СПОСОБ ОКРАСКИ ЭОЗИНОФИЛЬНЫХ ЛЕЙКОЦИТОВ В МАЗКАХ МОКРОТЫ Российский патент 2009 года по МПК G01N33/48 

Область техники, к которой относится изобретение.

Изобретение относится к медицине, в частности к лабораторной диагностике.

Сущность изобретения

Задачами изобретения являются повышение точности распознавания эозинофильных лейкоцитов в мазках мокроты и облегчение диагностики воспалительных заболеваний легких аллергической природы.

В настоящее время для окраски мазков мокроты применяют способы окраски по Паппенгейму, метиленовым синим и Романовскому-Гимзе (Справочник медицинские лабораторные технологии, том 1./ Под редакцией А.И.Карпищенко, Санкт-Петербург, «Интермедика», 2002, с.213-220. Руководство по клинической лабораторной диагностике, часть 1./ Под редакцией проф. М.А.Базарновой. Киев. Головное издательство (Объединение «Вища школа», 1981, с.40). При микроскопическом исследовании мазков мокроты, окрашенных по Романовскому-Гимзе, обнаруживают следующие виды клеток: клетки эпилетия, альвеолярные макрофаги, эозинофильные лейкоциты, нейтрофильные лейкоциты, базофильные лейкоциты, моноциты и лимфоциты. Лейкоциты дифференцируют по их морфологии и окраске зернистости (справочник «Лабораторные методы исследования в клинике»./ Под редакцией профессора В.В.Меньшикова. Москва, «Медицина», 1987, с.124-125).

Однако при окраске мазков мокроты по Романовскому-Гимзе эозин калий не проникает в зозинофильные лейкоциты. Это обусловлено тем, что они окружены слизью, постоянным компонентом мокроты. В результате этого их специфические гранулы (синоним-эозинофильные гранулы) не окрашиваются эозином калием и не проявляется бесспорный признак эозинофильных лейкоцитов - специфическая зернистость в виде округлых объемных гранул одинакового размера и формы оранжевого цвета (Луговская С.А., Морозова В.Т., Почтарь М.Е., Долгов В.В. Лабораторная гематология. Москва, 2002, с.17).

Сущность способа

Фиксированные в пламени спиртовки мазки мокроты окрашивают смесью равных объемов 0,5% раствора эозина калия в этиловом спирте и 5% водного раствора фенола, дающей красное окрашивание специфических гранул эозинофильных лейкоцитов, в течение 40-50 минут. При таком способе окраски эозин калий легко проникает в эозинофильный лейкоцит и их специфические гранулы окрашиваются в красный цвет.

Для придания контрастности препарату мазки докрашивают 0,3% раствором метиленового синего в течение 20-30 секунд. Мазки исследуют с масляной иммерсией в световом микроскопе при увеличении 900-1000 раз. Эозинофильные лейкоциты распознают по красной окраске их специфической зернистости в виде округлых объемных гранул одинакового размера и формы, занимающих всю цитоплазму. Количество их подсчитывают. Например, абсолютное их количество в 100 полях зрения мазков.

Используя способ окраски, обнаруживают эозинофильные лейкоциты в неокрашенных и окрашенных другими способами мазках мокроты после длительного их хранения, до 3-х месяцев и более.

Применение предложенного способа дает следующие результаты:

1. Повышается точность распознавания эозинофильных лейкоцитов в мазках мокроты.

2. Облегчается диагностика воспалительных заболеваний легких аллергической природы, при которых характерно увеличение абсолютного количества эозинофильных лейкоцитов в мокроте.

3. Способ обеспечивает обнаружение эозинофильных лейкоцитов после длительного хранения мазков, до 3-х месяцев и более.

4. Способ может быть использован для выделения эозинофильных гранул в иммунологических исследованиях и разработке сферических магнитных частиц.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения.

Приготовление растворов. Готовят необходимый объем 0,5% раствора эозина калия в 96° этиловом спирте. Эозин калий водорастворимый, формула - С₂₀Н₆Br₄К₂O₅·nH₂О (Каталог химических реактивов и высоко чистых химических веществ. Москва, Химия, 1971 г., с.550).

Этиловый спирт. Формула С₂Н₅OH, молекулярный вес 46,07.

0,5 г сухой краски эозина калия растворяют в 100 мл 96° этилового спирта и получают 0,5% раствор эозина калия в этиловом спирте. Полученный раствор фильтруют через бумажный фильтр.

Готовят 5% водный раствор фенола. Формула - С₆H₅ОН, молекулярный вес 94,11.

