НЕЙРОПРОТЕКТОРНОЕ СРЕДСТВО Российский патент 2006 года по МПК A61K31/18 A61P25/28 

Изобретение относится к медицине, а именно к фармакологии.

Изобретение касается расширения арсенала нейропротекторных средств путем использования для этой цели химического соединения хлоргидрат N-изопропиламид-2-(1-фенилэтил)аминоэтансульфокислоты.

Это соединение ранее описано в качестве противоязвенного средства [Сапронов Н.С., Гавровская Л.К., Селина Е.Н. Патент РФ №2179439, БИ №5 от 20.02.2002].

Полученное в результате химической реакции соединение хлоргидрат N-изопропиламид-2-(1-фенилэтил)аминоэтансульфокислоты нами было изучено на экспериментальных моделях по исследованию нейропротекторного действия.

Соединение не обладает токсическим действием, синтез его прост и доступен, поэтому оно представляет интерес для фармакологии.

Проведенные доклинические испытания препарата позволяют рекомендовать его в качестве нейропротекторного средства при поражениях головного и спинного мозга различной этиологии (атеросклероз сосудов головного мозга, инсульт, болезнь Альцгеймера, травмы).

Понятие нейропротекторного действия включает в себя: обеспечение необходимого (адекватного) кровоснабжения пораженной области мозга, воздействие на сложный каскад биохимических процессов, протекающих в ишемизированном мозге, восстановление метаболических и, следовательно, функциональных способностей головного мозга. Проявляя нейропротекторное действие подобные препараты уменьшают очаг поражения, нормализуют неврологические и биохимические показатели [Мирзоян Р.С. // Экспер. и клин. фармакол. - 2003. - №2. Т.66 - С.53-56].

Проблема профилактики и лечения заболеваний центральной нервной системы, связанная с нарушением высших функций мозга, остается одной из актуальных задач медицинской науки, т.к. она затрагивает как взрослых, так и детей. Этиология этих состояний связана с нарушениями мозгового кровообращения, травмами головного и спинного мозга, увеличением психических нагрузок, увеличением продолжительности жизни долгожителей, со значительным распространением психических расстройств у взрослых и детей.

Успехи науки, связанные с раскрытием многих нейрофизиологических и биохимических механизмов обучения и памяти, создали реальную основу применения различных воздействий для коррекции высших функций мозга [Бехтерева Н.П. Здоровый и больной мозг человека. 2-е изд. Л.: Наука, 1988. 238 с.; Островская Р.У. Экспер. клин. фармакол., 2003. Т.66. №2. С.32-37]. Особый интерес в этой связи представляют вещества, которые не только улучшают высшие функции мозга (мышление, память, внимание), но и, что самое главное, оказывают нейропротекторное действие к различным повреждающим внешним воздействиям (стресс, травма, шок, интоксикация). К таким веществам относят представителей разных классов фармакологических веществ, обладающих способностью улучшать высшие функции мозга и повышать адаптивные возможности организма.

Для лечения поражений головного и спинного мозга различной этиологии (атеросклероз сосудов головного мозга, инсульт, болезнь Альцгеймера, травмы) в клинической практике применяют ксантинола никотинат, этимизол, пирацетам, церебролизин [Машковский М.Д. Лекарственные средства. М.: Медицина, 1993. Т.1-2].

Ксантинола никотинат (ксантинол-никотинат) является веществом, способным оказывать нейропротекторное действие. Препарат усиливает мозговой кровоток и улучшает метаболические процессы мозга в послеоперационном периоде после удаления опухолей, ушибов, при диабетической ангиопатии, ретинопатии, при атеросклеротических нарушениях мозгового кровообращения, мигрени, синдроме Миньера. Для применения ксантинол-никотината имеются противопоказания, свойственные препаратам группы теофиллина и никотиновой кислоты (гиперфункция щитовидной железы, эпилептоидные припадки, острый инфаркт миокарда, сердечная недостаточность II-III степени, язвенная болезнь желудка и 12-перстной кишки) [Машковский М.Д. Лекарственные средства. М.: Медицина. 1993. Т.1-2].

Наибольшее распространение в практической медицине получил в последнее время препарат, который выбран авторами в качестве прототипа - пирацетам.

Пирацетам - ноотроп, улучшающий течение мозговых процессов, повышающий работоспособность, запоминание и облегчающий консолидацию следов памяти в разных вариантах классических и инструментальных условных рефлексов у животных, а также процессы обучения и памяти у человека. Эффект пирацетама особенно выражен при воздействии на мозг повреждающих агентов. Так, пирацетам уменьшает или предотвращает амнезию, вызванную электрошоком, пролином или ингибиторами биосинтеза белка [Островская Р.У. Экспер. клин. фармакол., 2003. Т.66. №2. С.32-37]. Пирацетам повышает устойчивость нейронов именно к тем повреждающим агентам, к которым особенно чувствительна мозговая ткань. Это послужило причиной их широкого использования у гериатрических больных, при явлениях церебрального атеросклероза, в посттравматическом периоде черепно-мозговой травмы, у детей с нарушениями интеллектуально-мнестической сферы. Однако по многим общефармакологическим тестам он чрезвычайно мало активен. Его острая токсичность (LD₅₀) составляет 10 г/кг. В сравнительно больших дозах не оказывает существенного влияния на сердечно-сосудистую систему, на периферические отделы нервной системы, не влияет на эффекты снотворных, не обладает анальгезирующим эффектом. При применении пирацетама возможны явления возбуждения: повышенная раздражительность, беспокойство, нарушение сна, диспептические расстройства, обострение коронарной недостаточности у больных пожилого возраста [Машковский М.Д. Лекарственные средства. М.: Медицина. 1993. Т.1-2].

