СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ O-(2,3-ДИГИДРО-2,2-ДИМЕТИЛ-7-БЕНЗОФУРАНИЛ)-N-МЕТИЛКАРБАМАТА В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ Российский патент 2006 года по МПК G01N33/50 

Изобретение относится к биологии, токсикологической и санитарной химии, а именно к способам определения О-(2,3-дигидро-2,2-диметил-7-бензофуранил)-N-метилкарбамата в биологическом материале, и может быть использовано в практике санэпидемстанций, химико-токсикологических и ветеринарных лабораторий. Способ относится к числу массовых.

Известен способ определения органических веществ в биологическом материале, заключающийся в измельчении биологического объекта, неоднократного настаивания с этанолом (каждый раз в течение суток), объединения вытяжек, сгущения объединенного извлечения, осаждения в нем белков абсолютным этанолом, фильтрования, упаривания фильтрата до густоты сиропа и разбавления его водой с последующей экстракцией анализируемых соединений сначала из кислого, а затем из щелочного раствора (Швайкова М.Д. Токсикологическая химия. - М.: Медицина, 1975. - С.119-123).

Способ трудоемок, требует значительных затрат времени на его осуществление, характеризуется низкой степенью извлечения O-(2,3-дигидро-2,2-диметил-7-бензофуранил)-N-метилкарбамата.

Известен способ определения производных карбаминовой кислоты (1-нафтил-N-метилкарбамата) в биологических объектах путем измельчения биологической ткани, ее обработки гексаном в присутствии безводного сульфата натрия в течение 2-3 часов, отделения гексанового извлечения, упаривания до сухого остатка, растворения остатка в смеси вода-метанол, взятых в объемном отношении 3:2, прибавления к водно-метанольному раствору хлорида натрия, экстракции раствора хлороформом, отделения хлороформного экстракта, упаривания до сухого остатка, растворения остатка в гексане с последующим хроматографированием в тонком слое силикагеля на пластинах "Силуфол" с использованием подвижной фазы гексан-ацетон (3:1) и проявлением хроматограмм путем последовательной обработки водно-этанольным раствором гидроксида калия и раствором соли диазония (Лабораторные исследования в ветеринарии. Химико-токсикологические методы / Под ред. Б.И.Антонова. - М.: Агропромиздат, 1989. - С.160-162).

Способ характеризуется недостаточно высокой степенью извлечения O-(2,3-дигидро-2,2-диметил-7-бензофуранил)-метилкарбамата, относительно низкими точностью и чувствительностью определения.

Наиболее близким является способ определения O-(2,3-дигидро-2,2-диметил-7-бензофуранил)-N-метилкарбамата в биологическом материале, заключающийся в том, что биологическую робу измельчают, обрабатывают однократно порцией хлороформа в течение 20 минут, хлороформные вытяжки отделяют, фильтруют через безводный сульфат натрия, хлороформ из фильтрата испаряют до сухого остатка, остаток растворяют в воде, полученный раствор экстрагируют дважды хлороформом, экстракты объединяют, фильтруют через слой безводного сульфата натрия, фильтрат упаривают при 80°С до незначительного объема, хроматографируют в тонком слое силикагеля на пластинках "Силуфол" с применением подвижной фазы гексан-ацетон (3:2), а полученные хроматограммы проявляют путем последовательной обработки водно-этанольным раствором гидроксида калия и раствором соли диазония (Методы определения микроколичеств пестицидов в продуктах питания, кормах и внешней среде. Т.1, - М.: Колос, 1992. - С.402-406).

Способ характеризуется недостаточно высокими чувствительностью и точностью.

Задачей настоящего изобретения является повышение чувствительности и точности определения.

