СРЕДСТВО ДЛЯ ЗАЖИВЛЕНИЯ КОЖНЫХ РАН ПЕРВИЧНЫМ НАТЯЖЕНИЕМ Российский патент 2006 года по МПК A61K31/18 A61P17/02 

Изобретение относится к биологически активным средствам, а именно к фармакологии, к новым лекарственным препаратам, ускоряющим процессы клеточной регенерации, заживления ран. Данное лекарственное средство может быть использовано в качестве репаративного при местных поражениях кожи как с лечебной целью в хирургии, дерматологии, офтальмалогии, так и с профилактической целью в косметологии.

Поиск и изучение новых лекарственных средств, стимулирующих процессы репарации, представляет важную задачу современной фармакологии. Несмотря на то, что имеется много биологически активных препаратов, стимулирующих метаболические процессы и относящихся к различным фармакологическим группам (протеолитические ферменты, синтетические анаболические гормоны, тканевые и белковые препараты, антисептические средства, мед и его продукты, фитопрепараты, различные масла, адсорбенты) [Машковский М.Д. / Лекарственные средства. - 1998. - Т.2. - С.168-192], сохраняется потребность в новых эффективных медикаментозных средствах, регулирующих процессы регенерации.

Согласно требованиям, предъявляемым Государственном Фармкомитетом Минздава РФ к созданию новых лекарственных средств, активность их оценивается по методам, представленным в методических указаниях для каждого класса лекарственных препаратов [Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. - М.: Минздрав РФ ЗАО «ИИА «Ремедиум», 2000, 398 С.]. На основании этого к лекарственным средствам, стимулирующим регенераторные процессы, относятся вещества, которые проявляют репаративную активность на моделях кожных ран, т.к. только в этих тканях наиболее наглядно прослеживается динамика и механизм регенераторных процессов.

Заживление ран - сложный, протекающий на различных уровнях процесс, конечной целью которого является ликвидация повреждения с максимальным восстановлением анатомической структуры при условии минимальных функциональных потерь. В исходе процесса заживления ран происходит восстановление внеклеточного матрикса (с формированием или без формирования рубца) и эпителиального покрова.

Для заживления ран (порезов, ожогов, обморожений, пролежней и т.п.) в настоящее время в клинике используют отечественный препарат метилурацил в виде 5% мази. При использовании метилурацила могут возникать аллергические кожные реакции. Препарат противопоказан при злокачественных заболеваниях костного мозга [Машковский М.Д, 1993, 161-162].

Препарат «Солкосерил» (Швейцария) применяют в виде раствора, мази, желе в качестве репаративного средства [Регистр лекарственных средств в России РЛС-ДОКТОР. Ежегодный сборник. Вып.5. - 2002. - С.747-748]. Препарат "Солкосерил" содержит депротеинизированный гемодиализат из крови телят. Из-за возникшей опасности заражения вирусами через кровь выпуск препарата «Солкосерил» ограничен. Изучение действия «Солкосерила» в опытах показало, что заживление ран часто осуществляется вторичным натяжением.

Известно, что в лабораторных условиях изучали комплекс таурин-хитозановый гель [Degim Z., Celebi N., Sayan H., Babul A., Erdogan D., Take G., An investigation on skin wound healing in mice with a taurine-chitosan gel formulation, Amino Acids. 2002, 22(2), 187-18]. В процессе исследования авторы проводили сравнение репаративной активности комплекса с активностью хитозана на кожных ранах у мышей. Хотя таурин-хитозановый гель обладает в приведенных концентрациях высокой активностью, говорить о роли именно таурина как репаранта в нем не представляется возможным. Срок наблюдений - 7 дней не позволяет судить о полном заживлении ран, динамике и механизме регенераторных процессов.

Целью данного изобретения является расширение арсенала средств для восстановления кожного покрова при различных повреждениях, средств местного действия путем использования для этой цели российского препарата. Задача решена с помощью хлоргидрата N-изопропиламид-2-(1-фенилэтил)-аминоэтансульфокислоты, являющегося производным 2-аминоэтансульфоновой кислоты и ранее описанного в качестве средства, проявляющего противоязвенное действие [Сапронов Н.С., Гавровская Л.К., Селина Е.Н. Средство для лечения язвенной болезни желудка и 12-перстной кишки, патент РФ №2179439], и испытанного авторами в качестве средства для регенерации кожного покрова, не обладает токсическим, аллергизирующим действием.