Целью предлагаемого изобретения является поиск препарата среди известных химических соединений, который бы обладал высокой биологической активностью в отношении нейропротекторных свойств, не имел побочного действия, и мог использоваться при поражениях головного и спинного мозга различной этиологии (атеросклероз сосудов головного мозга, инсульт, болезнь Альцгеймера, травмы).

Задача, которую решает данное изобретение, состоит в том, чтобы в эксперименте у соединения хлоргидрат N-изопропиламид-2-(1-фенилэтил)аминоэтансульфокислоты обнаружить нейропротекторные свойства, выражающиеся в улучшении когнитивной функции головного мозга при амнезии; повышении выживаемости животных и восстановлении нарушенных процессов метаболизма при ишемии головного и спинного мозга.

Нейропротекторное действие хлоргидрата N-изопропиламид-2-(1-фенилэтил)аминоэтансульфокислоты исследовали на моделях: 1) ретроградной амнезии у крыс (по изменению условной реакции пассивного избегания (УРПИ), вызванной электроконвульсивным шоком, введением коразола или скополамина); 2) ишемии головного мозга у крыс (ИГМ) с билатеральной окклюзией общих сонных артерий (БООАС); 3) компрессионного повреждения спинного мозга (КПСМ).

1. Изучение антиамнестической активности хлоргидрата N-изопропиламид-2-(1-фенилэтил)аминоэтансульфокислоты

Для оценки влияния веществ на формирование и воспроизведение памятного следа в норме и в условиях его нарушения (амнезия) базисной моделью является методика условного рефлекса пассивного избегания (УРПИ). Преимуществами этой методики является быстрота выработки рефлекса (обучение с одной пробы). Обучение животных проводили в установке, состоящей из двух отсеков: затемненного и освещенного, соединенных дверцей. Помещенное в освещенный отсек животное довольно быстро переходит через дверь в затемненнный отсек (норковый рефлекс) и затем, через определенный период пребывания в темном отсеке, получает электрокожное раздражение через электродный пол. Контрольное тестирование (проверку сохранения навыка) проводили через 24 часа после обучения УРПИ. При обучении и тестировании оценивали процент крыс, не зашедших в темную камеру, латентный период первого захождения в нее, суммарное время нахождения в освещенной части установки и число захождении в темную камеру. Исследуемые вещества вводили однократно внутрибрюшинно непосредственно после обучения реакции. Увеличение латентного периода захождения в темную камеру (и соответственно суммарного времени пребывания в освещенной части установки) квалифицировали как улучшение сохранения УРПИ; обратные взаимоотношения оценивали как амнезию реакции [Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. М.: Ремедиум. 2000. С.154].

Способность хлоргидрата N-изопропиламид-2-(1-фенилэтил)аминоэтансульфокислоты повышать устойчивость центральной нервной системы (ЦНС) к повреждающим внешним воздействиям исследовали на моделях амнезии УРПИ, вызванной электроконвульсивным шоком, введением коразола или скополамина.

Модель амнезии УРПИ, вызванной электроконвульсивным шоком

В эксперименте 40 крыс самцов массой 220 г подвергали действию электрическим током через электроды, наложенные на роговицу глаз крыс (20 мА, 500 мсек, 50 Гц) непосредственно после выработки УРПИ. Воспроизведение рефлекса осуществляли через 24 часа. Исследуемые вещества вводили однократно внутрибрюшинно непосредственно после сеанса обучения (в случае электрошока в период генерализованых судорог, обусловленных током). Регистрировали латентное время первого захождения животного в темный опасный отсек и общее время пребывания животного в темном и светлом отсеках за определенный период времени (3 минуты).

Электрошок у крыс вызывал амнезию УРПИ, выражающуюся в уменьшении латентного времени захождения в темный опасный отсек, уменьшении суммарного времени пребывания в освещеннной камере, а следовательно, в увеличении времени пребывания в темном отсеке (таблица 1).

Антиамнестическая активность хлоргидрата N-изопропиламид-2-(1-фенилэтил)аминоэтансульфокислоты выражалась в устранении амнезирующего действия электрошока в дозе 25 мг/кг (внутрибрюшинно), что характеризовалось увеличением латентного времени захождения в темную камеру и увеличением суммарного времени пребывания в освещенной камере при воспроизведении рефлекса. Препараты сравнения пирацетам и этимизол были неактивны по данному тесту (таблица 1).

Таблица 1
Влияние хлоргидрата N-изопропиламид-2-(1-фенилэтил)аминоэтансульфокислоты на нарушения сохранения УРГТИ у крыс, вызванные электроконвульсивным шокомГруппы животных
N=10Показатели сохранения УРПИ через 24 ч и после обучения% крыс без амнезииЛатентный период захождения в темную камеру (сек)Суммарное время пребывания в освещеннной камере (сек)Число захождений в темную камеруХлоргидрат N-изопро-пиламид-2-(1-фенилэтил)-аминоэтансульфокислоты 25 мг/кг, внутрибрюшинно30±1552,7±19,0*52,7±19,0*1,0±0,2Пирацетам 200 мг/кг, внутрибрюшинно0±1018,9±5,321,3±5,81,0±0,3Этимизол 1,5 мг/кг, внутрибрюшинно0±1014,3±4,514,3±4,51,0±0,3Контроль (электрошок)0±1012,9±3,414,5±3,81,1±0,1Примечание. * Р<0,05 по отношению к контролю.

