РАНОЗАЖИВЛЯЮЩЕЕ СРЕДСТВО Российский патент 2013 года по МПК A61K36/71 A61K31/15 A61P17/02 

Изобретение относится к медицине, конкретно к фармакологии и клеточным технологиям.

Высокая частота встречаемости травматических повреждений поверхностных тканей является основанием для разработки высокоэффективных ранозаживляющих средств.

Известно большое количество препаратов, гелей и мазей, обладающих способностью стимулировать процесс заживления ран (на основе метилурацила, солкосерила, облепихового масла и др.) [1, 2].

Недостатком данных средств является зачастую их недостаточная эффективность [2].

Задачей, решаемой настоящим изобретением, является расширение арсенала высокоэффективных ранозаживляющих средств.

Поставленная задача достигается применением напеллина в качестве ранозаживляющего средства.

Новым в предлагаемом изобретении является использование в качестве ранозаживляющего средства напеллина.

Используемое оригинальное средство напеллин было разработано и получено ФГБУ «НИИ фармакологии» СО РАМН (г. Томск) совместно с Национальным исследовательским Иркутским Государственным Техническим Университетом (г. Иркутск) и представляло собой 0,00025% водный раствор данного алкалоида. Напеллин извлекался из растительного сырья (травы растений семейства лютиковых) в виде свободных оснований экстракцией стандартным методом [3].

Интенсивность репаративной регенерации зависит от большого количества факторов: состояния иммунной системы, микроциркуляторного русла, функциональных возможностей клеток стромы кожи и др. [4]. При этом важная роль в процессе заживления больших дефектов тканей в последнее время отводится реализации ростового потенциала прогениторных, в том числе стволовых (СК), клеток [4, 5]. При этом существует фармакологическая стратегия регенеративной медицины, заключающаяся в стимуляции функций эндогенных СК. Причем активация последних может являться следствием как прямого воздействия фармакологических агентов на прогениторные элементы, так результатом стимуляции клеток микроокружения тканей, опосредованно определяющих ускоренное течение репаративных процессов [5].

Ранее нами было показано ускорение заживления ран кожи комплексными экстрактами и алкалоидной фракцией живокости высокой [6]. При этом максимальный ранозаживляющий эффект наблюдался при использовании суммы алкалоидов, среди которых доминирующим является элатин [7]. В то же время с помощью метода тонкослойной хроматографии в алкалоидной фракции было установлено содержание других алкалоидов, в том числе напеллина. Напеллин (C22H33NO3),

представляет собой гетероциклическое азотсодержащее органическое соединение растительного происхождения. Чаще всего его извлекают из растений рода Аконит, хотя он встречается и в других растениях [6, 8]. При этом влияние напеллина на процессы регенерации тканей не изучено. Эксперимент показал непредсказуемые результаты.

Факт применения напеллина с достижением нового технического результата, заключающегося в стимуляции процесса заживления ран, для специалиста не является очевидным.

Новые свойства не вытекают явным образом из уровня техники в данной области и не обнаружены в патентной и научно-технической литературе.

Предлагаемое изобретение может быть использовано в медицине.

Исходя из вышеизложенного, следует считать заявляемое техническое решение соответствующим критериям: «Новизна», «Изобретательский уровень», «Промышленная применимость».

Эксперименты были проведены на 76 беспородных мышах-самцах. Животные получены из питомника отдела экспериментального биомедицинского моделирования ФГБУ «НИИ фармакологии» СО РАМН.

Исследования проводили в соответствии с правилами лабораторной практики (GLP), Приказом МЗСР РФ №708н от 23.08.2010 «Об утверждении правил лабораторной практики», Федеральным Законом от 12 апреля 2010 г. №61-ФЗ «Об обращении лекарственных средств», «Руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» (Москва, 2005).

Пример 1

Фармакологические свойства средства изучали на модели плоскостной кожной раны [9]. На депилированном участке спины у мышей под легким эфирным наркозом вырезали лоскут кожи размером 10×10 мм. Для моделирования более длительного заживления струп с экспериментальной раны регулярно (через сутки) снимали.

Предлагаемое средство получали из травы аконита байкальского и живокости высокой. Надземная часть растений, собранная в период цветения в Иркутской области, измельчалась до размера частиц менее 5 мм, обрабатывалась раствором карбоната натрия и подвергалась непрерывной экстракции хлороформом в течение 5 суток. Хлороформный экстракт упаривали до небольшого объема и тщательно экстрагировали 5% серной кислотой. Кислотную вытяжку подщелачивали карбонатом натрия до рН 9-10 и последовательно экстрагировали сначала эфиром, затем хлороформом. Эфирный экстракт упаривали досуха, растворяли в небольшом количестве эфира и хроматографировали на дезактивированной окиси алюминия в системе гексан-ацетон (90→50%). Эфирорастворимую фракцию подвергли дробной экстракции буферными растворами с увеличивающимися значениями рН. Эфирный раствор, оставшийся после экстракции наиболее щелочным буфером, упаривали досуха и хроматографировали на окиси алюминия в системе гексан-метанол с элюцией напеллина. Вещество растворяли в дистиллированной воде до конечной концентрации 0,00025%.

