СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СРЕДСТВА ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ РЕСПИРАТОРНОГО МИКОПЛАЗМОЗА ПТИЦ И СПОСОБ ПРОФИЛАКТИКИ Российский патент 2005 года по МПК A61K39/02 C12N1/00 

Предлагаемое изобретение относится к области ветеринарии, в частности к птицеводству, а именно к способам получения профилактических средств против респираторного микоплазмоза птиц и к способам профилактики.

За последние годы в промышленном птицеводстве получил широкое распространение респираторный микоплазмоз (РМ) птиц - инфекционное заболевание, характеризующееся поражением респираторных органов и хроническим течением.

Искоренение подобных инфекций в промышленном птицеводстве до сих пор остается большой проблемой в яичном и мясном производстве, поскольку вызывает снижение продуктивности на 10-20 яиц на курицу-несушку и снижение на 10% прироста живой массы бройлеров.

Известен способ получения инактивированной сорбированной вакцины против респираторного микоплазмоза птиц, разработанной специалистами ВНИВИП (1).

Согласно данному способу получения вакцины против респираторного микоплазмоза птиц для выращивания культур микоплазм используют среду Эдварда, состоящую из отвара мышцы сердца крупного рогатого скота, обогащенного сывороткой крови лошади, дрожжевым экстрактом и глюкозой, или среду из гидролизата рыбного концентрата, также обогащенную вышеназванными веществами. Для инактивации культуры микоплазм используют формалин в конечной концентрации 0,3% относительно содержания формальдегида и выдерживают в термостате при температуре 37°С в течение 24 часов.

Инактивированную микробную массу смешивают с гелем гидроокиси алюминия до конечной его концентрации 1,5%. Смесь оставляют при температуре (10,0+0,5)°С на 48 часов для адсорбции микоплазм. Процесс адсорбции происходит при тщательном периодическом перемешивании смеси.

Полученное профилактическое средство применяют в хозяйствах, неблагополучных по респираторному микоплазмозу. Вакцинируют клинически здоровую птицу двукратно: в возрасте 1-2-х месяцев, в зависимости от сроков возникновения заболевания и за 10-15 дней до начала яйцекладки.

Вакцину применяют подкожно в верхнюю треть шеи. У вакцинированных цыплят и индюшат иммунитет наступает через 7-10 дней. Иммуногенность вакцины не менее 80%.

Однако использование в данном способе при культивировании Mycoplasma gallisepticum (M.G.) среды Эдварда, содержащей 20% сыворотки крови, имеющей нестабильный химический состав, а также способность протеинов сыворотки крови адсорбироваться на клеточной мембране микоплазменной клетки, приводит к нестабильному содержанию в сыворотке крови липидов и холестерина. К тому же данный способ вакцинации достаточно трудоемок и требует больших трудовых затрат при вакцинации.

В последние годы в США и других странах проводились работы по созданию липосом-адъювантных вакцин, которые завершились созданием ряда коммерческих биопрепаратов (2).

Наиболее близким к предполагаемому способу является способ получения липосом-адъювантных Mycoplasma gallisepticum вакцин, содержащих разные адъюванты для вакцинации кур-несушек (3). Способ включает выращивание М.gallisepticum (M.G.) организмов с последующим их смешиванием с многослойными положительно заряженными (МДС) липосомами или масляной эмульсией. Вакцинацию кур проводят дважды подкожно в 13-ти и 17-ти недельном возрасте.

Однако данный способ получения Mycoplasma gallisepticum вакцины нестабилен, к тому же способ введения полученной вакцины достаточно трудоемок ввиду необходимости индивидуального введения вакцины на больших стадах птицы.

Задачей, решаемой в рамках заявляемой группы изобретений, является разработка более универсального и технологически более простого способа получения профилактического средства против респираторного микоплазмоза птиц при сохранении высоких иммуногенных свойств получаемого препарата, а также удешевление и снижение трудоемкости и способа профилактики респираторного микоплазмоза на крупных стадах птиц при одновременном снижении стрессового воздействия на птицу.

Поставленная задача решается путем создания способа получения средства для профилактики респираторного микоплазмоза птиц, включающего выращивание культуры микоплазм с использованием штамма S₆ Mycoplasma gallisepticum в питательной среде при следующем соотношении ингредиентов, масс.%:

холестеринсодержащая липосомальная эмульсия0,3-1,2бычий-сывороточный альбумин0,8-1,0пептон0,8-1,2дрожжевой экстракт (50%)8,0-10,0глюкоза (40%)0,5-1,0фенол-рот (1% - раствор)0,02-0,025пенициллин 200 ЕД/см³10000-20000отвар сердечной мышцыостальное

при температуре 37-38°С не менее 4-5 суток с последующей инактивацией полученной биомассы теотропином в конечной его концентрации 0,2-0,3% в течение 24-48 часов, причем содержание холестерина в питательной среде составляет, по крайней мере, 0,05%.

