СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ L-НАФТОЛА В МОЧЕ ЖИВОТНЫХ Российский патент 1994 года по МПК G01N33/50 

Изобретение относится к ветеринарной токсикологии, конкретно к количественному определению L-нафтола (метаболита севина) в моче животных, что может найти применение в практике работы ветеринарных лабораторий с целью прижизненной диагностики отравлений животных инсектоакарицидом - севином.

Севин - - L- нафтил-N-метилкарбамат (карбамат, карбарил, вентокс, севинокс, нафтил) широко применяется как инсектоакарицид контактно-кишечного действия против многих вредителей сельскохозяйственных культур и леса. Часто встречаются случаи отравления сельскохозяйственных животных из-за попадания в их организм этого пестицида с кормом. При остром отравлении севином его остатки полностью выводятся из организма овец и крупного рогатого скота в течение 15 дней. Выделение с молоком продолжается в течение 7 дней. При этом основная масса севина выделяется в виде L-нафтола, так как в щелочной среде севин быстро гидролизуется по схеме
H₂O + CH₃NH₂
Поэтому для прижизненной диагностики отравлений животных севином важное значение имеет выявление L-нафтола в выделениях животных.

Описаны методы определения севина в воде, тканях внутренних органов, молоке, крови, моче с использованием тонкослойной хроматографии.

Наиболее близким техническим решением (прототипом) к заявляемому является способ количественного определения севина в биологических субстратах и воде методом тонкослойной хроматографии. Согласно этому методу порции мочи (до 5 мл) разводят 0,25 н уксусной кислотой (1: 1 или 1: 2) и экстрагируют хлороформом. Хлороформ выпаривают, сухой остаток смывают гексаном или метанолом, наносят на пластинки и хроматографируют. После того, как подвижный растворитель поднимется на 8-10 см, пластинки вынимают, высушивают на воздухе и опрыскивают 15% -ным раствором едкого кали в 60% -ном этиловом спирте для гидролиза севина. Пластинки вновь просушивают на воздухе и опрыскивают 0,2% -ным раствором соли "прочный синий Б" для проявления препарата и продукта его метаболизма - L-нафтола. При этом Rf севина равна 0,33-0,37, L-нафтола - 0,51-0,58.

Недостатками указанного способа-прототипа являются:
1. Низкая чувствительность (выявляется 1 мкг в пробе);
2. Недостаточная степень экстракции (из анализируемой пробы извлекается 75% пестицида);
3. Сложная технология проявления хроматограмм с использованием 15% -ного спиртового раствора едкого кали (последний сильно разрушает целостность неподвижной фазы пластинки и опасен в обращении).

Целью изобретения является повышение чувствительности определения севина (L-нафтола) в анализируемом объекте и упрощение технологии проведения анализа.

Поставленная цель достигается тем, что:
- используется специальный прием, обеспечивающий преобразование севина в L-нафтол (проводится обработка мочи щелочью, в результате которой весь севин, содержащийся в моче, полностью переходит в L-нафтолат натрия, что исключает необходимость проведения щелочного гидролизата севина на пластинках);
- применяется новая операция очистки анализируемой пробы от коэкстрагентов (после перевода севина, содержащегося в моче в нерастворимый в хлороформе L-нафтолат натрия, пробу мочи экстрагируют хлороформом с целью извлечения коэкстрагентов, мешающих хроматографированию);
- применяется упрощенный прием проявления только одним проявителем без риска нарушения слоя адсорбента на пластине, при этом о количестве L-нафтола можно судить путем сравнения только одного пятна с контрольным.

Совокупность этих приемов позволяет повысить чувствительность анализа в 2 раза.

Заявляемое техническое решение соответствует критерию "новизна" ибо впервые разработана новая, более совершенная технология количественного определения L-нафтола в моче сельскохозяйственных животных с использованием тонкослойной хроматографии, позволяющая выявить L-нафтол в количестве 0,5 мкг.

"Существенными отличиями" предлагаемого технического решения (способа) являются:
Введение новой операции - очистки экстракта от коэкстрагентов (для этого проводится перевод L-нафтола в водорастворимый L-нафтолат натрия, после чего обрабатывают анализируемую пробу хлороформом, извлекая коэкстрагенты, которые мешают хроматографированию). После очистки пробы хлороформом и удаления хлороформа с коэкстрагентами проводят подкисление пробы уксусной кислотой до рН 1-2, переводя тем самым водорастворимую соль L-нафтолат натрия в L-нафтол, и проводят экстракцию хлороформом.