Сходная картина отмечена и в условиях амнезии, обусловленной коразолом.

Модель амнезии УРПИ, вызванной введением коразола

В опыте у 40 крыс самцов массой 220 г амнезию УРПИ вызывали введением коразола внутрибрюшинно в дозе 50 мг/кг за 0,5 часа до выработки УРПИ. Воспроизведение рефлекса осуществляли через 24 часа. Исследуемые вещества вводили однократно внутрибрюшинно непосредственно после сеанса обучения.

Регистрировали такие же показатели как при амнезии, вызванной электрошоковой амнезией.

Хлоргидрат N-изопропиламид-2-(1-фенилэтил)аминоэтансульфокислоты, обладающий антиамнестическими свойствами на модели электрошоковой амнезии, был активен также после введения конвульсанта коразола (таблица 2). В условиях амнезии, обусловленной введением коразола, лучшие результаты получены у заявляемого соединения, хотя антиамнестический эффект наблюдали и у этимизола.

Таблица 2
Влияние хлоргидрата N-изопропиламид-2-(1-фенилэтил)аминоэтансульфокислоты на нарушения сохранения УРПИ у крыс, вызванные введением коразола (50 мг/кг)Группы животных
N=10Показатели сохранения УРПИ через 24 ч и после обученияЛатентный период захождения в темную камеру (сек)Суммарное время пребывания в освещеннной камере (сек)Число захождений в темную камеруХлоргидрат N-изопропиламид-2-(1-фенилэтил)-ами-ноэтансульфокислоты 25 мг/кг, внутрибрюшинно48,4±12,6*48,4±12,60,8±0,2Пирацетам 200 мг/кг, внутрибрюшинно24,2±8,425,8±8,30,8±0,2Этимизол 1,5 мг/кг, внутрибрюшинно40,6±7,540,6±7,50,7±0,2Контроль (физиологический раствор), внутрибрюшинно14,3±3,119,2±3,81,3±0,1Примечание. * Р>0,05 по отношению к контролю.

Модель амнезии УРПИ, вызванной введением скополамина

Антиамнестическое действие заявляемого соединения проверяли на модели с введением скополамина, когда 40 крысам самцам массой 220 г вводили скополамин внутрибрюшинно в дозе 1 мг/кг за 1 час до обучения. Воспроизведение рефлекса осуществляли через 24 часа. Исследуемые вещества вводили однократно внутрибрюшинно непосредственно после выработки УРПИ. Регистрировали такие же показатели как при амнезии, вызванной электрошоковой амнезией.

В условиях амнезии, обусловленной введением скополамина, хлоргидрат N-изопропиламид-2-(1-фенилэтил)аминоэтансульфокислоты также оказывал антиамнестическое действие (таблица 3). Из препаратов сравнения только пирацетам предотвращал развитие нарушений памяти у животных.

Таблица 3
Влияние хлоргидрата N-изопропиламид-2-(1-фенилэтил)аминоэтансульфокислоты на нарушения сохранения УРПИ у крыс, вызванные введением скополамина (1 мг/кг)Группы животных N=10Показатели сохранения УРПИ через 24 ч и после обучения% крыс без амнезииЛатентный период захождения в темную камеру (сек)Суммарное время пребывания в освещеннной камере (сек)Число захождении в темную камеруХлоргидрат N-изопро-пиламид-2-(1-фенил-этил)аминоэтансул ьфо-кислоты 25 мг/кг, внутрибрюшинно40±1698,4±12,5106,2±12,60,6±0,1Пирацетам 200 мг/кг, внутрибрюшинно50±17*107,8±18,5107,8±18,50,5±0,1Этимизол 1,5 мг/кг, внутрибрюшинно20±1371,6±20,877,8±20,20,8±0,1Контроль (физиологический раствор), внутрибрюшинно10±1052,3±19,052,3±19,00,9±0,1Примечание. * Р<0,05 по отношению к контролю.

Таким образом, исследование способности хлоргидрата N-изопропиламид-2-(1-фенилэтил)аминоэтансульфокислоты повышать устойчивость организма и специально ЦНС к повреждающим внешним воздействиям, таким как электрошок, интоксикация скополамином или коразолом показало, что данное средство является высокоактивным, предотвращающим развитие нарушений памяти у животных.

Следует отметить, что высшие функции мозга (память, мышление, внимание, восприятие) зависят от многих факторов: энергоснабжения, биосинтеза информационных молекул, состояния сосудистой системы ЦНС, обмена липидов, витаминов. Поэтому вещества, способные оптимизировать данные функции и, как следствие, повышать устойчивость ЦНС к повреждающим воздействиям, должны, прежде всего, благотворно влиять на энергетический, пластический и медиаторный обмен в ЦНС.