Содержание холестерина в питательной среде в количестве не менее 0,05% обусловлено тем, что Mycoplasma gallisepticum относится к группе бактерий, требовательных к составу питательной среды, поэтому и культивирование производится на средах, обогащенных белками, холестерином и витаминами.

Заявляемый способ профилактики включает введение профилактического средства, полученного согласно способу, птице однократно в возрасте 30-35 дней интраокулярно, интраназально или путем выпаивання в дозе 0,05-1,0 см³ на голову, причем в неблагополучных хозяйствах препарат вводят птице повторно перед началом яйцекладки.

Введение меньших количеств не обеспечивает надежной профилактики, введение больших количеств неэффективно из экономических соображений. Как правило, показанием к применению данного профилактического средства является неблагополучие хозяйств по респираторному миконлазмозу птиц (проводятся серологические исследования на наличие антител к возбудителю респираторного микоплазмоза в сыворотке крови разновозрастных групп).

По сравнению с общепринятыми способами заявляемый способ профилактики обеспечивает снижение трудозатрат, повышение скорости вакцинации и уменьшение расхода лекарственного препарата, а также уменьшение стрессового состояния птицы.

Использование в заявляемом способе получения средства для профилактики респираторного микоплазмоза птиц питательной среды указанного состава приводит к стабильному и активному росту микоплазм, что в свою очередь положительно сказывается на иммуногенных свойствах получаемого препарата.

Применение в питательной среде для выращивания микоплазм искусственных холестеринсодержащих липосомальных препаратов позволяет стандартизировать и унифицировать способ получения лекарственного средства и придать ему иммуномодулирующие свойства.

Сущность и практическая применимость заявляемых изобретений иллюстрируется следующими примерами.

Производственные штаммы S₆ (Mycoplasma gallisepticum) хранятся в музее референтных штаммов микоплазм во ВНИВИП с паспортами, характеризующими их свойства. Они сохраняются в лиофилизированном состоянии в ампулах при температуре 4-6°С. Срок хранения 12 месяцев. Активность штамма S₆ (Mycoplasma gallisepticum) - не менее 10⁷-10⁸ КОЕ/см³.

Для приготовления питательной среды использовали холестеринсодержащую липосомальную эмульсию, представляющую собой жидкость молочно-белого цвета с везикулами среднего диаметра 0,1-0,5 мкм. Количественный состав везикулы - 22-24 мг/мл. Содержание холестерина в липосомальной эмульсии составляет не менее - 0,02822 г/г.

Пример 1.

Были приготовлены три образца питательных сред для выращивания микоплазм при различном содержании компонентов. Для контроля проводилось также культивирование микоплазм на среде Эдварда, содержащей ростовые компоненты. В готовые питательные среды (образцы 1, 2, 3) вносили по 10 см³ посевного материала референтного штамма S₆ Mycoplasma gallisepticum (М.G.), обладающего соответственными для микоплазм культурально-морфологическими и биохимическими свойствами. Колбы инкубировали в термостате при 37,0-37,5°С в течение 4-5 суток. После 4-5 суток культивирования наблюдали изменение цвета и помутнение среды, свидетельствующие о росте микроорганизмов. Результаты представлены в таблице 1.

Таблица 1.
Зависимость выхода колониеобразующих единиц (КОЕ) микоплазм от состава питательной среды.№ пп.Содержание компонентов питатательной среды, масс.%Образец №1Образец №2Образец №3Контроль1.Липосомальная холестеринсодержащая эмульсия0,30,91,2  50% дрожжевой экстракт8,09,010,0 Бычий-сыворот. альбумин(10%)0,80,91 Глюкоза (40%)0,50,71 Пептон0,811,2 Фенол-рот (1%)0,020,0220,025 Пенициллин 200 ЕД /см³10000100002×10000 Отвар сердечной мышцыОстальное до 100 см³2.Рост микоплазм (log КОЕ/см³)10⁷10⁸10⁸10⁸

Из таблицы 1 видим, что оптимальное количество липосомальной эмульсии составляет 0,3-1,2%, а бычьего-сывороточного альбумина - 0,8-1,0%. Количество колониеобразующих единиц (КОЕ) Mycoplasma gallisepticum (M.G.) составило 10⁷-10⁸/см³ в опыте и 10⁸/см³ в контроле.

Инактивацию возбудителя проводили препаратом "теотропин" в конечной концентрации 0,2-0,3% в течение 24-48 часов. Затем образцы полученного профилактического средства подлежали проверке на стерильность, безвредность и полноту инактивации микоплазм согласно ГОСТу (1).