Поставленная задача достигается с помощью предлагаемого способа, который заключается в том, что биологическую ткань измельчают, двукратно обрабатывают смесью этилацетата и ацетона, взятых в соотношении 1:1 (по объему), каждый раз в течение 30 минут. Полученные извлечения объединяют, экстрагент испаряют, остаток растворяют в диэтиловом эфире, полученный раствор вносят в колонку с силикагелем, растворитель испаряют, процесс хроматографирования осуществляют, используя подвижную фазу гексан-ацетон (9:1), фракции элюата, содержащие O-(2,3-дигидро-2,2-диметил-7-бензофуранил)-N-метилкарбамат, объединяют, элюент испаряют, остаток растворяют в смеси растворителей ацетонитрил-вода (5:5) и хроматографируют методом ВЭЖХ в колонке с сорбентом "Новопак С-18" с применением подвижной фазы ацетонитрил-вода (5:5) и детектора на основе фотодиодной матрицы.

Способ осуществляется следующим образом: биологическую ткань, содержащую O-(2,3-дигидро-2,2-диметил-7-бензофуранил)-N-метилкарбамат, измельчают, дважды настаивают со смесью этилацетата и ацетона, взятых в соотношении 1:1 (по объему) и каждый раз в течение 30 минут. Извлечения отделяют от твердых частиц биоматериала, объединяют и объединенные извлечения упаривают до сухого остатка. Полученный остаток растворяют в смеси растворителей гексан-ацетон (9:1) и хроматографируют в колонке с силикагелем L 100/160 μ, используя подвижную фазу гексан-ацетон (9:1). Фракции элюата, содержащие O-(2,3-дигидро-2,2-диметил-7-бензофуранил)-N-метилкарбамат, объединяют, элюент испаряют, остаток растворяют в смеси растворителей ацетонитрил-вода (5:5) и хроматографируют методом ВЭЖХ в колонке с сорбентом "Новопак С-18" с применением подвижной фазы ацетонитрил-вода (5:5) и детектора на основе фото диодной матрицы.

Пример 1

Определение O-(2,3-дигидро-2,2-диметил-7-бензофуранил)-N-метилкарбамата в ткани печени

К 10 г мелкоизмельченной ткани печени прибавляют 5 мг O-(2,3-дигидро-2,2-диметил-7-бензофуранил)-N-метилкарбамата, тщательно перемешивают биологическую ткань с веществом и оставляют на сутки при температуре 18-20°С. По истечении указанного времени биологический объект, содержащий анализируемое вещество, заливают 20 мл смеси этилацетата и ацетона, взятых в соотношении 1:1 (по объему) и выдерживают 30 минут при периодическом перемешивании. Извлечение отделяют, операцию настаивания повторяют в указанных условиях. Отдельные вытяжки объединяют, экстрагент и извлеченную из биологической ткани воду испаряют в токе теплого воздуха. Остаток растворяют в 10 мл диэтилового эфира. Две порции полученного раствора (каждая по 1 мл) последовательно вносят в колонку размером 490×11 мм, заполненную 10 г силикагеля типа L 100/160 μ. После внесения каждой порции и вхождения раствора в сорбент диэтиловый эфир испаряют из сорбента путем продувания свободного пространства колонки над поверхностью сорбента воздухом с помощью вакуум-насоса. Хроматографирование осуществляют, используя подвижную фазу гксан-ацетон (9:1). Элюент собирают отдельными фрациями по 2 мл каждая. Фракции с 27 по 30, содержащие O-(2,3-дигидро-2,2-диметил-7-бензофуранил)-N-метилкарбамат, объединяют, элюент испаряют, остаток растворяют в 12,5 мл ацетонитрила, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводят водой до метки. Содержимое колбы перемешивают. 8 мкл полученного раствора вводят в хроматограф "Water Alian" (США). Процесс хроматографирования осуществляют в колонке размерами 150×3,9 мм, заполненной обращеннофазным сорбентом "Новопак С-18", используя подвижную фазу ацетонитрил-вода (5:5) и детектор на основе фотодиодной матрицы. Скорость подачи элюента составляет 1 мл/мин при температуре колонки 20°С. Оптическую плотность регистрируют при длине волны 278 нм.

