ЗАЩИТНАЯ СРЕДА ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ВИРУС-ВАКЦИН В ПТИЦЕВОДСТВЕ Российский патент 2007 года по МПК A61K39/12 A61K9/127 

Предлагаемое изобретение относится к области вирусологии и касается изготовления препаратов, используемых в ветеринарии, в частности может найти применение при изготовлении средств специфической защиты от инфекционного ларинготрахеита птиц и ньюкаслской болезни и др.

Известно применение защитной среды СПЛФ - 20% при изготовлении комбинированной вакцины против ньюкаслской болезни (НБ) и инфекционного ларинготрахеита птиц (ИЛТ) путем смешивания с ней вируссодержащих материалов вируса НБ из штамма "Ла-Сота" и вируса ИЛТ из штамма "ВНИИБП" [1].

Известно также применение защитной среды, содержащей пептон, пищевой желатин и сахарозу, взятые в соотношении 2:5:5, или пептон с сахарозой, или лактозу с пептоном и обезжиренное коровье молоко при получении средства для профилактики ИЛТ на основе штамма "ВНИИБП" [2].

Известно применение липосом в качестве защитной среды высушивания при изготовлении сухой вирус-вакцины из штамма "ВНИИБП" против ИЛТ [3].

Известная липосомальная защитная среда включает соевый лецитин (СЛ), кислые фосфолипиды сои (КФ), холестерин (ХС) и α-токоферол в соотношении 67,4:9,5:22,0:1,1.

Однако использование при производстве вирус-вакцин защитных сред, имеющих в своем составе пептон либо холестеринсодержащие компоненты, в настоящее время нежелательно в связи с возможной контаминацией их возбудителем губкообразной энцефалопатии крупного рогатого скота, опасного для здоровья человека [4].

Задачей заявляемого изобретения является создание защитной среды, используемой при производстве вирус-вакцин, исключающей возможность заражения губкообразной энцефалопатией крупного рогатого скота и одновременно способствующей получению высококачественных, высокоиммунных и биологически активных вакцин.

Поставленная задача решается тем, что в качестве защитной среды для вирус-вакцины применяют липоферол - липосомальный препарат антиоксидантного действия для внутривенного введения.

Липоферол - липосомальный препарат с DL-альфа-токоферолом для внутривенного введения.

Основные липидные компоненты липоферола выделены из отечественного сырья - фосфолипидов сои. Препарат получен пленочно-дисперсионным методом с последующим гомогенизированием компонентов под высоким давлением. В состав препарата входят фосфолипиды сои, DL-альфа-токоферол, сорбит-фосфатный буфер. Липоферол обладает антиоксидантным и мембраностабилизирующим действием, безвреден, нетоксичен, не вызывает аллергических реакций, не накапливается в организме вследствие полного метаболизма.

Применяется самостоятельно и в схемах комплексной терапии при ожоговом шоке, шокогенной травме, токсемиях различного происхождения, токсических и инфекционных гепатитах.

Разработчик и изготовитель препарата - Российский НИИ гематологии и трансфузиологии [5].

Для определения возможности использования липоферола в качестве защитной среды при производстве вирус-вакцин в птицеводстве были наработаны опытные партии липосомальной вирус-вакцины против инфекционного ларинготрахеита птиц (ИЛТ) и ассоциированной сухой липосомальной вирус-вакцины против инфекционного ларинготрахеита птиц (ИЛТ) и ньюкаслской болезни (НБ).

Для наработки опытных серий вирус-вакцин сухих липосомальных против ИЛТ использовали штамм "ВНИИБП", а для ассоциированной сухой липосомальной вирус-вакцины - сухой штамм "Ла-Сота" против НБ и штамм "ВНИИБП" против ИЛТ. Для получения вакцин вирусную суспензию указанных штаммов инокулировали в аллантоисную полость 9-суточным куриным эмбрионам (КЭ). На шестые сутки у эмбрионов, зараженных штаммом "ВНИИБП", собирали хориоаллантоисные оболочки (ХАО), а у эмбрионов, зараженных штаммом "Ла-Сота", - экстраэмбриональную жидкость.