Средство, заявленное в данном изобретении, может применяться как для лечения хирургических, трофических и других ран, в дерматологии, офтальмологии, так и с профилактической целью в косметологии.

Применение хлоргидрата N-изопропиламид-2-(1-фенилэтил)аминоэтансульфокислоты местно, на раны, неожиданно дало хороший результат. Кожная рана заживает первичным натяжением с плоскоклеточной дифференцировкой эпителия без признаков его патологической регенерации и без рубцевания соединительной ткани. Средство наносили на кожу в виде субстанции (порошка), мази, водного раствора. Полнослойные раны, на которых изучали процесс заживления и регенерации тканей под действием хлоргидрата N-изопропиламид-2-(1-фенилэтил)аминоэтансульфокислоты связаны с нарушением структуры всех трех слоев кожи: эпидермиса, дермы и подкожной жировой клетчатки (гиподермы). Репаративные и регенерационные процессы ткани здесь затрагивают все три слоя. Процесс заживления протекает за счет первичного натяжения, когда наблюдается раннее и полное очищение раны, синхронно текущие и завершающиеся к 20 суткам регенераторные процессы в системе эпителий - соединительная ткань протекают без существенного качественного нарушения регенераторного процесса с пролиферацией и дифференцировкой регенерирующих тканей.

Кожа покрывает поверхность тела и является одним из наиболее крупных органов - ее масса составляет около 16% массы тела, а площадь поверхности - 1.2-2.3 м². Кожа состоит из трех слоев: эпидермиса, дермы и подкожной жировой клетчатки (гиподермы) [Быков В.Л. Частная гистология человека (краткий обзорный курс). СПб.: СОТИС. 1997, с.56-62].

Наружный слой кожи - эпидермис представлен плоским ороговевающим эпителием, который вдается в подлежащую дерму в виде эпидермальных гребешков, чередующихся с ее сосочками. Это увеличивает механическую прочность связи эпидермиса с дермой и площадь поверхности взаимного обмена между ними. Эпидермис состоит из пяти слоев: базального, имеющего физиологическое рН от 7.0 до 7.4, шиповатого, зернистого (рН-6.7-6.9), блестящего и рогового (рН-5.0-6.0). Эпителиальные клетки эпидермиса (кератиноциты) непрерывно образуются в базальном слое и смещаются в вышележащие слои, подвергаясь дифференцировке и, в конечном итоге, превращаясь в роговые чешуйки, слущивающиеся с поверхности кожи (рН-3.0-5.0).

Дерма (собственно кожа) - соединительнотканная часть кожи толщиной 0.5-5 мм (рН-7.4-7.6) - располагается под эпидермисом, обеспечивает его питание, придает коже прочность и содержит кожные железы (потовые и сальные), а также волосы и ногти. Она включает в себя два слоя: 1. сосочковый, который обеспечивает связь дермы с базальной мембраной эпидермиса с помощью ретикулярных, эластических волокон и особых якорных фибрилл. 2. сетчатый - более глубокий, содержит трехмерную сеть толстых пучков коллагеновых волокон, взаимодействующую с сетью эластических волокон [Быков В.Л. Частная гистология человека. СПб.: СОТИС, 1997, С.56-629; Муравьев И.А., Кононихина Н.Ф. Влияние рН структурных элементов кожного барьера на высвобождение кислоты салициловой и натрия салицилата из мазей. // Фармация, 1989, №2, С.64-65].

Подкожная клетчатка (гиподерма) играет роль теплоизолятора, депо питательных веществ, витаминов и гормонов, обеспечивает подвижность кожи. Образована дольками жировой ткани с прослойками рыхлой волокнистой; ее толщина связана с состоянием питания и участком тела, а общий характер распределения в организме обусловлен влиянием половых гормонов.