Полученное средство применяли наружно, начиная с первого дня после моделирования раны, ежедневно в течение всего периода заживления. Раствор наносили в объеме 50 мкл. В качестве средств сравнения использовали гель «Солкосерил» (Ай Си Эн Швейцария АГ, Швейцария) и «Облепиховое масло» (ОАО Нижфарм, Россия), которые применяли по той же схеме и в эквивалентном количестве, что и раствор напеллина.

Критериями ранозаживляющего действия служили средний диаметр раны и результаты гистологического исследования биоптатов кожи мышей, полученных на 15-е сутки из края раневого дефекта. Биопсийные образцы раневого дефекта кожи окрашивали гематоксилин-эозином. В каждом препарате оценивали: рельеф регенерата кожи, степень и характер инфильтрации, наличие и выраженность отека, количество новообразованных сосудов, волосяных фолликулов и потовых желез. Изучали такие патоморфологические процессы, как акантоз, гиперкератоз, дискератоз [10]. На 3-и и 5-е сут методом клонирования определяли содержание мезенхимальных клеток-предшественников (КОЕ-Ф) в раневой поверхности [11], а также методом колониеобразования в тест-системе изучали продукцию гуморальных факторов стромальными клетками кожи (колониеобразующую активность супернатантов адгезирующих клеток с раневой поверхности в отношении КОЕ-Ф костного мозга) [11]. Кроме того, изучали прямое влияние напеллина на КОЕ-Ф. Для этого его вносили в культуру миелокариоцитов в концентрации 50 нМ, после чего на 7-е сут подсчитывали количество колоний [11]. Обработку результатов проводили методом вариационной статистики с использованием t критерия Стьюдента и непараметрического U критерия Манна-Уитни.

Использование напеллина способствовало значительному ускорению процессов регенерации. Заживление дефекта в данном случае наблюдалось к 14 сут опыта, в то время как при применении средств сравнения таковое отмечалось лишь к 16 сут. Кроме того, при нанесении напеллина на раневую поверхность существенно ниже, чем в группе контроля, был и диаметр раны (таблица 1).

При этом анализ морфологических процессов, протекающих в области раневого дефекта кожи мышей, показал, что в контрольной группе имело место формирование неполноценного регенерата. В подавляющем большинстве случаев поверхностный эпителий наблюдался не на всем протяжении, встречались небольшие участки отслойки эпидермиса от дермы с наличием субэпидермальных щелей, отмечалось резкое утолщение эпителиального пласта с нечеткой дифференцировкой слоев и увеличение количества базального, зернистого и рогового слоев. Внутриэпителиально обнаруживались нейтрофильные лейкоциты с формированием микроабсцессов, наблюдались слабовыраженные явления акантоза, гипер- и дискератоза. Подлежащая ткань была представлена созревающими грануляциями с умеренной гистиоцитарно-лейкоцитарной инфильтрацией, явлением отека и очагами кровоизлияний в верхних слоях дермы. Во всех образцах в прилежащей к зоне дефекта ткани отмечается малое количество волосяных фолликулов и потовых желез. Регенерат кожи у животных контрольной группы характеризовался умеренным воспалением, что привело к усиленной пролиферации эпителия, для которой характерны атипические разрастания и изменения эпителия в виде акантоза, гипер- и дискератоза. Изучение гистоструктуры раневого дефекта в группе животных, получавших терапию напеллином, показало практически во всех случаях формирование полноценного соединительно-тканного рубца, покрытого эпителием. В остальных образцах (группы сравнения) эпителиальный слой был резко неравномерный, с утолщением в зоне дефекта за счет клеток базального слоя. Подлежащая ткань - грануляционная, местами с очаговой умеренной нейтрофильной инфильтрацией. В области, прилежащей к дефекту, во всех образцах ткани отмечалось умеренное количество волосяных фолликулов и потовых желез. При этом количество животных, у которых произошла полная эпителизация при использовании предлагаемого средства, было достоверно выше, чем в контроле (таблица 2).

Исследование механизмов регенеративной активности данного средства выявило ряд уникальных феноменов. Так, напеллин оказывал значительное стимулирующее влияние в отношении мезенхимальных клеток-предшественников раневой поверхности (таблица 3). Причем возрастание данного показателя наблюдалось на фоне повышения продукции ростовых факторов стромальными клетками кожи (таблица 4). В то же время было выявлено и выраженное прямое влияние данного алкалоида на прогениторные клетки. Внесение напеллина в культуру миелокариоцитов сопровождалось значительным увеличением выхода в метилцеллюлозной среде числа КОЕ-Ф (таблица 5). Изучение влияния средств сравнения на данные параметры не выявило статистически значимых изменений их динамики (таблица 3-5).

Полученные результаты свидетельствуют о выраженной ранозаживляющей активности напеллина, связанной с активацией популяции мезенхимальных клеток-предшественников, содержащих в своем составе не только стромальные прекурсоры, но и истинные (мультипотентные) СК, способные дифференцироваться в эпителиоциты [12].