Вируссодержащий материал штамма "ВНИИБП" и липосомальную эмульсию смешивали в соотношении 2:1, а аналогичный материал штаммов "ВНИИБП", "Ла-Сота" и липосомальную эмульсию - в соотношении 1:1:1.

Масса липосомальных вакцин после лиофильной сушки была однородной, пористой, беловато-розового цвета, при растворении в дистиллированной воде в течение 2-3 минут образовывала гомогенную взвесь. Вакцины были стерильны, не контаминированы чужеродными вирусами, биологически активны и иммуногенны. Десятикратные иммунизирующие дозы вакцин при окулярном применении оказались безвредными.

Пример 1.

В целях всесторонней оценки вирус-вакцины сухой липосомальной для специфической профилактики ИЛТ птиц была проведена ее комиссионная проверка в условиях производства на ЗАО "Птицефабрика "Синявинская", где выращивается птица яичного кросса "Хайсекс белый".

Вирус-вакцину сухую липосомальную против ИЛТ и коммерческую вакцину против ИЛТ применяли аэрозольным методом двукратно: в первый раз - в возрасте 34-35 дней в дозе 2,5 ЭИД_50/гол, второй раз - в возрасте 52-53 дня в дозе 7,5 ЭИД_50/гол, и одновременно с ней назначали вакцину из штамма "Ла-Сота" против ньюкаслской болезни в дозе 1100 ЭИД_50/гол.

В этот же день методом "спрей" проводилась иммунизация вакциной из штамма "Н-120" против ИБК.

Для испытаний было образовано две партии цыплят: опытная - для испытания липосомальной вакцины (серия 1), в количестве 37300 голов, и контрольная, где испытывалась коммерческая вакцина (серия №58), - в количестве 38000 голов.

Для вакцинации применена вирус-вакцина сухая липосомальная против ИЛТ птиц из штамма "ВНИИБП " серия №1 с биологической активностью 5,88 lg ЭИД_50/см ³ и коммерческая из этого же штамма вирус-вакцина сухая серии №58-5,7 lg ЭИД_50/см ³.

Эффективность аэрозольной иммунизации этих вакцин установлена путем определения титра антител в сыворотке крови цыплят методом ИФА в наборах фирмы "Биочек".

Средний титр антител во всех пробах сывороток крови до применения вакцин принадлежал к нулевой титрогруппе. После первой и второй иммунизации вирус-вакциной сухой липосомальной и коммерческой средний титр увеличился в 3-5 раз. Достоверной разницы в титрах антител после второй вакцинации между биопрепаратами не установлено. Испытания вирус-вакцины сухой липосомальной против ИЛТ показали, что она обеспечивает эффективную защиту при контрольном заражении патогенным вирусом ИЛТ (штамм "24а") и не уступает по этому показателю (94,4%) коммерческой вакцине (88,8%), в которой в качестве защитной среды используется пептон (ТУ 9384-001-00495674-96).

Пример 2.

Биологическая активность ассоциированной сухой липосомальной вирус-вакцины против НБ (штамм "Ла-Сота") и ИЛТ (штамм "ВНИИБП") определена сразу после изготовления и через 10 месяцев хранения. Результаты титрации сравнивали с контрольной комбинированной вакциной, приготовленной со стандартной защитной средой (среда ВНИВИП, содержащая пептон КРС).

Данные опыта по титрации вакцин, приготовленных на различных защитных средах, представлены в таблице.

Таблица Сравнительные показатели биологической активности вирусов ИЛТ и НБпри использовании различных защитных сред.Защитная средаБиологический титр lg ЭИД_50/см ³После изготовленияЧерез 10 мес. ИЛТНБИЛТНБЛипосомальная эмульсия6,0310,55,589,92Среда «ВНИВИП» на основе пептона6,0310,55,989,50

Как видно из данной таблицы, титр вируса ИЛТ и НБ в вакцине, приготовленной на основе различных защитных сред, был равнозначным. После 10 месяцев хранения титр вируса ИЛТ в липосомальной суспензии стал ниже на 0,4 lg ЭИД_50/см ³, а титр вируса НБ на среде с пептоном - на 0,42 lg ЭИД_50/см ³, что допустимо в пределах ошибки метода.