Таким образом, кожа - из-за ее неоднородной структуры - требует препаратов, которые бы затрагивали и влияли на все ее слои в процессе регенерации, причем большую роль играет площадь поврежденной кожи. Препараты не должны быть токсичными, аллергичными. LD₅₀ хлоргидрата N-изопропиламид-2-(1-фенилэтил)аминоэтансульфокислоты 375 мг/кг при внутрибрюшинном введении белым мышам. Он не обладает иммунотоксичностью и аллергенностью. В связи с этим хлоргидрат N-изопропиламид-2-(1-фенилэтил)аминоэтансульфокислоты наносили однократно 8 мг субстанции на см² или 240 мг мази (из расчета 80 мг 10% мази на см² раневой поверхности) и далее ежедневно в течение 20 дней до полного заживления.

Для изучения ранозаживляющего действия на модели полнослойной кожной раны проверяли 5% мазь хлоргидрата N-изопропиламид-2-(1-фенилэтил)аминоэтансульфокислоты. В качестве препарата сравнения использовали «Солкосерил» (производство Швейцарии, фирма «Солко»). Лечебный эффект от применения хлоргидрата N-изопропиламид-2-(1-фенилэтил)аминоэтансульфокислоты наблюдали при нанесении его на рану в виде порошка, присыпки, водных растворов и мазей с концентрацией действующего начала от 5 до 95%. Во всех случаях раны заживали быстро без инфицирования и образования рубцов.

На модели раны контролировали процесс заживления через 5, 10, 15, 20, 25 суток, анализируя состояния раны. Средний срок полного заживления раны с применением хлоргидрата N-изопропиламид-2-(1-фенилэтил)аминоэтансульфокислоты составляет 20.0±0.6 суток, в то время как для «Солкосерила» - 25.8±2.0 суток.

Методика проведения эксперимента:

1. Создание модели полнослойной кожной раны.

2. Испытание хлоргидрата N-изопропиламид-2-(1-фенилэтил)аминоэтансульфо-кислоты на способность заживлять кожные раны.

Модель полнослойных кожных ран. Эксперимент проводили на крысах в зимнее время - январь-февраль, моделируя асептические полнослойные кожные раны [Западнюк И.П., Западнюк В.И., Захария Е.А, Западнюк Б.В. // Лабораторные животные. - Киев. Вища школа, 1983, С. 248-250, 254-255].

Под легким эфирным наркозом у экспериментальных животных ножницами с предварительно выстриженного участка спины вырезали округлый лоскут кожи площадью 3.0 см² (300 мм²). Место нанесения поражения выбирали с таким расчетом, чтобы животное не имело возможности облизывать рану. Животных содержали в отдельных клетках на обычном рационе и свободном доступе к воде. Опыты выполнены на 125 крысах массой 200-250 г по 25 животных в группе.

1 группа - контрольная (самозаживление);

2 группа - контрольная (Плацебо - вазелин-ланолиновая основа 1:1);

3 группа - опытная (5% мазь хлоргидрата N-изопропиламид-2-(1-фенилэтил)аминоэтансульфокислоты на вазелин-ланолиновой основе);

4 группа - сравнения («Солкосерил» гель)

Лечение осуществляли через сутки после образования раны, путем нанесения 200 мг мази один раз в сутки из расчета 160 мг мази на см² раневой поверхности (8мг субстанции на см²) и далее ежедневно до полного заживления.

Течение раневого процесса оценивали по следующим критериям: размеры и сроки заживления ран; прирост массы тела животных; макро- и микроскопическая оценка ран.

Статистическую обработку материала производили стандартными методами с применением t-критерия Стьюдента на компьютере по программам, разработанным в отдела нейрофармакологии НИИЭМ РАМН. На протяжении эксперимента у животных всех групп в определенные сроки (5, 10, 15, 20, 25 суток от момента создания ран) измеряли площадь ран. На рану накладывали предметное стерильное стекло и маркером обрисовывали ее контур. Изображения ран сканировали, площадь вычисляли с помощью специально разработанной в отделе компьютерной программы.

Результаты повторных измерений площади раны характеризуют динамику регенераторных процессов не только эпителия, покрывающего рану, но и подлежащей грануляционной ткани. Средние величины площадей в контрольных и опытных группах сравнивали при погрешности Р<0.05. Сравнительный анализ динамики площади заживления ран показал, что в контрольный срок (20 суток) у животных, которых лечили 5% мазью хлоргидрата N-изопропиламид-2-(1-фенилэтил)аминоэтансульфокислоты, площадь раневой поверхности составила 0.9%. В группах сравнения это величина равнялась для Солкосерила - 4.0%, Плацебо - 7.5%.

