности диизопропилфторфосфатом (5x10 М), катионы двухвалентных металлов восстанавливают активность 4 ермента после ингибирования ее ЭДТА

П р и м е р, В колбу емкостью 750 мл вносят 100 мл питательной среды состава, г/лх

Глюкоза10 9

Бактопентон БВК 3,00

Na2.HPO X 12 H,jO 1,50 КН2Р040,35

MgS04 X 0,35 FeSO X 7H20 0,05 NaCl0,35

Доводят pH среды до 7,0 раствором NaOH, среду стерилизуют. В колбу вносят клетки культуры продуцен- та Xantomonas sp. ВКМ В-124 до 5% и культивируют в течение 20 ч при 30 + 1°С на качалке (200 об/мин). Бактериальные клетки отделяют центрифугированием при 3000 об/мин на центрифуге К-70, Для выделения ме- таллопротеиназы фильтрат культураль- ной жидкости охлаждают до 4 С и проводят, дробное осаждение ацетоном. К 1 об. (5 л) ф1шьтрата культураль- ной жидкости добавляют охлажденный до ацетон, выдерживают 1 ч иа холоде, осадок отделяют центрифуги- рованием. К супернатанту добавляют адетон из расчета 1,5 об. ацетона на, 1 об. исходного фильтрата культу- ральной жидкости, выдерживают 1 ч на холоду. Осадок отделяют центрифугированием, растворяют в 0,5 л дис

.

5

Q j

5

тиллированной воды и проводят осаждение белков сульфгтом аммония. К раствору фермента добавляют сернокислый ам1-{оний из расчета 60% насьпце- ния, перемешивают 1 ч, осадок отделяют центрифугированием. К супернатанту добавляют сульфат аммония до 80% насьщения, оставляют на ночь и определяют осадок при 13000 об/мин на центрифуге К-24. Осадок растворяют в 5 л дистиллированной воды, диализуют против дистилл ированной воды, а затем - против 0,05М буфера, рН 8jO. Ратсвор металлопроте- иназы в 0,05М трис-ЙС1 буфера (рН8,0) наносят на хроматографическую колонку (5 X 60 см), заполненную ДЕЛЕ се- фадексом А-50 и уравновешенную тем же буфером. Элюирование фермента проводят градиентом концентрации х лорис- того натрия от-0,02 до 0,3 М. Фермент элюируется с колонки прр концентрации хлористого натрия 0,13М. Фракции (150 мл), соответствующие активности фермента, собирают и концентрируют, диализуя раствор фермента против сухого полиэтиленгликоля моЛеМ; 20000 Сконцентрнрованньй раствор фермента (3 мл) наносят на хроматографическую колонку (2,5 X 80 см) с сефадексом G-75 (тонкий), уравновешенным 0,1М трис -НС1 буфером, рН 7,5. Элюирование фермента проводят тем же буфером. Фракции, соответствующие активности фермента, объединяют, концентрируют диализом против полиэти- ленгликоля. Фермент хранят замороженным при -40°С или в лиофильно высушенном состоянии при -4 С. Ilpdte- олитическую активность определяют согласно известному методу в некоторой модификации пО степени гидролиза казеина. Для этого к 1 мл 1%-но- го раствора казеина добавляют 1 мл 0,1М трис-HCl буфера, рН 8;0 и 0,5 мл раствора фермента. Смесь инкубируют при До 20 мин и реакцию останавливают добавлением 1,5 мл 15%-ной трихлоруксусной кислоты, отфильтровывают осадок и определяют поглощение при 280 нм на спектрофотометре СФ-26. За единицу протеолитической активности принимают такое количество фермента, которое при 37 С в течение 1 мин освобождает 1 мкг-экви- валент тирозина (ТЗ).

Термостабильность фермента определяют, выдерясивая раствор фермента

51594214

(4 мкг/мл) в течение 15 мин при раз-

личных температурах (табл. 4), Затем раствор охлаждают до З7 с и 0,5 мл раствора фермента добавляют в реакционную смесь для определения остаточной активности.

Для определения зависимости активности фермента от температуры к 1 мл 1%-ного раствора казеина добавляют 1,0 мл 0,1М трис-HCl буфера, рН 8,0, вьздерживают 20 мин при различных температурах и затем добавляют раствор фермента (0,5 мл) и смесь вьщерживают от 5 до 20 мин в зависимости от температуры (табл. 2).

Определение изоэлектрической точки фермента проводят по известному методу, используя амфолины фирмы ЛВК с областью рН 3-6 и 3-10. Изофоку- сировку ведут в столбиках полиакрил- амидного геля при 1-2 мА на трубку в течение 3-3,5 ч. После окончания изофокусировки гели извлекают из трубок, разрезают на 30 ч., каждую часть заливают 1 мл О,1 М хлористого натрия и оставляют на ночь. Затем в каждой пробе измеряют рН, активность фермента.

Для определения константы Михаэли- са используют концентрацию казеина от 1 до 16 мг/мл при концентрациях фермента 0,66; 0,8; 1,3 мкг/мл.

Ингибирование активности фермента , определяют, инкубируя раствор фермента с ингибитором в концентрации 5 40 MB течение 30 мин при 37°С, а затем 0,5 мл раствора фермента с ингибитором вносят в реакционную смесь.

Молекулярную массу фермента определяют двумя методами - гель-фильтрацией и дискэлектрофореэом. Для определения молекулярной массы ферента гельфильтрацией кроматографи- ескую колонку (2,5x85 см) с сефа- ексом G-75 (тонкий) уравновешивают ,1 М трис-HCl буфером, рН 7,5, хроатографию ведут в том же буфере, спользуя в качестве маркеров бычий ывороточный альбумин (67000), оваль- умин (43000), химотрипсиноген (25000), цитохром (12400).