2. Влияние хлоргидрата N-изопропиламид-2-(1-фенилэтил)аминоэтансульфокислоты на выживаемость крыс при церебральной ишемии мозга, вызванной билатеральной окклюзией общих сонных артерий

Ишемию головного мозга воспроизводили у 40 крыс-самцов массой от 180-200 г посредством полной билатеральной окклюзии общих сонных артерий (БООСА) под эфирным наркозом. Крыс разделили на 4 группы. 1-ой группе животных ежедневно в течение 14 суток после БООСА вводили хлоргидрат N-изопропиламид-2-(1-фенилэтил)аминоэтансульфокислоты в дозе 50 мг/кг внутрибрюшинно. Препараты сравнения вводили внутрибрюшинно: пирацетам - в дозе 100 мг/кг животным II группы, ксантинол-никотинат - в дозе 50 мг/кг животным III группы. Контрольные животные (по аналогичной схеме получали физиологический раствор) составили IV группу. В течение 14 дней оценивали динамику выживаемости и определяли относительную эффективность хлоргидрата N-изопропиламид-2-(1-фенилэтил)аминоэтансульфокислоты, пирацетама и ксантинол-никотината в условиях ишемии. Относительную эффективность этих препаратов определяли по формуле [Иванов Ю.В., Яснецов В.В. // Экспер. и клин. фармакол. - 2000. - Т.63. - №1. - С.41-44]:

где Z - относительная эффективность препарата;

П - доля выживших животных с препаратом;

К - доля выживших животных в контроле.

Результаты исследований показали, что контрольной группе животных БООСА приводила к гибели 50% животных уже на 4 сутки эксперимента (таблица 4), а к концу опыта выживаемость составляла лишь 10%. Результаты исследований проиллюстрированы на рис.1, 2, 3. «Фиг.1 Динамика относительной эффективности хлоргидрата N-изопропиламид-2-(1-фенилэтил)аминоэтансульфокислоты при ишемии мозга у крыс (по выживаемости в днях). Фиг.2 Динамика относительной эффективности ксантинол-никотината при ишемии мозга у крыс (по выживаемости в днях). Фиг.3 Динамика относительной эффективности пирацетама при ишемии мозга у крыс (по выживаемости в днях)».

Таблица 4
Выживаемость крыс (%) с ишемией головного мозга, вызванной билатеральной окклюзией общих сонных артерий (БООСА)Группа животных n=10Сутки после БООСА1234567891011121314Контроль БООСА6060605050504040302010101010Хлоргидрат N-изопропиламид-2-(1-фенил этил)-аминоэтансульфокислоты 50 мг/кг, внутрибрюшинно7070707070706050503030302020Пирацетам 100 мг/кг, внутрибрюшинно6060606050505050404040303030Ксантинол-никотинат 50 мг/кг, внутрибрюшинно7070707070705050404040303030

Иная динамика выживаемости отмечена в группе животных, которым вводили хлоргидрат N-изопропиламид-2-(1-фенилэтил)аминоэтансульфокислоты (50 мг/кг в сутки). С 1 по 6 сутки она составляла 70%, а «медиана выживаемости» приходилась на 8 сутки эксперимента, т.е. 50%-ая гибель животных наступала в 2 раза позднее, чем в контроле. Выживаемость к концу эксперимента составила 20%.

Пирацетам (200 мг/кг в сутки) практически не менял динамику выживаемости в течение первых 6 суток после БООСА по сравнению с контролем. Однако с 7 по 14 сутки выживаемость крыс этой группы была стабильно выше, чем в контроле, а относительная эффективность пирацетама колебалась в разные дни от 0,17 до 0,50 (фиг.3). К 14 дню опыта выжило 30% животных.

Терапия ксантинол-никотинатом (50 мг/кг в сутки) сопровождалась положительной по сравнению с контролем динамикой выживаемости на протяжении всего эксперимента: на 6 сутки она составляла 70%, на 14 сутки - 30%. Относительная эффективность ксантинол-никотинат изменялась в течение опыта в пределах 0,25-0,40 (фиг.2).

Таким образом, влияние хлоргидрата N-изопропиламид-2-(1-фенилэтил)аминоэтансульфокислоты на выживаемость крыс с БООСА характеризовалось, в первую очередь, ее увеличением в течение первой недели ишемии. В этот период его относительная эффективность была сравнима с таковой у ксантинол-никотината и превосходила эффект пирацетама (фиг.1). Положительное влияние хлоргидрата N-изопропиламид-2-(1-фенилэтил)аминоэтансульфокислоты на ишемизированную ткань головного мозга проявлялось в смещении «медианы выживаемости» на 8 сутки, в то время как в контроле она достигалась на 4 сутки, при введении пирацетама - на 5 сутки, а ксантинол-никотината - на 7 сутки.

В базисной терапии ишемических состояний головного мозга большое значение отводится препаратам, обеспечивающим его метаболическую защиту.

Для выяснения влияния хлоргидрата N-изопропиламид-2-(1-фенилэтил)аминоэтансульфокислоты на метаболизм ишемизированного мозга была поставлена отдельная серия экспериментов.