Приготовленные образцы препарата были стерильные, безвредные для цыплят, обладали иммуногенной активностью, микоплазмы инактивированы.

Для изучения иммуногенных свойств использовали экспериментальную серию полученного препарата.

В опыте было четыре группы цыплят 25-ти суточного возраста по 10 голов в каждой.

Первой группе цыплят ввели полученный липосомальный препарат против респираторного микоплазмоза птиц в дозе 1 см³ подкожно в среднюю треть шеи.

Второй группе цыплят ввели вакцину против респираторного микоплазмоза птиц ипактивированную сорбированную (ВНИВИП) в дозе 1 см подкожно в среднюю треть шеи. (1) Третья группа цылят - контроль невакцинированные, зараженные (М.О.).

Четвертая группа цыплят - контроль невакцинированные и не зараженные.

Перед постановкой опыта у всех цыплят взяли кровь, и исследовали в сывороточно-капельной реакции агглютинации (СКРА) с цветным микоплазменным антигеном ВНИВИП. Сыворотки крови цыплят всех групп дали отрицательные показатели.

У подопытных цыплят определяли клеточный иммунитет на пятые, десятые и пятнадцатые сутки после вакцинации. Результаты определения клеточного иммунитета представлены в Таблице 2.

Таблица 2.
Результаты изучения клеточного иммунитета (Е=РОК %)Наименование группыЕ=РОК %5-ые сутки10-е сутки15-ые сутки1-ая опытная33,0028,0020,502-ая контрольная28,5024,0017,003-я контрольная16,0017,0016,004-ая контрольная16,0016,0016,00

Установлено, что клеточный иммунитет более выражен у цыплят первой группы и составил на 5-е сутки - 33,0%, на 10-ые сутки - 28,0% и на 15-е сутки - 20,5%. У цыплят второй группы показатели были соответственно - 28,5%, 24,0% и 17,0%. Из Таблицы 2 видно, что препарат, полученный согласно предлагаемому способу, обладает более выраженным проявлением клеточного иммунитета, что соответственно на 5-е сутки исследования - на 4,5%, на 10-е сутки - на 4,0%, на 15-е сутки - 3,5% выше по сравнению с контрольной. Гуморальный иммунитет определяли исследованием сыворотки крови цыплят в СКРА на 5-е, 10-е, 20-е, 40-е и 60-е сутки после иммунизации. На 60-е сутки после иммунизации цыплят первых 2-х групп заразили внутривенно культурой М.G. в дозе 1,0 см³. Результаты определения гуморального иммунитета представлены в Таблице 3. В результате установлено, что титр антител в сыворотке крови первых 2-х групп цыплят нарастал до 20-ти суток и удерживался до 60-ти суток. Иммунизированные цыплята первых 2-х групп на 21-е сутки после заражения M.G. оставались живыми, без проявления клинических признаков. У цыплят 3-й группы (контроль невакцинированные и незараженные) клинические признаки заболевания проявлены не были - (СКРА была отрицательная все дни исследования).

Таблица 3.
Результаты изучения гуморального иммунитета (СКРА)Наименование группыСывороточно-капельная реакция агглютинации (СКРА)   5-е сутки10 - сутки15-е сутки20-е сутки40-е сутки60-е суткипосле заражен. 21 - суткизаболело1 - опытная1,42,43,03,23 22,24,002 - контрольная1,62,23,23,43,42,04,003 - контрольная0000004,054 - контрольная00000000

В конце опыта цыплят исследовали на выделение микоплазм. Культуру M.G. изолировали только от цыплят 3-й группы - (контроль зараженные M.G.).

Таким образом, препарат, полученный согласно заявляемому способу, обладает иммуногенными свойствами, длительность иммунитета составляет 60 дней (срок наблюдения).

Для профилактики респираторного микоплазмоза полученный препарат используют в хозяйствах яичного и мясного направления, для чего вводят сельскохозяйственной птице в возрасте 30-35 дней однократно (в благополучных хозяйствах), либо вторично перед началом яйцекладки (в неблагополучных хозяйствах) интраокулярно, интраназально, либо путем выпаивания в дозе 0,05-1,0 см³ на голову.

Влияние способов введения средства для профилактики респираторного микоплазмоза птиц на проявление клеточного и гуморального иммунитета было изучено на 6-ти группах цыплят 25-30-суточного возраста, сформированных по 15 голов в каждой группе. Результаты исследования представлены соответственно в Таблице 4 и Таблице 5.

Как видим, предлагаемый способ профилактики респираторного микоплазмоза птиц прост, экономичен и удобен для использования на большом поголовье птицы.