5 г фенола растворяют в 100 мл дистиллированной воды и получают 5% водный раствор фенола. Полученный раствор фильтруют через бумажный фильтр. Далее смешивают полученные растворы - в 100 мл раствора фенола добавляют 100 мл раствора эозина калия. Смесь готова, она стабильна в течение 5-6 месяцев при хранении в посуде из темного стекла при комнатной температуре.

Ход окраски мазков мокроты.

На двух предметных стеклах готовят 2 мазка исследуемой мокроты. После высыхания их фиксируют в верхней трети пламени спиртовки в течение 3-5 секунд.

На каждое стекло накладывают полоску фильтровальной бумаги так, чтобы она полностью закрывала мазок. Это делают для того, чтобы краска не разливалась по стеклу. Наливают на бумагу приготовленную смесь с избытком. Мазки окрашивают в течение 40-50 минут, чтобы эозин калий проник в клеточную стенку эозинофильного лейкоцита. Пинцетом снимают и удаляют фильтровальную бумагу. Мазки тщательно промывают дистиллированной водой и докрашивают в течение 20-30 секунд 0,3% раствором метиленового синего. Вновь аккуратно промывают дистиллированной водой, наклоняя каждое стекло, чтобы стекала вода. Высушивают на открытом воздухе при комнатной температуре в вертикальном или наклонном положении.

В результате специфические гранулы эозинофильных лейкоцитов окрашиваются в красный цвет.

С использованием предложенного способа окрашены мазки мокроты больных Горевой М.Н., Тараканова В.Д. и Иванова Н.И., находившихся на лечении в Якутской городской клинической больнице с диагнозом пневмония.

Прилагаются результаты определения объектов, изображенных на фотографиях препаратов мокроты (далее - фигуры).

Фиг.1. увеличение 1000 раз.

Эозинофильный лейкоцит со специфическими гранулами красного цвета. Видны отдельные эозинофильные гранулы красного цвета, указаны стрелками.

Фиг.2. эозинофильный лейкоцит. В его цитоплазме видны 5 штук эозинофильных гранул, указаны стрелкой.

Фиг.3. эозинофильный лейкоцит с признаками дегрануляции. Эозинофильные гранулы разбросаны вне эозинофильного лейкоцита, указаны стрелками.

Фиг.4. эозинофильный лейкоцит, наверху эпителиальная клетка легких на слизи, эпителиальная клетка указана стрелкой.

Фиг.5. препарат был окрашен по способу Циль-Нильсена, потом через три месяца перекрашен предложенным способом. Эозинофильный лейкоцит на слизи, указан стрелкой.

Фиг.6. неокрашенный препарат был окрашен предложенным способом через три месяца после приготовления. Эозинофильный лейкоцит. Эозинофильные гранулы указаны стрелками.

В мазках мокроты, окрашенных предложенным способом, подсчитано абсолютное количество эозинофильных лейкоцитов в 100 случайных полях зрения у трех больных - Горевой М.Н., Тараканова В.Д. и Иванова Н.И. Количество эозинофильных лейкоцитов у Горевой М.Н. составило 50, Тараканова В.Д. 27, Иванова Н.И. 0.

Выводы:

1. Предложенный способ окраски эозинофильных лейкоцитов в мазках мокроты повышает точность их распознавания.

2. Способ дает возможность количественного подсчета эозинофильных лейкоцитов в мазках мокроты.

3. Используя способ, мазки мокроты, неокрашенные и окрашенные другими способами, красят на наличие эозинофильных лейкоцитов после длительного их хранения, до 3-х месяцев и более.

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике, и касается способа окраски эозинофильных лейкоцитов в мазках мокроты. Способ заключается в том, что фиксированный в пламени мазок мокроты окрашивают смесью равных объемов 0,5% раствора эозина калия в этиловом спирте и 5% водного раствора фенола, после чего докрашивают раствором метиленового синего. Использование способа позволяет повысить точность выявления эозинофильных лейкоцитов в мазках мокроты и упростить диагностику воспалительных заболеваний легких аллергической природы. 6 ил.

Способ окраски эозинофильных лейкоцитов в мазках мокроты, включающей использование эозина калия, отличающийся тем, что фиксированный в пламени горелки мазок окрашивают смесью равных объемов 0,5%-ного раствора эозина калия в этиловом спирте и 5%-ного водного раствора фенола в течение 40-50 мин, далее после промывания дистиллированной водой докрашивают в течение 20-30 с 0,3%-ным раствором метиленового синего.