Пик на хроматограмме с временем удерживания 2,25 мин (объем удерживания 2250 мкл) соответствует O-(2,3-дигидро-2,2-диметил-7-бензофуранил)-N-метилкарбамату.

Количественное содержание O-(2,3-дигидро-2,2-диметил-7-бензо-фуранил)-N-метилкарбамата определяют исходя из площади хроматографического пика по уравнению калибровочного графика и пересчитывают на навеску анализируемого вещества, внесенную в ткань печени.

Построение калибровочного графика

В ряд мерных колб вместимостью 50 мл вносят 0,19, 0,37, 1,25, 2,50, 5,00, 10,00, 20,00 мл 0,02% раствора, а также 4,00, 6,25 и 12,5 0,2% раствора O-(2,3-дигидро-2,2-диметил-7-бензофуранил)-N-метилкарбамата в ацетонитриле, прибавляют соответственно 24,81, 24,63, 23,75, 22,50, 20,00, 15,00, 5,00, 21,00, 18,75 и 12,50 мл ацетонитрила и доводят объем содержимого в каждой колбе до метки водой. 8 мкл каждого из полученных растворов вводят в хроматограф. Хроматографирование осуществляют в колонке размером 150×3,9 мм с сорбентом "Новопак С-18", используя подвижную фазу ацетонитрил-вода (5:5) и детектор на основе фотодиодной матрицы. Скорость подачи элюента составляет 1 мл/мин при температуре колонки 20°С. Оптическую плотность регистрируют при длине волны 278 нм. По результатам измерений на хроматографе строят график зависимости площади пика от концентрации определяемого вещества. График линеен в интервале концентраций 0,006-4,0 мкг. Методом наименьших квадратов рассчитывают уравнение калибровочного графика, которое в данном случае имеет вид:

S=0,75547×C-0,00156,

где: S - площадь хроматографического пика, см,

С - концентрация определяемого вещества в хроматографируемой пробе, мкг.

Результаты количественного определения O-(2,3-дигидро-2,2-ди-метил-7-бензофуранил)-N-метилкарбамата в ткани печени представлены в таблице 1.

Пример 2

Определение O-(2,3-дигидро-2,2-диметил-7-бензофуранил)-N-метилкарбамата в корнеплодах сахарной свеклы

К 10 г мелкоизмельченной ткани корнеплодов сахарной свеклы прибавляют 5 мг O-(2,3-дигидро-2,2-диметил-7-бензофуранил)-N-метилкарбамата, тщательно перемешивают биологическую ткань с вещством и оставляют на сутки при температуре 18-20°С. По истечении указанного времени биологический объект, содержащий анализируемое вещество, заливают 20 мл смеси этилацетата и ацетона, взятых в соотношении 1:1 (по объему) и выдерживают 30 минут, периодически перемешивая. Извлечение отделяют, операцию настаивания повторяют в указанных условиях. Отдельные вытяжки объединяют, экстрагент и извлеченную из биологической ткани воду испаряют в токе теплого воздуха. Остаток растворяют в 10 мл диэтилового эфира. Две порции полученного раствора (каждая по 1 мл) последовательно вносят в колонку размером 490×11 мм, заполненную 10 г силикагеля типа L 100/160 μ. После внесения каждой порции и вхождения раствора в сорбент, диэтиловый эфир испаряют из сорбента путем продувания свободного пространства колонки над поверхностью сорбента воздухом с помощью вакуум-насоса. Хроматографирование осуществляют, используя подвижную фазу гексан-ацетон (9:1). Элюат собирают отдельными фракциями по 2 мл каждая. Фракции с 27 по 30, содержащие O-(2,3-дигидро-2,2-диметил-7-бензофуранил)-N-метилкарбамат, объединяют, элюент испаряют, остаток растворяют в 12,5 мл ацетонитрила, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводят до метки водой. Содержимое колбы перемешивают. 8 мкл полученного раствора вводят в хроматограф "Water Alian" (США). Процесс хроматографирования осуществляют в колонке размером 150×3,9 мм, заполненной обращеннофазным сорбентом "Новопак С-18", используя подвижную фазу ацетонитрил-вода (5:5) и детектор на основе фото диодной матрицы. Скорость подачи элюента составляет 1 мл/мин при температуре колонки 20°С. Оптическую плотность регистрируют при длине волны 278 нм.