Таблица 4.
Изучение влияния способов введения средства для профилактики респираторного микоплазмоза птиц на клеточный иммунитет.Номер группыСпособ введения профилактического средстваДоза (см³)Е-РОК, % 5-е сутки10-е сутки15-е сутки1.Интраокулярно0,0539,031,023,02.Интраназально0,0532,028,521,53.Выпаивание1,036,031,521,04.Контроль (вакцина инактив. против РМ (ВНИВИП)1,030,026,025,05.Контроль (невакцинированные зараженные)023,521,021,06.Контроль (невакцинированные незараженные)023,021,021,0

Таблица 5.
Изучение влияния способов введения средства для профилактики респираторного микоплазмоза птиц на гуморальный иммунитет.№ пп.Способ введенияДоза, см³Дни исследования (СКРА log 21)21-е сутки после иммунизацииПосле заражениязаболелопало14-е сутки21-е сутки40-е сутки  1.Интраокулярно0,055,05,04,94,8002.Интраназально0,054,54,44,64,5003.Выпаивание1,04,54,74,84,6004.Контроль(вакцина инактивиров. (ВНИВИП)1,03,13,83,83,8005.Контроль(не вакциниров зараженные)003,83,83,2006.Контроль(не вакцинир. незараженные)0000000

Проведенные испытания показали, что средство для профилактики респираторного микоплазмоза птиц, получаемое по предлагаемому способу, обладает ярко выраженной иммуногенной активностью, а способ профилактики позволяет снизить во много раз объем затрат при профилактике, уменьшает стрессовое воздействие на птицу.

Источники информации

1. "Вакцина инактивированная сорбированная". Технические условия ТУ 9384-006-00495674., 1998 г.

2. Muirhead. S. "Improved disease protection comes from liposome-adjuvanted vaccines." Feedstfuffs, 1988, 60,39; 12 (англ.) П-25238.

3. Barbour E.K., Newman J.A. "Preliminary data of effecacy of Mycoplasma gallisepticum vaccines contaning different adjuvants in laying hens" - Veterinari - Immunology and Immunopathology, 1990, Vol.26, №2, p.115-123.

Изобретение относится к области биотехнологии. Способ получения профилактического средства включает выращивание культуры микоплазм на питательной среде, содержащей в качестве стимулятора роста холестеринсодержащую липосомальную эмульсию, а в качестве источника белков - бычий сывороточный альбумин при следующем соотношении ингредиентов, масс.%: холестеринсодержащая липосомальная эмульсия -0,3-1,2; бычий сывороточный альбумин 0,8-1,0; пептон - 0,8-1,2; (50%) дрожжевой экстракт - 8,0-10,0; глюкоза (40%) - 0,5-1,0; фенол-рот (1%) - 0,02-0,025; пенициллин 200 ЕД/см³ - 10000-20000; отвар сердечной мышцы - остальное. Выращивание культуры микоплазм осуществляют с использованием штамма S₆ Mycoplasma gallisepticum с активностью не менее 10⁷-10⁸ КОЕ/см³ при температуре 37-38°С не менее 4-5 суток с последующей инактивацией теотропином в течение 24-48 часов в конечной его концентрации 0,2-0,3%, причем питательная среда содержит не менее 0,05% холестерина. Способ профилактики заключается во введении полученного предлагаемым способом профилактического средства сельскохозяйственной птице в возрасте 30-35 дней интраокулярно, интраназально, либо путем выпаивания в дозе 0,05-1,0 см³ на голову. В неблагополучных хозяйствах препарат вводят птице повторно перед началом яйцекладки. Изобретение позволяет повысить эффективность профилактики респираторного микоплазмоза и снизить стрессовое воздействие на птицу. 2 н. и 3 з.п. ф-лы, 5 табл.

1. Способ получения препарата для профилактики респираторного микоплазмоза птиц, включающий выращивание культуры микоплазм на питательной среде с последующей инактивацией полученной биомассы, отличающийся тем, что выращивание микоплазм проводят на питательной среде, которая в качестве стимулятора роста содержит холестеринсодержащую липосомальную эмульсию, а в качестве источника белков - бычий сывороточный альбумин при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Холестеринсодержащая липосомальная эмульсия0,3-1,2Пептон0,8-1,2Бычий сывороточный альбумин0,8-1,0Дрожжевой экстракт (50%)8,0-10,0Глюкоза (40%)0,5-1,0Фенол-рот (1%)0,02-0,025Пенициллин в количестве, обеспечивающем его содержание 10000-20000 ЕДОтвар сердечной мышцыОстальное

при температуре 37-38°С не менее 4-5 суток с последующей инактивацией полученной биомассы теотропином в течение 24-48 ч в конечной его концентрации 0,2-0,3%.