Определение гомогенности и молекуярной массы фермента проводят меодом дискэлектрофореза в 10%-ном олиакрилам -щном геле в присутствии одецилсульфата натрия. В качество аркеров используют те же белки, то и в случае гельфильтрации.

5 г

10

т к

15

20

25

3Q

во по эт

35

40

Са

Ва

ра

Ф

-е ба об но МО ме Gизре ро но рН ци бу те

50

гомогенного фермента J0,5

0

Выход гомогенного фермента составляет 3,9% от его содержания в культуральной жидкости. Активность

ТЭ

мг белка Полученная таким способом металлопро- теиназа является электрофоретически гомогенным ферментом и имеет следующие характеристики:

Мол.м.

Оптимум рН

(табл. 1)

5

Из оэлек триче с- кая точка Оптимум температуры реакции (табл. 2),°С

28000 2000

8,0

5,0

60

Оптимум моляр- ности (табл.З),М 0,01-0,05 Фермент стабилен (табл. 4) до температуры, С50 Константа fиxa- элиса (субстрат - казеин), мг

3,2

5-10

-э

мл Q Ингибируется

ЭДТА, М

Катионы двухвалентных металлов восстанавливают активность фермента после ингибирования ее ЭДТА и по этой способности образуют ряд:

5

0

2+

Со

г+

М8

Sr

21Zn

242-V

24Cd (табл. 6).

Са

Ва

Фермент не ингибируется ингибиторами сериновых и тиоловых протеаз (табл. 5).

Формула изобретения

е Металлопротеиназа, вьщеленная из бактерий Xantomonas sp. ВКМ В-124, обладающая протеолитической активностью и имеющая следующие свойства: МОЛ.М. 28000i2000 (при определении методом гельфильтрации на сефадексе G75, оптимум молярности 0,01-0,05 М, изоэлектрическая точка 5,0 (при определении методом изозлектрофокуси- рования в полиакриламвдном геле и носителе типа амфолин с интервалом рН 3-1Oj оптимум температуры реакции 60°С, рН оптимум 8,0 (в трис-HCl буфере при 37°С, субстрат казеин), термостабильность - активность падает

0

7159А214

с SO- C (в трис-HCl буфере при рН 8,0) () на 95%, не ингибируется ин- АО-Аб С в течение.15 мин - 100%, гибиторами сериновых и тиоловых про- до 50% (условия те же), кок- теаз, катионы двухвалентных метал- станта Михаэлиса 3,2 мг/мл (субст- лов восстанавливают активность фер- рат - казеин), ингибиторы - ЭДТА мента после ингибирования ее ЭДТА.

Таблица Определение зависимости активности металлопротеиназы

„„. .„..--...-..---- .11„....„..°™-.

Активность„г, о /о о 91 1 7i

10-, T3/wr i.37,68 .L.....

Таблица2 Определение зависимости активности металлопротеиназы т температурн

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к энзимологии, касается получения нового протеолитического фермента и может найти применение в медицине при лечении ран, ожогов, других повреждений кожи и для получения культуры клеток. Целью изобретения является получение нового фермента и удешевление его за счет простого способа выделения. Металлопротеиназа, выделенная из бактерий XANTOMONAS SP. ВКМ В-124, обладающая протеолитической активностью и имеющая следующие свойства : активность гомогенного фермента 10,5 ТЭ/мг белка, молекулярная масса 28000±2000 (при определении методом гельфильтрации на сефадексе G-75), оптимум молярности 0,01 - 0,05 М, оптимум температуры реакции 60°С, оптимум PH 8, термостабильность - активность падает с 50°С, константа Михаэлиса - 3,2 мг/мл (субстрат - казеин), ингибиторы - ЭДТА (5 .10 -3 М) на 95%, не ингибируется ингибиторами сериновых и тиоловых протеаз, катионы двухвалентных металлов восстанавливают активность фермента после ингибирования ЭДТА.

Температура

7с 22 25 30 35 40 45 50 55 60 65 J -H---.

Активность-г

Г/шг 0,95 1,77 2,70 3,87 4,92 7,08 9,25 11„74 1 ,33J,.33

ТаблицаЗ

определение зависимости актшшости металлопротзиназы от молярности

ТРИС-НС1 буфера, рН 8,0

моль

0,01

Концентрация, 5 0,10 0,20 0,30

. 9.10 .1.99 1.99 1,82 1,62 1.62

lO t,T3/Mn 2,10 1.99

-я

Т а б л и д а 4 Определение стабильности металлопротеиназы

Темйература,, -,

С 27 32 37 40 46 50 55 60 65 70

Активность„ ,л

Ю-, ТЗ/кл 3,33,3 3.3 3,1 3,1 2,7 2,4

у159421410 «

Т а б л и ц а 5

Влияние ингибиторов на активность металлопротеинаэа

имечание, ДИФ - диизопропипфторфосфат,

ФШФ - фенилметнлсульфоншт- фторщ, пХМБ -. хлррмеркурий- бензоат, ЭДТА - натриевая соль этилендиаминтетраук- сусйой кислоты.

Таблицаб

Восстановление активности металлопротеиназы катионами двухвалентных металлов

Са СО Mg2 мп Zn Ва Cd

34,0 23,0 17,0 13,2 12,t 9,9 9,1 7,5