Пик на хроматограмме с временем удерживания 2,25 мин (объемом удерживания 2250 мкл) соответствует O-(2,3-дигидро-2,2-диметил-7-бензофуранил)-N-метилкарбамату.

Количественное содержание O-(2,3-дигидро-2,2-диметил-7-бензо-фуранил)-N-метилкарбамата определяют исходя из площади хроматографического пика по уравнению калибровочного графика и пересчитывают на навеску анализируемого вещества, внесенную в ткань корнеплодов сахарной свеклы.

Построение калибровочного графика и его уравнение приводятся в примере 1.

Результаты количественного определения O-(2,3-дигидро-2,2-ди-метил-7-бензофуранил)-N-метилкарбамата в ткани корнеплодов сахарной свеклы представлены в таблице 2.

Предлагаемый способ по сравнению с прототипом в 4·10³ раз повышает чувствительность определения в хроматографируемой пробе и в 8·10² раз - в биологическом материале, в 1,15 раз увеличивает степень извлечения O-(2,3-дигидро-2,2-диметил-7-бензофуранил)-N-метилкарбамата из биологической ткани, характеризуется более высокой точностью (относительная ошибка среднего результата снижается примерно в 4,5 раза - с ±9% до 1,79%).

Сравнительные характеристики предлагаемого и известного способов представлены в таблице 3.

Изобретение относится к биологии, токсикологической и санитарной химии. касается способа определения O-(2,3-дигидро-2,2-диметил-7-бензофуранил)-N-метилкарбамата в биологическом материале и может быть использовано в практике санэпидемстанций, химико-токсикологических и ветеринарных лабораторий. Способ осуществляют путем измельчения биологической ткани, двукратной обработки ее смесью этилацетата и ацетона, взятых в соотношении 1:1 по объему, каждый раз в течение 30 минут, испарения экстрагента, растворения остатка в диэтиловом эфире, внесения полученного раствора в колонку с силикагелем, испарения растворителя и хроматографирования, при котором используют подвижную фазу гексан:ацетон (9:1), фракции элюата, содержащие O-(2,3-дигидро-2,2-диметил-7-бензофуранил)-N-метилкарбамат, объединяют, элюент испаряют, а остаток растворяют в смеси растворителей ацетонитрил-вода (5:5) и хроматографируют методом ВЭЖХ в колонке с сорбентом "Новопак С-18", используя подвижную фазу ацетонитрил-вода (5:5) и детектор на основе фотодиодной матрицы. Технический результат: повышение чувствительности и точности определения, 3 табл.

Способ определения O-(2,3-дигидро-2,2-диметил-7-бензофуранил)-N-метилкарбамата в биологическом материале путем измельчения анализируемой пробы, обработки экстрагентом органической природы, испарения экстрагента, растворения остатка и хроматографирования, отличающийся тем, что обработку биологической ткани осуществляют смесью этилацетата и ацетона, взятых в соотношении 1:1 по объему, двукратно каждый раз в течение 30 мин, после испарения экстрагента остаток растворяют в диэтиловом эфире, вносят в колонку с силикагелем, растворитель испаряют, процесс хроматографирования осуществляют, используя подвижную фазу гексан: ацетон (9:1), фракции элюата, содержащие O-(2,3-дигидро-2,2-диметил-7-бензофуранил)-N-метилкарбамат, объединяют, элюент испаряют, а остаток растворяют в смеси растворителей ацетонитрил-вода (5:5) и хроматографируют методом ВЭЖХ в колонке с сорбентом "Новопак С-18", используя подвижную фазу ацетонитрил-вода (5:5) и детектор на основе фотодиодной матрицы.