Способ получения (-) (цис-1,2-эпоксипропил)-фосфоновой кислоты(фосфономицина) Советский патент 1974 года по МПК C12P9/00 A61K31/665 C12P9/00 C12R1/465 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ (-) (ЦИС-1,2-ЭПОКСИПРОПИЛ)ФОСФОНОВОЙ КИСЛОТЫ (ФОСФОНОМИЦИНА)

эпоксипропил)-фосфоновой кислоты могут также применяться для лечения заболеваний, вызванных бактериальными иифекциями, у людей и животных. Они являются особенно ценными в этом отношении, так как они активны против патогенных стойких штаммов. Эти соли особенно ценные и потому, что их можно вводить через рот, но они могут быть введены и инъекциями.

Пример 1. Лиофилизированную культуру Srteptomyces fradiae МА-2898 (АТСС .21096) используют для инокулирования 50 мл стерилизованной среды следуюшего состава, г/л:

Дрожжевой экстракт10

Глюкоза10

MgS04-7H200,5

Фосфатный буфер 2 мл

Дистиллированная вода Остальное Инокулированную колбу помещают на роторную качалку при 220 об/мин и инкубируют 48 ч при 28°С. Из полученной культуральной жидкости берут 10 мл инокулума для инокулироваиия колбы Эрленмейера на 2 л, содержаш,ей 500 мл стерилизованной среды такого же состава, как выше. Инокулированную колбу вновь помешают на качалку при 220 об/мин и инкубируют 48 ч при 28°С. Полученную культуральную жидкость используют для инокулирования ферментатора на 189,25 л из нержавеющей стали, содержащего 160 л, стерилизованной среды вышеуказанного состава. Инокулированную среду инкубируют при 28°С при перемешивании и подаче тока воздуха 0,8496 . Во время ферментации добавляют небольшое количество полигликоля с молекулярным весом 2000 для борьбы со вспениванием. Затем используют 25 л полученного ферментационного бульона для инокулирования ферментатора из нержавеющей стали на 200 галл, содержащего 510 л стерильной среды следующего состава, г/л:

Молотый овес 20

Барда10

Соевая мука20

Цитрат натрия2,0

Аскорбинат натрия0,5

Дистиллированная водаОстальное.

До стерилизации рН ферментационной среды 6,5. Инокулированную среду инкубируют при перемешивании при 28°С с пропусканием воздуха 0,2в317 в течение 3 дней. Во время ферментации добавляют небольшое количество противовспенивающего вещества полигликоля с молекулярным весом 2000. Затем культуральную жидкость фильтруют через диатомную землю. 100 галлонов отфильтрованной культуральной жидкости с рН 7 пропускают через колонку, содержащую сильноосновную анионнообменную смолу типа четвертичного аммония настирол-дивинилбен 91 г КН2РО4 и 95 г Na2HPO4 доводят до 1 л дистиллированной водой.

ЗОЛЬНОЙ матрице (Дауекс 1X2). Смолу элюируют 3%-ным раствором хлористого аммония в 90%-ном метаноле, элюаты собирают фракциями по 2 галлона. Фракции 4, 5 и 6 содержат большее количество антибиотика. Фракции 4 и 5 раздельно упаривают при пониженном давлении для удаления метанола до концентрации около 200 мг/мл твердых веществ. Затем 275 мл концентрата фракции

5, содержащего 51 г твердых веществ, пропускают через 8,9 л специального полиакрилоамидного геля, давая разделиться, обессолиться и сконцентрироваться веществам с молекулярным весом от

200 до 2000. Сорбированное на геле вещество элюируют со скоростью 50 мл/мин водой цри проверке элюата рефрактометром. Элюат выделяют фракциями, анализируют и соединяют активные фракции, в которых между 5600 и 6320 мл содержится 19,1 мг/мл твердых веществ с активностью 68 ед/мл по Proteus vilgaris на дисках и пластине. Это представляет (-) (цис-1,2-эпоксипропил)-фосфоновую кислоту с активностью 3,6 ед/мг.

