МАТЕРИАЛ ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ ДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ Российский патент 2006 года по МПК C12N15/10 

Изобретение относится к медицине, биологии и сельскому хозяйству, а именно к выделению дезоксирибонуклеиновой кислоты (далее - ДНК) из архивных препаратов для обнаружения возбудителей гонореи, трихомониаза и кандидоза методом полимеразной цепной реакции (далее - ПЦР).

Уровень техники.

В литературе описаны устройства, предназначенные для обнаружения возбудителей гонореи, трихомониаза и кандидоза. К таким устройствам относятся препараты, приготовленные нанесением исследуемого материала на 2 предметных стекла с последующей окраской одного метиленовой синькой для светового микроскопирования, второй препарат запасной. Лабораторные диагностические исследования. С.М. Плотичер, Киев, 1962, с.13-18. В них в качестве исследуемого материала используют выделения и соскобы из цервикального канала, уретры и влагалища. Справочник Медицинская лабораторная диагностика (программы и алгоритмы) под редакцией А.И.Карпищенко, Санкт-Петербург "Интермедика", 2001, с.114-124.

Сущность изобретения.

Задачей изобретения является увеличение времени хранения исследуемого материала для обнаружения возбудителей гонореи, трихомониаза и кандидоза методом ПЦР. Эта задача достигается применением архивных препаратов в качестве исследуемого материала для обнаружения возбудителей гонореи, трихомониаза и кандидоза методом ПЦР. Исследуемый материал готовят так: берут 2 препарата, один окрашенный метиленовой синькой, другой неокрашенный, оставленные в архиве лаборатории лечебно-профилактического учреждения (далее - ЛПУ), наносят на мазки по 0,2 мл физиологического раствора и оставляют на 10 минут для получения суспензии исследуемого материала, затем осторожно перемешивают стеклянной палочкой суспензию до полного растворения мазков. Полученную суспензию отсасывают пипеткой и помещают ее в микрообъемы с крышкой (пробирки типа Эппендорф). Исследуемый материал готов. Таким образом готовят 2 материала на исследование из 2-х препаратов (один окрашенный, другой неокрашенный) от одного больного.

Получение исследуемого материала из архивных препаратов для обнаружения возбудителей гонореи, трихомониаза и кандидоза методом ПЦР увеличивает время его хранения, т.к. ДНК этих возбудителей в препаратах сохраняются долго, год и более.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения.

При выявлении у больных возбудителей гонореи и трихомониаза препараты их оставляют в архиве ЛПУ согласно приказу Министерства здравоохранения СССР от 4 декабря 1986 г. №1570. Приложение 1, с.1-10 "Об улучшении выявления больных гонореей и трихомониазом в акушерских и гинекологических отделениях (палатах, кабинетах), женских консультациях и урологических кабинетах поликлиник". Согласно приказу оставляют 2 препарата от каждого больного гонореей или трихомониазом, 1 препарат окрашенный метиленовой синькой, другой неокрашенный. Из них готовят два исследуемых материала для выделения ДНК и последующего обнаружения возбудителей гонореи, трихомониаза и кандидоза методом ПЦР. Выделение ДНК из полученного исследуемого материала производят, используя готовые наборы реагентов разных фирм, например ЗАО "НПФ ДНК-Технология" (Россия).

Далее амплификацию выделенных ДНК и детекцию результатов амплификации производят на оборудовании для ПЦР анализа, например, на АйСайклер Ай Кью (I Cycler I Q) с оптической приставкой фирмы Bio-Rad (США).

Принцип метода состоит в следующем. Вначале производится лизис анализируемых образцов в лизирующем буфере. Затем выполняется полимеразная цепная реакция (ПЦР), суть которой заключается в том, что методом амплификации ин витро в течение нескольких часов выделяется и размножается определенная последовательность ДНК в количестве, превышающем исходную в миллионы раз. При амплификации с помощью ПЦР используют два олигонуклеотидных праймера (затравки), фланкирующие участок ДНК, специфический для определяемого патогенного агента. Процесс амплификации заключается в повторяющихся циклах температурной денатурации ДНК, отжига праймеров с комплементарными последовательностями и последующей достройкой полинуклеотидных цепей с этих праймеров ДНК-полимеразой. Медицинские лабораторные технологии, том 2 под редакцией А.И.Карпищенко, Санкт-Петербург "Интермедика", 2002, с.533-570. В таблице показаны результаты ПЦР анализа на трихомонады на этом оборудовании, проведенного 10 сентября 2003 года.

Первая колонка таблицы - координаты лунки в 96-луночном планшете, вторая - номер цикла амплификации, третья - фамилия больного и метод окраски мазков. Например, ДНК, выделенная из архивного препарата окрашенного метиленовой синькой от больной Сыроватской, находится в лунке С4, ее же ДНК, выделенная из архивного неокрашенного препарата, находится в лунке С9.

