СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ СУБТИПОВ РОТАВИРУСОВ P [8] ГЕНОТИПА (ВАРИАНТЫ) Российский патент 2005 года по МПК C12Q1/68 C12N15/46 

Предлагаемое изобретение относится к молекулярной биологии и медицине, в частности к дифференциации штаммов ротавирусов на основе анализа, включающего субтипирование ротавирусов P[8]-генотипа.

[Р]-генотип ротавируса определяется четвертым геномным сегментом, кодирующим серотиповой протеазочувствительный белок наружного капсида - VP4. Р[8]-генотип ротавируса является наиболее распространенным в мире.

Известны следующие способы дифференциации штаммов ротавирусов на основе анализа гена VP4:

1. Идентификация ротавирусов Р[8]-генотипа путем одноступенчатой полимеразной цепной реакции с использованием типового праймера на VP4 (Fisher Т.К., Steinsland H., Genth J.R. Genotype profiles of rotavirus strains from children in a suburban community in Guinea-Bissau, Western Africa // J. of Clin. Microbiol. - 2000. - V.38, №1. - P.264-267).

2. Идентификация субтипов Р[8]-генотипа путем определения нуклеотидной последовательности (секвенирования) коротких участков четвертого геномного сегмента (Maunula L., von Bonsdortf C.-H. Short sequences define genetic lineages: phylogenetic analysis of group rotaviruses based on partial sequences of genome segments 4 and 9 // J. of Gen. Virol.- 1998. - V.37. - P.321-332). Проведение идентификации Р-субтипа ротавируса путем секвенирования предполагает получение биотинилированного ПЦР-продукта, определение его нуклеотидной последовательности с применением радиоактивно-меченых нуклеотидов и дорогостоящего специализированного оборудования, а также проведение филогенетического анализа с использованием компьютерных программ.

Первый из этих способов позволяет выявлять только генотип Р[8], не определяя субтипы ротавируса. Секвенирование кДНК гена VP4 ротавируса наиболее близко предлагаемому изобретению по достигаемому эффекту, однако этот метод является многоступенчатым, сложным, малодоступным практическим лабораториям, обладает низкой пропускной способностью, что затрудняет проведение скрининговых исследований.

Цель изобретения - упрощение и увеличение пропускной способности способа идентификации субтипов ротавирусов Р[8]- генотипа.

Сущность изобретения заключается в том, что РНК ротавирусов Р[8]-генотипа подвергают обратной транскрипции и амплификации в однораундовой ПЦР с использованием общего прямого (F) праймера известного состава - 5'- tgg ctt cgc tca ttt ata dac a - 3' (Fisher T.K., Steinsland H, Genth J. R. J. of Clin. Microbiol. - 2000. - V.38., №1. - P.264-267) и предлагаемых нами олигонуклеотидных праймеров следующего состава: для Р[8]-1: 5'-сса ttt att tga ate gtt a-3'; для Р[8]-2: 5'-cca ttt atc tga ate att t-3', в результате чего получают фрагмент кДНК длиной 410 п.н. Полученные результаты анализируют с помощью электрофореза в агарозном геле.

Пример 1. Выбор последовательности праймеров.

Выбор последовательности праймеров проводят путем сравнительного анализа полных нуклеотидных последовательностей гена VP4 ротавируса человека Р[8]-генотипа, взятых в MBL/GenBank. Для анализа используют нуклеотидные последовательности 32-х штаммов ротавирусов человека, имеющих Р[8]-генотип. Субтиповые праймеры подбирают в регионе В, определяющем серотиповую и субтиповую специфичность вируса (252-540 н.о.).

Пример 2. Дифференциация ротавирусов на субтипы P[8]-1 и Р[8]-2 и оценка специфичности сконструированных праймеров.

Выделение РНК ротавирусов из фекальных проб производят с использованием стандартного метода фенол:хлороформной депротеинизации (Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование: Пер. с англ. - М.: Мир. - 1984. - С.186-192). Подготовленную пробу используют для обратной транскрипции (ОТ) и полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Реакцию обратной транскрипции проводят при 42°С в течение 45 мин в объеме 5 мкл. Предварительно 2,3 мкл выделенной РНК денатурируют в присутствии 2 мМ статистических гексануклеотидов в течение 5 мин при 94°С. Затем в пробирки вносят 1,7 мкл смеси, содержащей буфер для ревертазы M-MLV, 0,2 мМ каждого нуклеотидтрифосфата (дНТФ), 1 е.а. ингибитора РНКаз и 2 е.а. ревертазы M-MLV (Promega, США).