Результаты представлены в таблицах 1 и 2. Более выраженный ранозаживляющий эффект наблюдается при применении мази хлоргидрата N-изопропиламид-2-(1-фенилэтил)аминоэтансульфокислоты.

Таблица 1
Динамика заживления ранПлощадь ран в %№ п/пГруппы животныхДо лечения5 сутки10 сутки15 сутки20 сутки25 сутки1.Контроль100.094.838.916.88.52.82.Плацебо¹100.0117.731.015.07.51.53.Препарат² (5% мазь)100.0108.728.910.30.904.Солкосерил100.089.222.610.44.00.5¹ - мазевая основа - вазелин-ланолиновая 1:1
² - хлоргидрат N-изопропиламид-2-(1-фенилэтил)аминоэтансульфокислоты

Так, начиная с 15 суток в группе животных, получавших 5% мазь с хлоргидратом N-изопропиламид-2-(1-фенилэтил)аминоэтансульфокислоты, наблюдается уменьшение площади ран по сравнению с другими группами. Наиболее наглядная картина прослеживается к 20 суткам: площадь поражения в группе с применением хлоргидрата N-изопропиламид-2-(1-фенилэтил)аминоэтансульфокислоты составила 0.9%, тогда как в контрольной группе - 8.5%, в группе плацебо - 7.5%, в группе с Солкосерилом - 4.0% (таблица 1). Срок полного заживления в группе с испытуемым препаратом зарегистрирован на 22 сутки, тогда как в других группах этот показатель колебался от 27 - Солкосерил до 35 дней - контроль (таблица 2).

Таблица 2
Сроки заживления ран№ п/пГруппы животныхСроки эпителизации (сутки)1.Контроль (самозаживление)33.8±1.62.Плацебо¹30.9±1.33.Препарат² (5% мазь)20.0±0.6*4.Солкосерил26.5±1.0* - различия достоверны по сравнению с контролем (самозаживление), Р<0.05
¹ - мазевая основа-вазелин-ланолиновая 1:1
² - хлоргидрат N-изопропиламид-2-(1-фенилэтил)аминоэтансульфокислоты

Изменение массы тела. Определение массы тела проводили 1 раз в неделю до кормления животных. Результаты измерений представлены в таблице 3.

Ежедневные наблюдения показали, что статистически значимый прирост массы отмечен у животных всех групп к 15 дню эксперимента. Статистически значимых различий между группами не наблюдали.

Морфологическая оценка этапов заживления кожных ран.

Важным показателем заживления раны является результат цитоморфологического исследования состояния грануляции и эпителизации поверхности раны [Николаев А.Б., Шахтмейстер Л.Я., Шахтер А.Б / Экспериментально-клинические аспекты репаративных процессов и методы их стимулирования. - М., 1 ММИ им. Сеченова, 1977, с.161-167]. Биоматериалы брали у экспериментальных животных на 5, 10, 15, 20 сутки исследования, что ориентировочно соответствует трем фазам заживления ран: 5-й день - заканчивается первая фаза травматического воспаления, 10-й день - фаза развития грануляционной ткани, 15-20-й день - формирование рубца и его эпителизация.

Полученные нами результаты показали, что хлоргидрат N-изопропиламид-2-(1-фенилэтил)аминоэтансульфокислоты оказывает ранозаживляющее

Таблица 3
Динамика массы тела крыс при лечении полнослойных кожных ран№ п/пГруппа животныхДо лечения5 сутки10 сутки15 сутки20 суткиг%г%г%г%г%1.Контроль (без лечения)272±12.6100279±10.5102.6279±8.4102.6294±11.6108.1301±12.6110.72.Плацебо¹229±13.7100240±16.8104.8245±12.6107.0252.5±12.6110.3258±12.6112.43.Препарат² (мазь 10%)226±8.4100236±8.4104.4246±1.1108.8253.3±2.1112.1268±4.2118.64.Солкосерил235±6.3100250±6.3106.4264±8.4112.3272±10.5115.7279±8.4118.75.Спасатель (бальзам)230±8.4100244±10.5106.1250±10.5108.7255±12.6110.9258±12.6112.2¹ - мазевая основа-вазелин
² - хлоргидрат N-изопропиламид-2-(1-фенилэтил)аминоэтансульфокислоты