Вторым важным "существенным отличием" предлагаемого технического решения от способа-прототипа является то, что щелочная обработка пробы мочи способствует гидролизу остатков севина непосредственно в растворе, тем самым исключается необходимость дальнейшего гидролиза этого соединения на хроматографической пластинке.

Перечисленные отличия (признаки) заявляемого технического решения являются существенными потому, что каждый из них, отдельно взятый необходим, а все вместе взятые достаточны для того, чтобы отличить предлагаемый "способ. . . " от всех других и характеризовать его в том качестве, которое проявляется в положительном эффекте. Иначе отсутствие хотя бы одного из перечисленных признаков не дает возможности получить положительный эффект.

Положительный эффект заявляемого технического решения заключается прежде всего в повышении чувствительности анализа в 2 раза (определяется 0,5 мкг L-нафтола в пробе, а по способу-прототипу - только 1 мкг). Кроме того, повышается степень выявления пестицида (выявляется 95% , а по способу-прототипу всего 75% L-нафтола). Положительный эффект выражается также в упрощении технологии проведения анализа за счет одноразового проявления и исключения необходимости применения для опрыскивания пластин токсичного раствора едкого кали в этиловом спирте.

Для лучшего понимания предлагаемого "Способа. . . " проводили примеры конкретного осуществления количественного определения севина (L -нафтола) в моче овец.

П р и м е р 1. В круглодонные колбы с притертыми пробками объемом по 250 мл вносили по 10 мл мочи. Заражение мочи в этих колбах производили путем внесения хлороформного раствора L-нафтола (стандартов) с содержанием 0,25; 0,5; 1; 2; 3 и 5 мкг препарата (всего 6 колб). После того, как испарился растворитель, в колбы вносили 20% -ный водный раствор едкого натрa, пока рН мочи не стал равным 9-10. После этого колбы закрывали, встряхивали в течение 1-2 мин и в них вносили по 10 мл хлороформа. Экстракцию проводили путем встряхивания в течение 2-3 мин. Хлороформ, содержащий коэкстрагент, декантировали и отбрасывали. Затем в колбы с пробами мочи вносили 20% -ный раствор уксусной кислоты до тех пор, пока рН не понизился до 1-2. После этого в колбы вносили по 10 мл хлороформа и экстрагировали препарат путем встряхивания в течение 1-2 мин. После отстаивания и расслоения водного и хлороформного слоев хлороформ декантировали, обезвоживали путем добавления 2 г безводного сульфата натрия, упаривали до объема 30-50 мкл и поочередно наносили на стартовую линию хроматографической пластинки, отступая 2 см левого и нижнего краев. Отступая на 2 см от точки нанесения экстракта, наносили стандартные растворы с содержанием 0,25; 0,5; 1 и 2 мкг L-нафтола. Для каждой дозы заражения использовали отдельную пластинку. После того, как испарился растворитель, пластинку спускали в хроматографическую камеру с подвижной фазой гексан-ацетон в соотношении 3: 1. При поднятии фронта растворителя до отметки 10 см от стартовой линии пластинку вынимали, сушили при комнатной температуре и опрыскивали 0,2% -ным водным раствором соли диазония (прочный синий Б). В результате проведения экспериментов были получены следующие результаты. В опыте при заражении мочи дозой 0,25 мкг после проявления обнаруживался только след препарата, по которому трудно было судить о его количестве. В опыте при внесении в пробу мочи 0,5 мкг вещества после проявления хроматограммы обнаружили пятно препарата размером 0,4х0,5 см. компактное, округло-овальной формы, фиолетово-розового цвета. Окраска пятен устойчива в течение первых двух суток. При нанесении вещества в количестве 1-5 мкг выявлялись четкие пятна, интенсивность окраски и размер которых коррелировали с содержанием в моче L-нафтола. При нанесении доз, превышающих 5 мкг, такая зависимость отсутствовала. Из описанного примера следует, что чувствительность заявляемого "Способа. . . " с использованием нового приема экстракционной очистки с предварительным переводом L-нафтола в водорастворимую соль и хроматографического определения, составила 0,5 мкг в пробе, что в 2 раза выше чувствительности способа-прототипа. Степень извлечения препарата повысилась при этом с 75 до 95% .