3. Влияние хлоргидрата N-изопропиламид-2-(1-фенилэтил)аминоэтансульфокислоты на некоторые показатели энергетического обмена, СОД, каталазы и перекисного окисления липидов в мозге крыс при ишемии

130 крыс-самцов массой 180-200 г с билатеральной окклюзией общих сонных артерий (БООСА) спустя 1,5 часа, 1 и 3 суток после создания ишемии выводили из опыта декапитацией. Головной мозг извлекали, замораживали в жидком азоте, измельчали, и в гомогенатах, полученных из больших полушарий головного мозга крыс, оценивали ряд биохимических показателей. Определяли содержание молочной кислоты (МК), пировиноградной кислоты (ПВК); гидроперекисей липидов(ГПЛ), малонового диальдегида (МДА), а также активность супероксиддисмутазы (СОД) и каталазы.

Статистическую обработку данных проводили стандартными методами с применением t-критерия Стъюдента с помощью пакета прикладных программ STATGRAPHICS.

Результаты проведенных исследований показали, что ишемия, моделированная БООСА, в течение 1,5 часов вызывала в тканях мозга крыс увеличение содержания молочной кислоты (лактата) на 160% и уменьшение количества пирувата на 42% по сравнению с этими показателями у ложнооперированных животных. Соотношение лактат/пируват, являющееся показателем интенсивности анаэробного превращения углеводов, увеличилось с 9,3 до 41,9 (в 4,7 раза). Эти данные свидетельствуют о подавлении аэробного и усилении «аварийного» гликолитического механизмов образования энергии (таблица 5). В этих же условиях наблюдалось повышение концентрации ГПЛ на 34% и МДА на 35%, по сравнению с показателями у ложнооперированных животных (таблица 6). Одновременно снижалась активность СОД и каталазы (на 26% и 22%), играющих центральную роль в регуляции ПОЛ на стадии инициирования. Последовательное действие этих двух координированных между собой ферментных систем ингибирует образование гидроксильных радикалов, способных активно взаимодействовать с липидами клеточных мембран.

Через 1 и 3 сутки ишемии интенсивность гликолиза падала, что проявлялось в снижении соотношения лактат/пируват до 22,2 и 13,2 соответственно.

Интенсивность ПОЛ в головном мозге нарастала через 1 сутки после ишемии. Так, содержание ГПЛ и МДА составляло 142 и 189% соответственно по сравнению с показателями у ложнооперированных животных. Параллельно ингибировалась активность СОД на 35% и каталазы на 31% (таблица 6).

Таблица 5
Влияние хлоргидрата N-изопропиламид-2-(1-фенилэтил)аминоэтансульфокислоты, пирацетама и ксантинол-никотината на показатели анаэробного гликолиза в мозге крыс при ишемииГруппы животных
n=10Молочная кислота (МК)Пировиноградная кислота (ПК)Лактат/пируватмкМ/г%мкМ/г%Ложнооперированные2,41±0,101000,26±0,021009,31.5 ч ишемии     БООСА6,29±0,092610,15±0,015841,9Хлоргидрат N-изопропил-     амид-2-(1-фенилэтил)амино-2,58±0,181070,21±0,028112,3этансульфокислоты     Пирацетам3,27±0,431360,2+0,027716,3Ксантинол-никотинат5,38±0,192230,18+0,037229,91 сут ишемии     БООСА3,99±0,091660,18±0,016922,2Хлоргидрат N-изопропил-     амид-2-(1-фенилэтил)амино-2,41±0,131000,25±0,02969,6этансульфокислоты     Пирацетам2,34±0,05970,25+0,03969,4Ксантинол-никотинат2,35±0,17920,24+0,02929,83 сут ишемии     БООСА2,37±0,05980,18±0,016913,2Хлоргидрат N-изопропил-     амид-2-(1-фенилэтил)амино-2,43±0,081010,26±0,031009,3этансульфокислоты     Пирацетам2,38+0,05990,26±0,031009,2Ксантинол-никотинат2,19±0,17910,24±0,02929.1

При ишемии длительностью 3 суток активность процессов ПОЛ в мозге снижалась. Аккумуляция ГПЛ и МДА была менее выражена, чем при суточной ишемии: 125 и 140% соответственно. Активность СОД и каталазы была выше, чем при суточной ишемии и составляла 83 и 80%.

Полученные данные свидетельствуют об активации процессов анаэробного гликолиза, интенсификации ПОЛ и снижении активности СОД и каталазы на всех изученных сроках ишемии, причем пик этих изменений приходится на 1 сутки.

Хлоргидрат N-изопропиламид-2-(1-фенилэтил)аминоэтансульфокислоты, использованный для коррекции последствий ишемии мозга, оказывал позитивное действие на энергетический обмен, значительно увеличивал долю аэробного окисления углеводов уже через 1,5 часа после окклюзии сонных артерий. Причем данный эффект на процессы энергообразования у этого средства более выражен, чем у пирацетама или ксантинол-никотината (таблица 5). Так, соотношение лактат/пируват в ишемизированном мозге хлоргидрат N-изопропиламид-2-(1-фенилэтил)аминоэтансульфокислоты снижал с 41,9 до 12,3, пирацетам - до 16,3, ксантинол-никотинат - до 29,9.

Показатель лактат/пируват в ишемизированном мозге крыс под влиянием всех изученных препаратов через 1 и 3 сутки, после окклюзии, достигал исходных значений, что свидетельствовало о восстановлении нарушенного энергетического метаболизма (таблица 5).

