СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ НАИБОЛЕЕ ЗНАЧИМЫХ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ НЕГОНОКОККОВЫХ УРОГЕНИТАЛЬНЫХ ИНФЕКЦИЙ (CHLAMYDIA TRACHOMATIS, MYCOPLASMA HOMINIS, UREAPLASMA UREALYTICUM, CYTOMEGALOVIRUS, HERPES SYMPLEX I/II) У ДЕТЕЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МЕТОДА ПЦР Российский патент 2006 года по МПК G01N33/48 C12Q1/68 

Изобретение относится к медицине, в частности к лабораторной диагностике инфекционных заболеваний, конкретно негонококковых урогенитальных инфекций.

Негонококковые урогенитальные инфекции (НУГИ) группа клинически многообразных заболеваний бактериальной и вирусной этиологии, поражающих преимущественно органы мочеполовой системы. Восприимчивость человека к НУГИ высока - приближается к 100%. Заболевания характеризуются склонностью к хронизации и персистенции. Стойкого иммунитета не вырабатывается. В настоящее время на фоне ослабления иммунного статуса организма, связанного с загрязнением окружающей среды, стрессовым прессингом, НУГИ становятся все более актуальными и социально значимыми. Клинические проявления многообразны, трудно прослеживается связь отдельных видов возбудителей с определенными формами патологии. У женщин возбудители НУГИ вызывают воспалительные процессы - уретриты, циститы, вагиниты, кольпиты, эндометриты, сальпингиты, оофориты [3, 4, 7].

Показано существенное влияние НУГИ на репродуктивную функцию. Во время беременности возбудители НУГИ активизируются и могут стать причиной спонтанных абортов и преждевременных родов. Одними из возможных последствий воспалительных процессов гениталий являются нарушение овуляции, проходимости маточных труб, что может привести к бесплодию [5, 9].

Одной из важнейших проблем, связанных с НУГИ, являются внутриутробные инфекции. Женщины - больные и носители возбудителей НУГИ - в 40-60% случаев передают инфекцию новорожденным. Заражение плода может происходить внутриутробно или при прохождении через родовые пути и зависит от локализации и выраженности воспалительного процесса. Чем раньше происходит инфицирование плода, тем более существенными могут быть патологические изменения. При внутриутробной инфекции возбудителями НУГИ поражаются органы дыхания, зрения, почки, печень, центральная нервная система, что может стать даже причиной гибели плода [6, 12].

У детей с внутриутробным инфицированием в анамнезе впоследствии могут развиться заболевания дыхательной системы инфекционно-аллергической природы: обструктивный бронхит, астма, ювенильный артрит, поражения печени и селезенки, полилимфоаденопатия, сопровождающаяся длительным субфебрилитетом [8].

Анализ литературных данных и результаты собственных исследований позволили определить спектр наиболее распространенных и значимых возбудителей НУГИ - Clamydia trachomatis. Мусор lasma hominis, Ureaplasma urealyticum, Cytomegalovirus, Herpes symplex I/II.

Целесообразно обследовать на данный спектр инфекционных агентов новорожденных и детей первого года жизни с недоношенностью, гипотрофией, анемией, поражением ЦНС, гепатоспленомегалией, желтухой неясного генеза, а также детей с подозрением на внутриутробное инфицирование и детей, рожденных от матерей, инфицированных возбудителями НУГИ.

В данных группах риска отмечается следующая частота выявления отдельных видов возбудителей НУГИ: Cytomegalovirus - 53,6%; Ureaplasma urealyticum - 22,6%; Mycoplasma hominis - 19,0%; Clamydia trachomatis - 3,5%; Herpes symplex I/II типов - 2,8% [6, 12].

Clamydia trachomatis, Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum, Cytomegalovirus, Herpes symplex I/II типов являются контаминантами и паразитами слизистых оболочек. Они могут присутствовать практически в любой биологической жидкости организма.

Традиционными объектами для выявления возбудителей НУГИ у детей являются моча, слюна, кровь, слезное отделяемое. Частота выявления инфекционных агентов в различных субстратах неодинакова. Чаще всего возбудители НУГИ регистрируются в моче и слюне, реже в слезном отделяемом и существенно реже в крови. Как правило, инфицированным является один из субстратов, в 10-15% случаев возбудитель выявляется в двух субстратах (моча - слюна; слюна - слезное отделяемое), в единичных случаях инфицированы три объекта.

Наиболее перспективным методом детекции возбудителей НУГИ является метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). В настоящее время он широко применяется в практической диагностике инфекционных заболеваний. Преимущества ПЦР перед классическими методами особенно ярко проявляются при диагностике инфекций, вызываемых некультивируемыми или труднокультивируемыми в лабораторных условиях микроорганизмами. К этой группе инфекционных агентов относятся возбудители НУГИ.

Метод ПЦР благодаря многократному увеличению (амплификации) уникального фрагмента ДНК искомого патогена позволяет достичь высокой чувствительности и выявляет 10-100 клеток или вирионов в пробе.