действие, причем наиболее выраженный эффект наблюдается при применении мази. Сравнительная оценка заживления полнослойной раны проводилась по комплексу морфологических показателей, характеризующих регенераторный процесс:

- сроки и особенности очищения раны, вторичное инфицирование асептической раны;

- сроки, степень выраженности, направление и уровень дифференцировки регенерации эпителия в дне раны;

- сроки развития, топография, распространение соединительнотканного регенерата,

- наличие и выраженность воспалительной реакции в нем;

- наличие или отсутствие синхронности регенераторных процессов в системе эпителий - соединительная ткань;

- наличие или отсутствие морфологических проявлений патологической регенерации эпителия и соединительной ткани (акантоз, псевдоэпителиоматозная гиперплазия, роговые кисты, рубцевание);

- корреляция между этими процессами и способом заживления ран (первичное, вторичное натяжение) [Николаев А.Б., Шахтмейстер Л.Я., Шахтер А.Б / Экспериментально-клинические аспекты репаративных процессов и методы их стимулирования. - М., 1 ММИ им. Сеченова, 1977, с.161-167].

При изучении кожных ран у 100% животных каждой группы все перечисленные показатели характеризовались некоторой вариабельностью в пределах одной группы. Однако эти различия подчеркивали определенные тенденции заживления для каждой группы, что определяет групповые различия при сходстве течения раневого процесса.

Испытание контрольной группы. Характерно развитие грануляционной ткани в дне раны до ее частичного или полного очищения от струпа (5 сутки) с последующим созреванием и сочетанием дифференцировки соединительной ткани с воспалительной инфильтрацией. Процесс очищения раны и созревания соединительной ткани продолжается и на 20 сутки; эпителизация, начальная, обнаруживается в краях раны на 10 сутки, в поздние сроки (15-20 сутки) завершенная эпителизация имеется лишь у 40% животных, дифференцировка эпителиального регенерата неравномерная, незавершенная. Замедленное отторжение струпа сочетается с воспалением и нарушением кровообращения в дне.

Испытание плацебо. Характерно большое сходство с контролем при наличии нескольких различий: 1. Более раннее созревание соединительнотканного регенерата. 2. Отсутствие синхронности роста и дифференцировки соединительной ткани и эпителия. 3. Нарушение качества дифференцировки эпителия при выраженной эпителизации. 4. Тенденция к рубцеванию - у части животных эпителизация незавершенная при значительной протяженности и выраженном созревании соединительной ткани.

Испытание 5% мази хлоргидрата N-изопропиламид-2-(1-фенилэтил)аминоэтан сульфокислоты. Наблюдается раннее начало эпителизации уже на 5 сутки, в отдельных случаях ее начало возникает при наличии струпа, под ним. Характерно синхронное развитие эпителиального и соединительнотканного регенератов с их дифференцировкой у большей части животных тенденция к полному заживлению уже на 10-15 сутки.

Испытание геля Солкосерила. При типовом сходстве процесса заживления с применением 5% мази хлоргидрата N-изопропиламид-2-(1-фенилэтил)аминоэтан-сульфокислоты по срокам заживления и регенерации имеются различия, касающиеся степени выраженности и количества животных с оптимальным течением процесса. Регенерация соединительной ткани в дне и ее созревание опережает эпителиальную регенерацию, созревание соединительной ткани у части животных сочетается с воспалительной инфильтрацией, очагами некроза, мелкими участками гнойного расплавления, что нарушает течение и качество эпителизации и создает предпосылки для рубцевания.

В результате испытаний заявляемого средства установлено:

1. Во всех группах исследования установлены типовые процессы заживления полнослойных ран и к 20 суткам наблюдается очищение ран от струпа, склероз в дне, эпителизация полная или неполная. Однако имеются существенные различия, при общем сходстве, между группой с применением 5% мази хлоргидрата N-изопропиламид-2-(1-фенилэтил)аминоэтансульфокислоты, контрольной группой и группой с применением Солкосерила.

