СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ 5'-НТР ГЕНОМА ЭНТЕРОВИРУСОВ ГЕНОГРУППЫ ЭВI И ГЕНОГРУППЫ ЭВII С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ Российский патент 2012 года по МПК C12Q1/68 C12N15/41 

Изобретение относится к молекулярной биологии, медицине и промышленной микробиологии, в частности к дифференциальной индикации энтеровирусов человека на основе специфической амплификации фрагмента 5'-нетранслируемой области генома энтеровирусов.

В течение длительного времени дифференциация энтеровирусов проводилась с помощью классических вирусологических методов, основанных на реакции нейтрализации вируса специфичными гипериммунными сыворотками в культуре ткани. Метод культуры клеток длителен в исполнении, достаточно трудоемок, экономически затратен и не обладает чувствительностью в отношении энтеровирусов некоторых типов. По мере получения новых знаний о структуре генома и филогенетических взаимосвязях энтеровирусов разных типов стало возможным использование высокочувствительных и быстрых в исполнении молекулярно-генетических методов для дифференциального анализа этих вирусов.

Известны следующие способы типирования энтеровирусов путем анализа фрагментов кДНК, полученных методом ОТ-ПЦР непосредственно из исследуемых образцов (пробы клинического материала и из объектов внешней среды).

1. Генотипирование энтеровирусов путем секвенирования фрагмента области VP1 генома, полученного с использованием универсальных для энтеровирусов человека олигонуклеотидных праймеров (Nix W.A., Sensitive, seminested PCR amplification of VP1 seqences for direct identification of all enterovirus serotypes from original clinical spesimens / Nix W.A., M.S. Oberste and M.A. Pallansch / J. Clin. Microbiol - 2006. - Vol.44, №.8. - P.2698-2704).

2. Дифференциация энтеровирусов человека на две геногруппы по 5'-НТР генома методом ПЦР (Голицына Л.Н. / Оценка разработанного «nested» варианта ПЦР при выявлении энтеровирусов у больных. Голицына Л.Н., Новикова Н.А., Домбровская Л.К., Княгина О.Н., Новиков Д.В, Аркова Т.А. // Вопр. Вирусол. - 2002. - №5. - С.41-43).

В первом из способов ПЦР позволяет проводить только индикацию энтеровирусов, генотипирование выявленных вирусов проводится на втором этапе путем секвенирования. Кроме этого, данный метод не позволяет проводить дифференциацию энтеровирусов в том случае, если в исследуемом образце присутствуют энтеровирусы нескольких генотипов одновременно.

Во втором способе анализ генома энтеровирусов проводят в 2 раунда ПЦР, что удлиняет исследование и повышает риск контаминации пробы продуктом 1-го раунда ПЦР. Кроме этого, праймеры, представленные в данном способе, обладают меньшей специфичностью, так как были разработаны без учета современных знаний о новых штаммах и типах энтеровирусов человека.

Цель изобретения - повышение эффективности способа идентификации 5'-НТР генома энтеровирусов геногрупп ЭВI и ЭВII с использованием полимеразной цепной реакции.

Сущность изобретения заключается в том, что фрагмент кДНК энтеровирусов человека амплифицируют в однораундовой ПЦР с использованием предлагаемых нами олигонуклеотидных праймеров следующего состава: FEvI - agatcaggyc gatgagycac yg, в которой y означает с или t; FEvII - ttggaatctt ygaygcgttg с, в которой y означает с или t; REv - cacggwcacc caragtactc g, в которой w означает а или t; r означает а или g.

При использовании пары праймеров FEvI - REv получают фрагмент кДНК энтеровирусов геногруппы ЭВI размером 251 п.н., а при использовании пары FEvII - REv получают фрагмент кДНК энтеровирусов геногруппы ЭВII размером 295 п.н. Полученные результаты анализируют с помощью электрофореза в агарозном геле.

Пример 1. Выбор последовательности праймеров.