Аналогично получают четыре дополнительные хроматограммы с использованием порций по 275 и 287 мл концентрата фракции 5 и двух порций по 285мл концентрата фракции 4. Активные фракции из всех ияти хроматограмм

соединяют и упаривают при пониженном давлении до 100 мг/мл. 660 мл полученного концентрата имеет активность 4,1 ед/мг. 100 мл этого концентрата пропускают через колонку, содержащую 2480 мл сильно кислой

катионнообменной смолы сульфонатного типа со стирол-дивинилбензольной матрицей в водородном цикле. Сорбированное вещество отмывают водой при расходе 19 мл/мин. Собирают фракции по 20,5 мл элюата, который проверяют записывающим рефрактометром. Фракции 52-62 анализируют и соединяют для получения водного раствора антибиотика.

Аналогично еще 5 порций по 100 мл концентрата хроматографируют на сильно кислой смоле. Наиболее активные фракции полученного элюата соединяют с фракциями 52-62 и получают всего 1870 мл. Этот водный раствор (-) (цис-1,2-эпоксипропил)-фосфоновой кислоты имеет рН 6,8, общее содержание твердых веществ 2,9 мг/мл, активность 70 ед/мл. Таким образом, активность натриевой соли антибиотика в этом водном растворе составляет 24 ед/мг.

Водный раствор затем упаривают при пониженном давлении и сушат вымораживанием с получением 4,7 г продукта.

Пример 2. Лиофилизованную культуру Streptomyces viridochromogenes МА-2903 (NiRRL-.3413) используют для инокулировация 50 мл среды следующего состава, г/л: Дрожжевой экстракт10

Глюкоза10

MgS04-7H200,05 Фосфатный буффер 2 мл Дистиллированная водаОстальное. Инокулированную среду в колбе Эрленмейера на 250 мл инкубируют прн 28°С в течение 3 дней на роторной качалке. Колбу с посевом первой генерации используют для инокуляции серии таких же колб. Посев второй генерации используют для инокуляции (с помощью 2,5%-ноге инокулума) серии из колб Эрленмейера на 2 л, содержащих 350 мл среды следующего состава, г/л: К2НР040,7 КН2Р04.0,3 Цитрат натрия 2Н200,5 MgSO4-7H2O0,1 Казаминовая кислота2,0 Декстроза (стерилизованная отдельно)10 Дистиллированная водаДо требуемого объема. Инокулированные колбы инкубируют при 28°С в течение 5 дней на роторной качалке при 145 об/мин. Полученные в колбах культуральные жидкости соединяют, фильтруют и анализируют. Дальнейшую обработку ведут известным способом. Пример 3. Лиофилизированную культуру Streptomyces wedmorensis МА-3269 (NiRRL-i3426) используют для инокулирования 50 мл стерильной среды из примера 2 в колбе на 250 мл. Инкулируют 3 дня при 28°С на роторной качалке при 220 об/мин. Полученный инокулум используют для инокулирования колб Эрленмейера на 250 мл, со 91 г КН2Р04 и 95 г Na2HPO4 доводят до 1 л дистиллированной водой.

Добавляют после доведения рН до 7. ержащих по 50 мл стерильной казеин-мясой среды следующего состава, г/л: Гидролизат казеина (N-Z-амин)2,5 Мясной экстракт1,0 NaCl5 Соевая мукаЮ Барда2 Кукурузная вымочка5 Декстроза20 К2ПРО42 СаСОз 10 Дистиллированная До требуемого вода объема. Инокулированные колбы выращивают 4 ня при 2в°С на роторной качалке при 220 об/мин. Полученную кзльтуральную жидкость центрифугируют. Зона ингибирования 25 мм на бумажных дисках 7 мм по методике анализа по Proteus vulgaris МВ-838. Дальнейшую обработку ведут известными способами. Предмет изобретения Способ получения (-) (дис-1,2-эпоксипропил)-фосфоновой кислоты (фосфономицина), отличающийся тем, что культуру - продуцент вида Streptomyces fradiae или Streptomyces viridochromogenes, или Streptomyces wedmorensis выращивают в аэробных условиях на среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, при 25-38°С и рН 5,5-7,5 с последующим выделением целевого продукта известными приемами.