Таблица 1 Динамика среднего диаметра ран, в см (Х±m) Сроки исследования сутки Контроль Напеллин Солкосерил Облепиховое масло 1 1,09±0,01 1,08±0,04 1,06±0,03 1,03±0,02 3 0,98±0,02 0,92±0,03 1,0±0,02 0,92±0,04 5 0,9±0,02 0,79±0,02* 0,78±0,03* 0,9±0,03 7 0,76±0,03 0,66±0,02* 0,73±0,02 0,67±0,02* 9 0,57±0,02 0,51±0,01* 0,51±0,01* 0,54±0,03 12 0,28±0,03 0,16±0,05* 0,21±0,01* 0,2±0,01* 14 0,1±0,03 0,0±0,0 0,07±0,01 0,06±0,02 16 0,06±0,03 0,0±0,0 0,0±0,0 0,0±0,0 * - отмечена достоверность относительно контроля при p<0,05

Таблица 2 Доля животных с полной эпителизацией места дефекта кожи, в % (Х±m) Контроль Напеллин Солкосерил Облепиховое масло 4,6±0,9 86,8±5,9* 56,4±10,3* 51,7±9,4* * - отмечена достоверность относительно контроля при p<0,05

Таблица 3 Содержание мезенхимальных клеток-предшественников в раневой поверхности, на 2,5×10⁵ нуклеаров, (Х±m) Сроки исследования сутки Контроль Напеллин Солкосерил Облепиховое масло 3 0,67±0,21 3,0±0,37* 0,7±0,3 0,65±0,19 5 1,17±0,3 2,67±0,33* 1,0±0,22 0,92±0,43 * - отмечена достоверность относительно контроля при p<0,05

Таблица 4 Колониестимулирующая активность супернатантов стромальных клеток кожи, в усл. Ед×10⁵, (Х±m) Сроки исследования сутки Контроль Напеллин Солкосерил Облепиховое масло 3 8,08±0,57 12,1±0,95* 11,3±2,42 7,65±0,78 5 0,17±0,11 2,83±0,34* 1,0±0,57 0,19±0,03 * - отмечена достоверность относительно контроля при p<0,05

Таблица 5 Число КОЕ-Ф в культуре клеток костного мозга при добавлении стимуляторов регенерации, на 2,5×10⁵ миелокариоцитов, (X±m) Контроль Напеллин Солкосерил Облепиховое масло 12,25±0,85 19,75±0,85* 13,7±0,64 10,32±0,79 * - отмечена достоверность относительно контроля при p<0,05

Литература

1. Машковский М.Д. Лекарственные средства: 15-е изд. - М.: ОО «Изд-во Новая Волна», 2008. - 1206 с.

2. Котельников В.П. Раны и их лечение. - М.: Знание. 1991. - 123 с.

3. Погодаева Н.Н., Жапова Ц., Верещагин А.Л., Горшков А.Г., Семенов А.А. / Изучение алкалоидного состава некоторых видов сибирских аконитов. // Раст. ресурсы, вып.2, 2000 г., С.79-84.

4. Бабаева А.Г. Регенерация: факты и перспективы. - М.: Изд-во РАМН, 2009. - 336 с.

5. Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н. Клеточная терапия: новые подходы. // Наука в России. - Москва: Изд-во «Наука», 2009. - Том. 169. - №1. С.4-8.

6. Нестерова Ю.В., Поветьева Т.Н., Нагорняк Ю.Г., Перова А.В., Андреева Т.И., Рослякова Е.П., Суслов Н.И. Механизмы влияния комплексных и выделенных веществ на репаративную активность тканей в эксперименте. // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2009. - Т.72, №3. - С.40-43.

7. Муравьева Д.А., Самылина И.А., Яковлев Г.П. Фармакогнозия: Учебник 3-е изд. - М.: Медицина, 2002.

8. Осадчий С.А., Ганбаатар Ж., Шульц Э.Э., Толстиков Г.А. Алкалоиды сибирских видов живокости и аконита и их превращения. // Материалы Первой Международной конференции "Химия и биологическая активность азотистых гетероциклов и алкалоидов" (том 1), Москва, 9-12 октября 2001 г.

9. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. / Под общей редакцией член-корр. РАМН, проф. Р.У.Хабриева. - 2-изд., перераб. и доп. - М.: ОАО «Издательство «Медицина», 2005. - 832 с.

10. Микроскопическая техника. / Под ред. Д.С.Саркисова. М., 1996.

11. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Шахов В.П. Методы культуры ткани в гематологии. Томск, 1992.

12. Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., Жданов В.В. и др. Иммобилизированный гранулоцитарный колониестимулирующий фактор. Фармакологические свойства и перспективы использования. - Томск: Изд-во: ООО «Печатная мануфактура», 2011. - 149 с.

Изобретение относится к фармацевтике, а именно к ранозаживляющим средствам. Предлагается применение напеллина в качестве ранозаживляющего средства. Напеллин эффективен в качестве ранозаживляющего средства. 5 табл., 1 пр.

Применение напеллина в качестве ранозаживляющего средства.