Таким образом, состав среды практически не влиял на титр вирусов, т.е. обе защитные среды могут быть использованы при производстве ассоциированной сухой липосомальной вирус-вакцины против НБ и ИЛТ.

Полученная ассоциированная сухая липосомальная вирус-вакцина против ИЛТ и НБ была стерильной. Введение цыплятам интраназально 10-кратной дозы этой вакцины не вызывало у них клинических признаков переболевания, угнетения в течение 10 дней наблюдения, т.е. вакцина была безвредной. При определении иммуногенности вакцины цыплят вакцинировали дважды в 20- и 40-суточном возрасте энтеральным и назальным методами.

При контрольном заражении вирулентным вирусом ИЛТ в группе невакцинированного контроля заболело 19 из 19 цыплят (100%) с клиникой ИЛТ (угнетение, отказ от корма, затрудненное дыхание, хрипы). В то время как, в группе цыплят, иммунизированных ассоциированной сухой липосомальной и коммерческой вирус-вакциной энтеральным методом, заболело по 2 головы (11,7%). При назальном методе вакцинации заболевших цыплят не было, а в группе привитых коммерческой вакциной заболел 1 цыпленок. Коэффициент корреляции (r) для иммунизированных цыплят составил 0,89-1,0, что указывает на тесную корреляционную связь с зараженным невакцинированным контролем. Эффективность иммунизации для ассоциированной сухой липосомальной вирус-вакцины составляла 88,3-100%, а для коммерческой - 88,39-94,1%.

При определении иммуногенных свойств ассоциированной сухой липосомальной вирус-вакцины против НБ в РЗГА титр равнялся 7,0-7,5 log₂, а коммерческой - 6,0 log₂. После второй вакцинации титр антигемагглютининов во всех группах цыплят был сравнительно одинаковым и колебался от 5,8 до 6,5 log₂, т.е. создавался надежный уровень защиты.

Таким образом, предлагаемые защитные среды могут быть использованы при производстве ассоциированной сухой липосомальной вирус-вакцины против НБ и ИЛТ, однако при применении в качестве защитной среды липосомальной эмульсии - липоферола - есть преимущества, поскольку она не содержит потенциального источника контаминации губкоообразной энцефалопатии крупного рогатого скота, опасного для человека.

Источники информации

1. Патент РФ №2106152, А61К 39/17, 39/245, 1998 г.

2. Малушко В.В., Соколов В.Д., Быков В.Ф., Чабанова Л.П., Шорников В.В. "Птицеводство", №12, 1983, с.21-23.

3. Новосадюк Т.В. "Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук " Липосомальная форма вакцины против ИЛТ птиц", СПб., 1998, с.10.

4. Костенко Ю.Г, Лисицын А.Б., Шагова Т.С., Тимошенко Н.В., Кобзев А.Н. «Проблема губкообразной энцефалопатии и производство кормов животного происхождения», «БИО», июль 2002 г., стр.26-28.

5. Патент РФ №2071765, А61К 9/127, 1997.

Изобретение относится к области биотехнологии. В качестве защитной среды используют липоферол - липосомальный препарат антиоксидантного действия для внутривенного введения. В состав липоферола входят фосфолипиды сои, DL-альфа-токоферол, сорбит-фосфатный буфер. Данная защитная среда исключает возможность заражения губкообразной энцефалопатией крупного рогатого скота и одновременно способствует получению высококачественных, высокоиммунных и биологически активных вакцин. 1 табл.

Применение липоферола - липосомального препарата антиоксидантного действия в качестве защитной среды для изготовления вирус-вакцин в птицеводстве.