Хлоргидрат N-изопропиламид-2-(1-фенилэтил)аминоэтансульфокислоты эффективно подавлял гиперактивацию ПОЛ на протяжении от 1,5 часов до 3 суток. Он снижал, по сравнению с контролем, содержание ГПЛ на 29, 55, 28% и МДА на 34, 126, 37% через 1,5 час, 1 и 3 сутки ишемии, соответственно. Следует отметить, что наибольший терапевтический эффект этого препарата отмечался на 1 сутки ишемии, на который приходился пик гипоксических изменений в контроле. Уровень ГПЛ и МДА на этом сроке был даже ниже, чем у ложнооперированных животных.

Хлоргидрат N-изопропиламид-2-(1-фенилэтил)аминоэтансульфокислоты восстанавливал активность СОД и каталазы на всех 3-х сроках ишемии до величин, достоверно не отличающихся от таковых показателей у ложнооперированных крыс (таблица 6). Это может свидетельствовать о быстром включении препарата в процессы регуляции образования гидроксильных радикалов на стадии инициирования ПОЛ.

Ксантинол-никотинат и пирацетам на всех изученных сроках ишемии по своему влиянию на активность СОД и каталазы не отличались от хлоргидрата N-изопропиламид-2-(1-фенилэтил)аминоэтансульфокислоты.

Однако их корригирующее действие на аккумуляцию продуктов ПОЛ было менее эффективно на сроках 1,5 час и 1 сутки (таблица 6).

Таким образом, хлоргидрат N-изопропиламид-2-(1-фенилэтил)аминоэтан-сульфокислоты способствовал нормализации изученных показателей энергетического обмена, эффективно снижал интенсивность процессов ПОЛ, восстанавливал активность СОД и каталазы после ишемии головного мозга от 1,5 час до 3-х суток. Сравнительная оценка эффектов хлоргидрата N-изопропиламид-2-(1-фенилэтил)аминоэтансульфокислоты, ксантинол-никотината и пирацетама показала, что по нейропротекторному действию хлоргидрат N-изопропиламид-2-(1-фенилэтил)аминоэтансульфокислоты превосходит препараты сравнения на сроках 1,5 часа и сутки ишемии.

4. Влияние хлоргидрата N-изопропиламид-2-(1фенилэтил)аминоэтансульфокислоты на двигательную функцию задних конечностей и выживаемость крыс при компрессионном повреждении спинного мозга

Компрессионное повреждение спинного мозга на уровне Th₁₀-Th₁₁ сопровождается нарушением двигательной функции нижних конечностей, нарушением функции тазовых органов, трофики и проводниковым расстройствам всех видов чувствительности ниже уровня повреждения [Ромоданов А.П., Мосийчук Н.М., Холопченко Э.И. Атлас топической диагностики заболеваний нервной системы. Киев. - 1979].

Известно, что препаратом, использующимся в лечении компрессионного повреждения спинного мозга, чаще всего является церебролизин.

Церебролизин - освобожденный от белка гидролизат мозга свиньи, содержащий аминокислоты (85%) и низкомолекулярные пептиды (15%). Церебролизин увеличивает эффективность аэробного энергетического метаболизма, уменьшает негативное влияние лактатацидоза, стимулирует синтез белка и проявляет нейроспецифическую нейротрофическую активность [Hutter-Paier В., Grygar Е., Fruhwirth M. et al. // J.Neurol. Transm. - 1999. - Vol.53, Suppl. - P.363-372; Windisch M. // Brain Mechanisms and Psychotropic Drugs / Eds. A. Baskys, G. Remington / New York: CRK Press. - 1996. - P.239-257]. Однако препарат требуется вводить длительно в течение 4-х - 12-ти недель, и он вызывает диспептические расстройства, нарушение сна, чувство жара, колебания артериального давления и аллергические реакции.

Компрессионное повреждение спинного мозга воспроизводили на 100 беспородных белых крысах-самцах массой 180-200 г, полученных из питомника "Рапполово". У животных под эфирным наркозом проводили ламинэктомию позвонка на нижнегрудном уровне (Th₁₀-Th₁₁), не повреждая твердую мозговую оболочку. Компрессию этого участка спинного мозга вызывали металлическим стержнем (длина 7 см, диаметр 3 мм), закрепленным в универсальном стереотаксическом приборе. Стержень опускали на глубину 5 мм от уровня твердой мозговой оболочки; продолжительность сдавливания составляла одну минуту.

После нанесения травмы всех животных разделили на 4 группы по 10 животных в группе: ложнооперированные; контрольные (с травмой спинного мозга); животные, получавшие после травмы хлоргидрат N-изопропиламид-2-(1-фенилэтил)аминоэтансульфокислоты (50 мг/кг) или церебролизин (1 мл/кг). Контрольным крысам вводили физиологический раствор. Введение препаратов и плацебо проводили внутрибрюшинно: первый раз через 30 мин после окончания повреждающего воздействия, а в дальнейшем хлоргидрат N-изопропиламид-2-(1-фенилэтил)аминоэтансульфокислоты вводили ежедневно.

Лечебный эффект исследуемых препаратов определяли через 1, 3, 7 и 14 дней с момента нанесения травмы. У животных оценивали степень нарушения двигательной функции нижних конечностей по 4-балльной шкале: 1 балл - норма; 2 балла - умеренный парапарез; 3 балла - выраженный парапарез; 4 балла - параплегия [Суфианова Г.З., Усов Л.А., Суфианов А.А. // Экспер. и клин. фармакол. - 2002. - №5. - с 58-61].