В лунке F8 находится положительный контрольный материал на трихомонады, а в F9 - отрицательный контрольный материал на трихомонады.

Из таблицы видно, что на ПЦР исследование взяты материалы от 5 женщин:

1. Сыроватская (SUROV), в ее окрашенном метиленовой синькой препарате от 1 февраля 2002 г. при световой микроскопии были найдены трихомонады, Trichomonas vaginalis.

2. Каратаева (KARAT), в окрашенном препарате от 25 августа 2002 г. были найдены трихомонады, Trichomonas vaginalis.

3. Новгородова (NOVG), в окрашенном препарате от 31 января 2002 г. были найдены трихомонады, Trichomonas vaginalis.

4. Петрова (PETR), также в окрашенном препарате от 7 марта 2002 г. были найдены трихомонады, Trichomonas vaginalis.

5. Ядрихинская (YEDRICH), также в окрашенном препарате от 17 апреля 2002 г. были найдены трихомонады, Trichomonas vaginalis.

Эти женщины лечились в гинекологическом отделении Якутской городской клинической больницы №1, препараты от каждой (один окрашенный метиленовой синькой, другой неокрашенный) хранились в клинико-диагностической лаборатории больницы. Сроки хранения препаратов составляют один год и более, поэтому они названы архивными препаратами.

Из таблицы видно, что во всех препаратах, из которых были приготовлены исследуемые материалы после одного года и более хранения, сохранились ДНК Trichomonas vaginalis (трихомонад).

Обнаружение, амплификация и детекция специфических фрагментов ДНК Trichomonas vaginalis методом ПЦР графически представлены на чертеже.

Обозначение на чертеже:

С4, С5, С6, С7, С8, С9, F4, F5, F6, F7, F8, F9 - лунки планшета, в которых находятся выделенные ДНК, цвет каждой лунки соответствует цвету кривой амплификации ДНК Trichomonas vaginalis на координатной плоскости. Например, в лунках С4 и С9 находились выделенные ДНК Trichomonas vaginalis из 2-х препаратов больной Сыроватской (SUROV, см. таблицу). Кривая темно-синего цвета на координатной плоскости, пересекающая линию Threshold Position на 12 (11,0) цикле амплификации, свидетельствует об обнаружении, амплификации и детекции специфических фрагментов ДНК Trichomonas vaginalis в лунке С4. То же самое в лунке С9, только кривая темно-зеленого цвета.

В лунке С4 находились выделенные ДНК Trichomonas vaginalis из препарата Сыроватской, окрашенного метиленовой синькой, а в лунке С9 выделенные ДНК из ее же неокрашенного препарата.

То же самое в парах лунок:

С5 и F4 - выделенные ДНК из препаратов Каратаевой и соответствующие им цветные кривые.

С6 и F5 - выделенные ДНК из препаратов Новгородовой и соответствующие им цветные кривые.

С7 и F6 - выделенные ДНК из препаратов Петровой и соответствующие им цветные кривые.

С8 и F7 - выделенные ДНК из препаратов Ядрихинской и соответствующие им цветные кривые.

F8 - положительный контроль Trichomonas vaginalis и соответствующая кривая синего цвета, пересекающая линию Threshold Position на 19 (18,1) цикле амплификации.

F9 - отрицательный контроль Trichomonas vaginalis и соответствую кривая вишневого цвета, проходящая ниже линии Threshold Position.

Вывод: применение архивных препаратов в качестве исследуемого материала для обнаружения возбудителей гонореи, трихомониаза и кандидоза методом ПЦР дает достоверные и воспроизводимые результаты.

Таблица
PCR Amplification vs Cycle: Data 10-Sep-03 1439.opd Threshold Cycle CtIdentifierС411.0SUROV METILС515.1KARAT METILС612.3NOVG METILС713.3PETR METILС815.3YEDRICH METILС919.1SUROV MAZOC NEOKRF419.5KARAT MAZOC NEOKRF514.9NOVG MAZOC NEOKRF618.4PETR MAZOC NEOKRF718.2YEDRICH MAZOC NEOKRF818.1POS TRICHF9N/ANEG TRICH

Изобретение относится к области медицины и биологии. Предложено использовать для выделения ДНК гонококков высушенные и окрашенные препараты соскобов из цервикального канала матки и уретры. Это позволяет увеличить время хранения исследуемого материала до года и более и повысить точность диагностики этих заболеваний методом ПЦР. Изобретение может быть использовано в лабораторной диагностике возбудителей гонореи, трихомониаза и кандидоза методом ПЦР. 1 ил., 1 табл.

Применение высушенных и окрашенных препаратов соскобов из цервикального канала матки и уретры в качестве материала для выделения дезоксирибонуклеиновой кислоты.