Амплификацию кДНК, полученную в ходе ОТ, проводят в объеме 25 мкл в термоциклере с активным регулированием "Терцик" ("ДНК-технология", Россия). Для этого к 5 мкл продуктов ОТ добавляют реакционную смесь, содержащую 10 мМ Трис-HCl, рН 8,3, 50 мМ KCl, 1.5 мМ MgCl₂, 0,2 мМ каждого дНТФ, 2 мкМ одного из предложенных праймеров, 2 мкл праймера F, 2 е.а. Tag-полимеразы. Для постановки ПЦР используют следующую программу: [96°С - 3 мин; (94°С - 45 сек, 55°С - 30 сек, 72°С - 45 сек)×42 цикла; 72°С - 5 мин]. Результатом амплификации является специфический фрагмент размером 410 п.н. Так как размер получаемого фрагмента одинаков для обоих субтипов, типирование каждой пробы проводят отдельно с каждым из предложенных субтиповых праймеров. Принадлежность штаммов ротавирусов к Р[8]-1 или к Р[8]-2 субтипу определяют по наличию фрагмента, синтезируемого при использовании того или иного праймера.

Идентификацию продуктов амплификации проводят методом электрофореза в 1,5% агарозном геле в присутствии бромида этидия с использованием 0,089 М трис-боратного буферного раствора, рН 8,0, при 110V на гель в течение 20 минут.

Для оценки специфичности предложенных праймеров используют РНК природных изолятов ротавирусов с различной электрофоретической подвижностью четвертого гена в полиакриламидном геле (ПААГ). С использованием секвенирования нуклеотидных последовательностей гена VP4 различной электрофоретической подвижности было установлено, что штаммы ротавирусов, характеризующиеся медленномигрирующим четвертым геном, могут относиться к Р[8]-1 субтипу, с быстромигрирующим четвертым геном - к Р[8]-2 субтипу [Maunula L. et al. // J. of Gen. Virol. - 1998. - V.37. - P.321-332].

Постановку ПЦР для субтипирования проводят с обеими группами изолятов ротавирусов, отличающихся по подвижности четвертого гена в ПААГ. В качестве контрольного образца используют референтный штамм ротавируса человека - Wa, имеющий Р[8]-генотип и Р[8]-1 субтип. Установлено, что предложенный праймер Р[8]-1 амплифицирует фрагмент генома только шт. Wa и ротавирусов с медленномигрирующим четвертым геном, а праймер P[8]-2 - выявляет фрагмент генома только у ротавирусов с быстромигрирующим четвертым геном и не амплифицирует геном шт. Wa.

Полученные результаты свидетельствуют о высокой специфичности сконструированных праймеров, применение которых делает возможным использование ОТ-ПЦР для субтипирования ротавирусов Р[8]-генотипа, упрощает и увеличивает пропускную способность дифференциации штаммов.

Изобретение может быть применено в научных исследованиях в области эпидемиологии для выявления ротавирусов Р[8]-генотипа различных субтипов с целью мониторинга циркуляции шт. ротавирусов и изучения их вариабельности, территориальной распространенности и связи субтипа ротавируса с клиническими проявлениями инфекции.

Метод разработан и апробирован в лаборатории молекулярной эпидемиологии вирусных инфекций Нижегородского НИИЭМ им. академика И.Н.Блохиной.

Изобретение относится к области молекулярной биологии и медицине. Предложены способы (варианты) идентификации субтипов ротавирусов Р[8] генотипа. Способ предусматривает выделение РНК ротавирусов с ее последующей обратной транскрипцией. Далее проводят однораундовую полимеразную цепную реакцию с последующим анализом полученных фрагментов в агарозном геле. При этом для идентификации Р[8]-1 субтипа используют праймер 5'-сса ttt att tga atc gtt a-3', а для идентификации Р[8]-2 субтипа используют праймер 5''-сса ttt ate tga ate att a-3'. Наличие определенного субтипа определяют по специфическому фрагменту размером 410 п.н. Предложенный способ упрощает и увеличивает пропускную способность дифференциации штаммов. Изобретение может быть использовано для выявления ротавирусов Р[8[-генотипа различных субтипов с целью мониторинга циркуляции штаммов ротавирусов и изучения их вариабельности, распространенности и клиническими проявлениями инфекции. 2 н.п. ф-лы.

1. Способ идентификации Р[8]-1 субтипа ротавируса, включающий выделение РНК ротавирусов, проведение обратной транскрипции РНК, последующее проведение однораундовой полимеразной цепной реакции и анализ полученных фрагментов в агарозном геле, отличающийся тем, что при проведении полимеразной цепной реакции используют праймер 5'-сса ttt att tga atc gtt a-3', а о наличии Р[8]-1 субтипа ротавируса судят по специфическому фрагменту размером 410 п.н.2. Способ идентификации Р[8]-2 субтипа ротавируса, включающий выделение РНК ротавирусов, проведение обратной транскрипции РНК, последующее проведение однораундовой полимеразной цепной реакции и анализ полученных фрагментов в агарозном геле, отличающийся тем, что при проведении полимеразной цепной реакции используют праймер 5'-сса ttt ate tga atc att а-3', а о наличии Р[8]-2 субтипа ротавируса судят по специфическому фрагменту размером 410 п.н.