Определяли выживаемость животных и медиану выживаемости - время, до которого доживает 50% крыс. Рассчитывали относительную эффективность препаратов по формуле [Иванова И.А., Бобков Ю.Г. Сравнительное изучение препаратов на разных моделях гипоксии мозга. // Бюл. экспер. биол. - 1984. - №11. - С.567-570]:

Z=П-К/1-К, где Z - относительная эффективность препарата, П - доля выживших животных с препаратом, К - доля выживших животных в контроле.

У крыс с компрессионным повреждением спинного мозга отмечалась параплегия задних конечностей. Оценка этого неврологического расстройства выражалась в 4 баллах.

На фиг.4 представлено: «Влияние хлоргидрата N-изопропиламид-2-(1-фенилэтил)аминоэтансульфокислоты и церебролизина на двигательную функцию задних конечностей крыс с компрессионным повреждением спинного мозга 1) - компрессионное повреждение спинного мозга (без лечения); 2) - введение хлоргидрата N-изопропиламид-2-(1-фенилэтил)аминоэтансульфокислоты; 3) - введение церебролизина»

Церебролизин способствовал восстановлению нарушенной двигательной активности задних конечностей животных с травмированным спинным мозгом. Так, оценка нарушений двигательной активности достоверно снижалась с 4 до 2,93±0,19 (Р<0,001); 2,80±0,26 (Р<0,001); 2,14±0,36 (Р<0,001) и 1,75±0,24 (Р<0,001) баллов на 1, 3, 7 и 14 сутки травмы соответственно (фиг.4).

Терапия заявляемым препаратом - хлоргидратом N-изопропиламид-2-(1-фенилэтил)аминоэтансульфокислоты - также сопровождалась значительным, по сравнению с контролем, улучшением динамики восстановления двигательной функции задних конечностей крыс. Оценка данного неврологического нарушения была значимо меньше на всех сроках наблюдения: 3,20±0,18 (Р<0,001); 2,87±0,25 (Р<0,001); 2,04±0,36 (Р<0,001); 1,40±0,22 (Р<0,001) баллов.

У всех животных с компрессионной травмой спинного мозга отмечались выраженные нарушения функции органов малого таза, что внешне проявлялось в их неопрятности.

Последствия компрессионного повреждения спинного мозга приводили к гибели крыс. Изучение выживаемости животных с травмированным спинным мозгом показало, что в течение первой недели наблюдения она колебалась в пределах 94-42%. В течение 7-8 суток в живых оставалось 16-11% крыс, а к 9 суткам все животные погибали.

На фиг.5 представлено: «Влияние хлоргидрата N-изопропиламид-2-(1-фенилэтил)аминоэтансульфокислоты и церебролизина на выживаемость крыс с компрессионным повреждением спинного мозга.

1) - компрессионное повреждение спинного мозга (без лечения); 2) - введение хлоргидрата N-изопропиламид-2-(1-фенилэтил)аминоэтансульфокислоты; 3) - введение церебролизина»

Церебролизин значительно улучшал динамику выживаемости крыс на всех сроках спинномозговой травмы. Так в течение первых 7 суток выживаемость варьировала в пределах 100-59%, а с 8 по 14 сутки - в пределах 53-41%.

Терапия хлоргидратом N-изопропиламид-2-(1-фенилэтил)аминоэтансульфокислоты сопровождалась более выраженной, по сравнению с церебролизином, динамикой увеличения выживаемости животных. Так в течение первых 7 суток она колебалась в пределах 100-71%, а с 8 по 14 сутки - в пределах 71-53%.

О более позитивном влиянии хлоргидрата N-изопропиламид-2-(1-фенилэтил)аминоэтансульфокислоты на выживаемость крыс при компрессионной травме спинного мозга свидетельствуют и данные по определению медианы выживаемости (фиг.5). Так, если в контрольной группе 50% животных доживало до 5,5 суток, то в группе крыс, получавших церебролизин - до 9,5 суток, получавших хлоргидрат N-изопропиламид-2-(1-фенилэтил)аминоэтансульфокислоты - более 14 суток.

Относительная эффективность обоих препаратов была одинакова на протяжении первых двух суток травмы спинного мозга.

На фиг.6 представлена: «Относительная эффективность хлоргидрат N-изопропиламид-2-(1-фенилэтил)аминоэтансульфокислоты и церебролизина

1 - введение хлоргидрата N-изопропиламид-2-(1-фенилэтил)аминоэтансульфокислоты

2 - введение церебролизина»

В течение последующих 12 суток хлоргидрат N-изопропиламид-2-(1-фенилэтил)аминоэтансульфокислоты по своей относительной эффективности превосходил церебролизин в 1,2-11,5 раз.

5. Влияние хлоргидрата N-изопропиламид-2-(1-фенилэтил)аминоэтансульфокислоты на некоторые показатели метаболизма в ликворе крыс с компрессионным повреждением спинного мозга

100 крыс-самцов массой 180-200 г с компрессионным повреждением спинного мозга выводили из опыта декапитацией спустя 1, 3, 7 и 14 суток после создания ишемии. В ликворе животных с компрессионным повреждением спинного мозга после специальной обработки их реактивами определяли содержание молочной кислоты (МК), пировиноградной кислоты (ПВК), малонового диальдегида (МДА), восстановленного глутатиона (ВГ), а также активность супероксиддисмутазы (СОД) и каталазы. В одну пробу брали ликвор от трех крыс.