Выбор последовательности праймеров проводят путем сравнительного анализа полных нуклеотидных последовательностей 5'-НТР генома вирусов, принадлежащих роду Enterovirus семейства Picornaviridae: энтеровирусов человека, энтеровирусов животных, риновирусов и пикорнавирусов других родов: парэховирусов, кобувирусов, афтовирусов, кардиовирусов, вируса гепатита А. Последовательности представлены в базе нуклеотидных последовательностей GenBank/EMBL. Для анализа используют нуклеотидные последовательности генома 152 штаммов энтеровирусов человека, 5 штаммов энтеровирусов животных, 21 штамм других вышеперечисленных пикорнавирусов, имеющих значение в инфекционной патологии человека. Последовательности выравнивают с использованием программы ClustalW, находят регионы нуклеотидной последовательности данной области генома, консервативные в рамках группы энтеровирусов человека или каждой из геногрупп ЭВI и ЭВII, но вариабельные в отношении других пикорнавирусов. При выборе последовательности нуклеотидов с целью использования в качестве группоспецифических дифференцирующих праймеров и универсального праймера применяют следующие критерии: последовательность должна быть консервативна у разных штаммов энтеровирусов человека, принадлежащих одной 5'-НТР-геногруппе, но отличаться от соответствующих нуклеотидных последовательностей 5'-НТР генома энтеровирусов человека, принадлежащих другой геногруппе энтеровирусов и других пикорнавирусов. Выбирают участки прямой нуклеотидной последовательности (F) размером 22, 21 и 21 н.о., имеющие следующие последовательности:

у энтеровирусов геногруппы ЭВI - agatcaggyc gatgagycac yg;

у энтеровирусов геногруппы ЭВII - ttggaatctt ygaygcgttg с;

у энтеровирусов обеих геногрупп - 5'-cacggwcacc caragtactc g.

На следующем этапе выбранные последовательности анализируют с точки зрения их однородности у разных штаммов энтеровирусов, при наличии нуклеотидных замен (вариабельности какого-либо нуклеотида у разных штаммов) вводят вырожденные основания. Последовательность обратного праймера (R) устанавливают путем инвертирования прямой (F) последовательности.

Далее проводят сравнительный анализ с последовательностями 5'-НТР генома 5 штаммов энтеровирусов животных, 5 штаммов риновирусов человека, 6 штаммов парэховирусов, 2 штаммов вируса гепатита А, 1 штамма кобувируса Aichi, 5 штаммов афтовирусов, 2 штаммов кардиовирусов. Устанавливают, что гомология последовательностей в регионе праймеров FEvI, FEvII, REv с соответствующими последовательностями вышеназванных представителей семейства пикорнавирусов составляет 25-40%, что свидетельствует о теоретической специфичности выбранных олигонуклеотидов в отношении генома энтеровирусов человека.

Затем проводят сравнительный анализ последовательности праймера FEvI с 52 последовательностями 5'-НТР генома энтеровирусов геногруппы ЭВII, а последовательности праймера FEvII со 100 последовательностями 5'-НТР генома энтеровирусов геногруппы ЭВI. Устанавливают, что гомология последовательностей в регионе праймеров FEvI и FEvII с соответствующими последовательностями представителей внутри геногруппы составляет 90-100%, а среди представителей противоположных геногрупп энтеровирусов - 43-59%, что свидетельствует о теоретической специфичности выбранных олигонуклеотидов в отношении геногруппы энтеровирусов человека.

Пример 2. Идентификация 5'-НТР генома энтеровирусов геногруппы ЭВI и геногруппы ЭВII и оценка специфичности сконструированных праймеров.

Выделение РНК энтеровирусов проводят с использованием метода нуклеосорбции (Boom R. Rapid and simple method for purification of nucleic acids / R.Boom, C.J.Sol, M.M.Salimans et al. // J. Clin. Microbiol. - 1990. - Vol.28, №3. - P.495-500). Подготовленную пробу используют для постановки реакции обратной транскрипции, полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Амплификацию кДНК проводят в объеме 25 мкл в термоциклере с активным регулированием «Терцик-МС2» («ДНК-технология», Москва).

Для постановки ПЦР готовят реакционную смесь следующего состава: 10 мкл ПЦР-смеси, 2 мкл 4-компонентной смеси дНТФ, 2 мкл DEPC-воды, по 1 мкл прямого и обратного праймеров. В пробирку, содержащую 10 мкл ДНК, вносят 15 мкл смеси. Амплификацию фрагмента ДНК проводят в следующем режиме [94°С - 5 минут; (94°С - 10 сек, 55°С - 10 сек, 72°С - 10 сек) Х 42 цикла; 72°С - 5 мин]. Результатом амплификации является специфический фрагмент размером 251 п.н. для пары праймеров FEvI-REv и фрагмент размером 295 п.н. для пары праймеров FEvII-REv. Визуализацию продукта амплификации проводят методом электрофореза в 2,0% агарозном геле в присутствии бромида этидия с использованием 0,089 М трис-боратного буферного раствора, pH 8,0, при 110 V на гель в течение 20 минут. Для определения размера фрагмента используют маркер размерности ДНК 100-1000 п.н., производства ЗАО «Sileks».