2. Различия в группах касаются:

- сроков и характера очищения ран от струпа;

- сроков и качества развития соединительнотканного и эпителиального регенератов, уровня их дифференцировки;

- степени выраженности воспалительного процесса, расстройств кровообращения при текущей регенерации.

3. По перечисленным показателям наиболее оптимально процесс заживления протекает при использовании 5% мази хлоргидрата N-изопропиламид-2-(1-фенилэтил)аминоэтан сульфокислоты. При использовании этой мази ранняя эпителизация сочетается с разрастанием грануляционной ткани и синхронностью протяженности, созревания регенератов и очищения раны с ранним стиханием воспалительных изменений и расстройства кровообращения.

Применение 5% мази хлоргидрата N-изопропиламид-2-(1-фенилэтил)аминоэтансульфокислоты на волонтерах

ПРИМЕР 1. Больной А. 38 лет (резанная рана 5 см).

Поверхность раны обработана 5% мазью хлоргидрата N-изопропиламид-2-(1-фенилэтил)аминоэтансульфокислоты через 12 часов после образования раны. Нанесен 1 г мази под повязку. Процедуру повторяли ежедневно в течение 5 дней. Рана затянулась. Контрольный осмотр через 17 дней показал отсутствие рубцовой ткани и полное восстановление кожного покрова.

ПРИМЕР 2. Больной Б. 78 лет (пролежни на бедре 1.0×2.0 см). На поверхность раны нанесен мелкодисперстный порошок хлоргидрата N-изопропиламид-2-(1-фенилэтил)аминоэтансульфокислоты в количестве 0.5 г под повязку. Процедуру повторяли ежедневно в течение 5 дней. Рана затянулась. Контрольный осмотр через 16 дней показал отсутствие рубцевой ткани и полное восстановление кожного покрова.

ПРИМЕР 3. Больная В. 15 лет (термический ожог левой кисти 2-й степени 2.0×1.5 см). На поверхность раны наложили стерильную салфетку, смоченную 5% стерильным водным раствором хлоргидрата N-изопропиламид-2-(1-фенилэтил)аминоэтансульфокислоты в количестве 10 мл под повязку через 10 минут после ожога. Процедуру повторяли в течение 24 часов 6 раз, поддерживая таким образом повязку влажной. Через 1 час боль на месте ожога прекратилась. На следующий день при перевязке обнаружено, что гиперемия на месте ожога значительно уменьшилась. Контрольный осмотр через 16 дней показал полное восстановление кожного покрова без рубцов.

ПРИМЕР 4. Больной Г. 9 лет (ссадина на голени 3.0×0.5 см). На поверхность раны нанесена присыпка мелкодисперстного порошока хлоргидрат N-изопропиламид-2-(1-фенилэтил)аминоэтансульфокислоты с тальком (в равных пропорциях) в количестве 0.5 г под повязку. Процедуру повторяли ежедневно в течение 5 дней. Рана затянулась. Контрольный осмотр через 12 дней показал полное восстановление кожи.

Изобретение относится к фармакологии, к биологически активным препаратам, применяемым в медицине, в косметических средствах. Изобретение касается расширения арсенала средств, ускоряющих процессы клеточной регенерации, заживления ран; средств, стимулирующих клеточные и гуморальные факторы защиты путем использования для этой цели химически синтезированного соединения, а именно хлоргидрата N-изопропиламид-2-(1-фенилэтил)аминоэтансульфокислоты, т.е. производного таурина. Данное средство может быть использовано с лечебной целью в качестве репаративного при местных поражениях кожи в хирургии и дерматологии. Проведенные доклинические испытания препарата позволяют рекомендовать его в качестве средства для заживления кожных ран первичным натяжением при заболеваниях и поражениях кожи, послеоперационных осложнениях, трофических нарушениях, последствиях воздействия термических и химических факторов. 3 табл.

Средство для заживления ран первичным натяжением, отличающееся тем, что представляет собой хлоргидрат N-изопропиламид-2-(1-фенилэтил)аминоэтансульфокислоты.