Статистическую обработку данных проводили стандартными методами с применением t-критерия Стъюдента с помощью пакета прикладных программ STATGRAPHICS.

Результаты биохимического исследования (таблица 7) показали, что компрессионное повреждение спинного мозга приводило к резко выраженному нарушению энергетического метаболизма. Так, к первым суткам после нанесения травмы в ликворе крыс регистрировали увеличение концентрации лактата до 333% и снижение пирувата до 31% от их уровня у ложнооперированных животных. Соотношение лактат/пируват, являющееся показателем интенсивности гликолитического или аэробного механизмов образования энергии, возрастало с 9 до 95,5 (в 10,6 раз). Представленные данные говорят о значительном подавлении процессов аэробного превращения субстратов и мощном усилении анаэробного гликолитического.

В последующие сроки травмы спинного мозга (3, 7 сутки) интенсивность процессов гликолиза снижалась, о чем свидетельствует уменьшение величины соотношения лактат/пируват до 51,2 и 29,8 соответственно (к 9 суткам все животные погибали). Эти данные констатируют увеличение доли аэробного пути синтеза макроэргических соединений на фоне еще очень высокой активности гликолитических процессов.

У крыс с компрессионной травмой спинного мозга наблюдалось повышение интенсивности перекисного окисления липидов (ПОЛ) и угнетение активности ферментов системы глютатиона. Так на 1 сутки наблюдения в ликворе увеличивалась концентрация малонового диальдегида (МДА) на 78%, снижалась активность супероксиддисмутазы (СОД) на 61% и содержание восстановленного глутатиона (ВГ), отражающего активность ферментативной системы глутатионпероксидаза-глутатин-S-трансфераза, на 64%. На более поздних сроках травмы спинного мозга (3-7 сутки) содержание МДА постепенно снижалось, но не достигало исходного уровня. Активность изученных ферментов в эти сроки повышалась, но была значимо ниже по сравнению с активностью этой системы у ложнооперированных животных.

Церебролизин оказывал позитивное действие на энергетический обмен травмированного спинного мозга. Он способствовал более быстрому, по сравнению с контролем, снижению интенсивности гликолиза и усилению процессов аэробного окисления субстратов с 1 по 14 сутки травмы. Однако интенсивность гликолитических процессов оставалась еще высокой и не достигала исходного уровня к 14 суткам наблюдения (соотношение лактат/пируват - 82; 35,4; 22,4 и 16,1 против 9 у ложнооперированных крыс).

Хлоргидрат N-изопропиламид-2-(1-фенилэтил)аминоэтансульфокислоты по своему влиянию на энергетический обмен в травмированном спинном мозге оказался эффективнее церебролизина. Так значения соотношений лактат/пируват у животных, получавших хлоргидрат N-изопропиламид-2-(1-фенилэтил)аминоэтансульфокислоты, были значительно ниже этих значений у крыс, получавших церебролизин - 34,5; 22,5; 14,6 и 10. Концентрация лактата и пиру вата в ликворе к 14 суткам наблюдения достоверно не отличалась от таковой у ложнооперированных животных.

Оба препарата снижали интенсивность ПОЛ и реактивировали ферменты системы глютатиона. Однако хлоргидрат N-изопропиламид-2-(1-фенилэтил)аминоэтансульфокислоты снижал концентрацию МДА и восстанавливал активность СОД до исходного уровня к 7 суткам, а церебролизин - к 14 суткам наблюдения. Хлоргидрат N-изопропиламид-2-(1-фенилэтил)аминоэтансульфокислоты эффективнее церебролизина реактивировал ферменты системы глютатиона с 1 по 7 сутки травмы, однако к 14 суткам их эффекты сравнивались.

Таким образом, результаты проведенного исследования показали, что хлоргидрат N-изопропиламид-2-(1-фенилэтил)аминоэтансульфокислоты и церебролизин, использованные для коррекции последствий компрессионной травмы спинного мозга, проявляли выраженные нейропротекторные свойства. Они стимулировали процессы энергообразования, снижали интенсивность свободнорадикального окисления и восстанавливали активность СОД и систему глутатиона. Благодаря этим свойствам препараты способствовали восстановлению нарушенной двигательной функции задних конечностей и значительному снижению летальности экспериментальных животных.

Необходимо отметить, что хлоргидрат N-изопропиламид-2-(1-фенилэтил)аминоэтансульфокислоты оказывал более выраженное, по сравнению с церебролизином, нейропротекторное действие, снижая летальность крыс с компрессионной травмой спинного мозга. По своему влиянию на восстановление двигательной функции задних конечностей эффект хлоргидрат N-изопропиламид-2-(1-фенилэтил)аминоэтансульфокислоты сопоставим с эффектом церебролизина.

Изобретение относится к медицине и фармакологии и касается нейропротекторного средства для лечения поражений головного и спинного мозга различной этиологии, представляющего собой N-изопропиламид-2-(1-фенилэтил)аминоэтансульфокислоты. Средство не обладает токсическим эффектом. 6 ил., 7 табл.

Нейропротекторное средство, применяемое при поражении головного и спинного мозга различной этиологии, представляющее собой хлоргидрат N-изопропиламид-2-(1-фенилэтил)аминоэтансульфокислоты.