Для оценки специфичности предложенных праймеров используют референтные штаммы энтеровирусов геногрупп ЭВI и ЭВII: вакцинный полиовирус типа 1 (ЭВII), вирус ЕСНО30 (ЭВI), вирус гепатита А, парэховирус человека 1 типа. Проводят ОТ-ПЦР с пробами указанных референтных штаммов. При анализе продуктов амплификации с помощью электрофореза в агарозном геле определяют наличие ампликонов размером 251 п.н. и 295 п.н. Устанавливают, что праймеры FEvI, FEvII, REv амплифицируют фрагменты генома искомого размера только при работе с энтеровирусами человека соответствующей геногруппы ЭВI и ЭВII, и не дают положительной или неспецифической реакции при анализе РНК энтеровирусов человека противоположной геногруппы и других пикорнавирусов (чертеж А, Б).

Полученные результаты свидетельствуют о высокой специфичности сконструированных праймеров в отношении геногруппы энтеровирусов человека, что позволяет использовать их для дифференциальной индикации энтеровирусов 5'-НТР геногруппы ЭВI и геногруппы ЭВII.

Изобретение может быть применено в научных исследованиях для получения новых знаний о роли энтеровирусов в инфекционной патологии человека, для изучения характера распространения и закономерностей циркуляции этих вирусов среди населения и представляет практический интерес для использования в системе мониторинга за ЭВИ в учреждениях Роспотребнадзора.

Метод разработан и апробирован на базе лаборатории молекулярной эпидемиологии вирусных инфекций Нижегородского НИИЭМ им. академика И.Н.Блохиной.

Перечень олигонуклеотидных последовательностей, представленных в заявке №2010114528/10(020449) от 12.04.2010 г.

Способ идентификации 5'-НТР генома энтеровирусов геногрупп ЭВI и ЭВII с использованием полимеразной цепной реакции.

FEvI - agatcaggyc gatgagycac yg,

в которой y означает с или t;

FEvII - ttggaatctt ygaygcgttg с,

в которой y означает с или t;

REv - cacggwcacc caragtactc g,

в которой w означает a или t; r означает a или g.

Изобретение относится к молекулярной биологии и медицине, в частности к методу диагностики энтеровирусной инфекции. Способ основан на проведении полимеразной цепной реакции кДНК генома энтеровирусов человека. При осуществлении способа используют оригинальные дифференцирующие, специфические в отношении геногруппы праймеры, соответствующие консервативным участкам 5'НТР-генома энтеровирусов геногруппы ЭВI и энтеровирусов геногруппы ЭВII. Последовательности олигонуклеотидов обеспечивают высокую специфичность способа, который может быть реализован в течение 3-5 часов. Способ может быть использован в генодиагностике энтеровирусной инфекции для обнаружения энтеровирусов в клиническом материале; в эпидемиологическом надзоре за энтеровирусной инфекцией для обнаружения РНК энтеровируса в объектах внешней среды; в научных исследованиях для специфической амплификации фрагментов генома энтеровирусов разных геногрупп, в том числе в микстовых пробах. 1 ил.

Способ идентификации 5'-НТР генома энтеровирусов геногрупп ЭВI и ЭВII, включающий выделение геномной РНК, проведение реакции обратной транскрипции, полимеразной цепной реакции и анализ полученных фрагментов ДНК в агарозном геле, отличающийся тем, что при проведении полимеразной цепной реакции используют олигонуклеотиды, имеющие следующие последовательности:
FEvI - agatcaggyc gatgagycac yg,
в которой y означает с или t;
FEvII - ttggaatctt ygaygcgttg с,
в которой y означает с или t;
REv - cacggwcacc caragtactc g,
в которой w означает а или t; r означает а или g,
о наличии энтеровирусов геногруппы ЭВI судят по специфическому фрагменту ДНК размером 251 п.н. при использовании пары FEvI-REv, о наличии энтеровирусов геногруппы ЭВII судят по специфическому фрагменту 295 п.н. при использовании пары FEvII-REv.