П р и м е р ы 2-13. Для выяснения оптимального процента извлечения L-нафтола из пробы мочи были испытаны различные варианты экстракции препарата. Результаты этих опытов обобщены в табл. 1.

Исходя из данных, приведенных в табл. 1, можно сделать вывод, что наиболее оптимальное извлечение препарата из пробы мочи происходит при использовании способа экстракции по вновь разработанной схеме.

Для выяснения влияния щелочной обработки мочи перед очистительной экстракцией были проведены опыты при различных значениях рН. Результаты обобщены в табл. 2.

Из данных табл. 2 видно, что полный переход L-нафтола в водорастворимую соль L-нафтолат происходит при значении рН среды 9-10, при котором гербицид уже не переходит в органический растворитель. Исходя из этого следует подщелачивать среду (пробу) до достижения значения рН 9-10.

Для выяснения влияния кислотной обработки мочи на полноту перевода L- нафтолата в L-нафтол проведены опыты при различных значениях рН. Результаты их обобщены в табл. 3.

Из данных табл. 3 видно, что полный переход L-нафтолата в L-нафтол перед его экстракцией происходит при интервале значений рН среды 2,5-1. Поэтому в предлагаемой технологии рекомендуется подкислять среду до достижения значения рН 2-1.

П р и м е р ы 36-43. Для выяснения влияния технологии проявления на чувствительность способа проведены опыты с простым (одноразовым) и двойным проявлениями хроматограмм. Результаты опытов приведены в табл. 4.

Из данных табл. 4 видно, что гидролиз севина до L -нафтола, осуществляемый на хроматографических пластинках, ухудшает качество хроматограмм и делает невозможным индикацию L-нафтола, когда его количество в пробе мочи не превышает 0,5 мкг. В то же время согласно предлагаемому способу, когда гидролиз остатков севина происходит при обработке пробы едким натрoм (щелочная обработка пластин при этом не производится), на хроматограмме четко видно пятно от дозы 0,5 мкг, т. е. чувствительность способа повышается в 2 раза.

Кроме того, предлагаемый способ прост в технологическом отношении и базируется на применении доступных и дешевых реактивов, выпускаемых промышленностью, не требует применения токсичного метилового спирта и может использоваться в условиях ветеринарных лабораторий всех уровней.

Технико-экономическая эффективность предлагаемого решения заключается:
а) в повышении чувствительности способа определения L-нафтола по сравнению с прототипом в 2 раза (выявляется 0,5 мкг L-нафтола вместо 1 мкг по прототипу);
б) в повышении степени извлечения L -нафтола из пробы мочи (извлекается до 95% препарата вместо 75% по прототипу);
в) в упрощении технологии проведения анализа (отказ от использования 15% -ного спиртового раствора едкого кали в качестве первого проявителя).

(56) Антонов Б. И. Лабораторные исследования в ветеринарии. Химико-токсикологические методы. М. : Агропромиздат, 1989, с. 160.

Использование: в ветеренарии, в частности в токсикологических определениях. Сущность изобретения: способ анализа мочи животного ведут обработкой пробы мочи водным раствором едкого натра до pH 9 -10. Экстракт отбрасывают, а оставшуюся водную часть подкисляют укусусной кислотой и повторно экстрагируют хлороформом. Тонкослойную хроматографию проводят путем использования подвижной фазы из растворителей гексан-ацетон в соотношении 3 : 1. 4 табл.

СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ L-НАФТОЛА В МОЧЕ ЖИВОТНЫХ, включающий обработку пробы мочи, экстракцию хлороформом, тонкослойную хроматографию и проявление 0,2% -ным водным раствором соли диазония, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности способа и его упрощения, обработку пробы мочи осуществляют водным раствором едкого натра до рН 9 - 10, после экстракции хлороформом экстракт отбрасывают, оставшуюся водную часть подкисляют уксусной кислотой до рН 1 - 2 и повторно экстрагируют хлороформом, а тонкослойную хроматографию проводят путем использования подвижной фазы из растворителей гексан-ацетон в соотношении 3 : 1.