Использование гибридизации нуклеиновых кислот как стартового этапа для ПЦР дает возможность достигать высокой специфичности (до 100%) и избежать ложноположительных результатов. В отличие от микробиологических методов ПЦР не требует выделения чистых культур возбудителей. Исследуют непосредственно биопробы от больных: биоптаты, соскобы слизистых, кровь, моча, слюна, кал и др. Проведение ПЦР автоматизировано за счет программируемых термостатирующих устройств (термоциклеров, амплификаторов). Это уменьшает продолжительность анализа, снижает его трудоемкость. Использование метода ПЦР позволяет получить результат в течение рабочего дня (6-7 часов) [11].

В проанализированной нами научной литературе, посвященной обследованию детей на возбудители НУГИ методом ПЦР, аналогичные исследования проводят либо в одном из субстратов, либо анализируют несколько субстратов по отдельности.

Представляем как варианты предшествующего уровня техники следующие работы: - публикация [2].

В данной работе отбирались мазки с глаз, мазок обрабатывали (выделяли нуклеиновые кислоты) и методом ПЦР выявляли Chlamydia trachomatis. В качестве мишени для детекции использован фрагмент гена 16S РНК. В группе пациентов с клиническими признаками трахомы хламидии выявлены в 74,2%, у пациентов без клинических симптомов - в 3,4%. Авторами сделан вывод, что данный метод хорош для диагностики глазных хламидиозов, благодаря превосходным показателям чувствительности и специфичности.

Публикация [1]

В данной работе исследовались клетки крови, моча, мазки из горла (по отдельности) на присутствие цитомегаловируса. Выявлялись - вирусная ДНК методом ПЦР и мРНК позднего вирусного антигена методом ОТ-ПЦР. У больных с клиническими симптомами ЦМВ-инфекции (ЦМВИ) вирусная ДНК выявлялась достоверно чаще (в 100%), чем в группе иммунодефицитных детей без симптомов ЦМВИ (25%). Матричная РНК ЦМВ выявлена у всех больных с выраженной ЦМВИ и не выявлена у детей, не имеющих симптомов инфекции.

Оба данных подхода имеют свои недостатки. При исследовании только одного объекта высока вероятность ложноотрицательного результата. Инфекционный агент не выявляется, поскольку он отсутствует в данном субстрате, но при этом имеется в другом. Изучение различных объектов по отдельности на полный спектр возбудителей НУГИ высокозатратно и увеличивает продолжительность исследования. Так, для исследования мочи, слюны, крови, слезного отделяемого на 5 инфекционных агентов необходимо проведение 4 пробоподготовок и 20 ПЦР-анализов.

Целью предлагаемого изобретения является повышение эффективности, оптимизация и снижение стоимости комплексного (на 5 наиболее значимых возбудителей НУГИ) ПЦР-обследования новорожденных и детей первых лет жизни.

В предлагаемом нами варианте исследования выявление возбудителей НУГИ проводят в смеси субстратов (моча, слюна, кровь, слезное отделяемое) от одного пациента.

При приготовлении смеси для ПЦР-детекции возбудителей НУГИ берут 4 субстрата от одного человека, при этом эффект разбавления, по сравнению с пулировнием, незначителен. При сравнительном исследовании выборки из 50 детей, у которых анализировали смесь и субстраты по отдельности, не было получено ложноположительных результатов при обработке биологической смеси.

Способ осуществляют следующим образом.

Пример 1.

От обследуемого пациента забирают в отдельные одноразовые пластиковые пробирки мочу, слюну, слезное отделяемое, кровь; готовят смесь субстратов, содержащую по 50 мкл каждого из них.

К 200 мкл смеси добавляют 600 мкл лизирующего раствора, 15 мкл внутреннего контрольного образца, 30 мкл сорбента. Продолжительность лизиса при 65°С - 8 минут.

Для выделения нуклеиновых кислот из смеси субстратов может быть использован классический фенольно-хлороформный метод [10]. Наиболее технологичным вариантом пробоподготовки являются сорбционные технологии выделения ДНК и РНК.

Мы проводили обработку смеси субстратов набором реактивов "ДНК-сорб Б" разработки и производства и Центрального НИИ эпидемиологии МЗ РФ. При использовании данного набора реактивов после обработки не наблюдается ингибирования ПЦР.

Последующие стадии отмывки проводят в соответствии с инструкцией к "ДНК сорб Б".

Для ПЦР детекции Clamydia trachomatis, Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum, Cytomegalovirus, Herpes symplex I/II типов используют тест-системы серии "АмплиСенс" разработки и производства Центрального НИИ эпидемиологии МЗ РФ согласно инструкций или аналогичные системы других фирм.

Выявление продукта амплификации проводят методом электрофореза в агарозном геле [10]. Визуализацию электрофореграмм осуществляют с использованием системы для обработки изображений "Биотест".

Пример 2.

Поскольку вероятность выявления возбудителей НУГИ в крови невелика (менее 1%), при проведении практических исследований можно ограничится анализом смеси мочи, слюны, слезного отделяемого. Эти субстраты смешивают по 50 мкл.

Для обработки данного варианта смеси применяют набор "ДНК-сорб А" производства ЦНИИЭ МЗ РФ. Он имеет меньшую стоимость, процедура обработки с использованием этого набора проще и менее продолжительна. При отсутствии в смеси крови данная пробоподготовка достаточна, ингибирования ПЦР не наблюдалось.

К 150 мкл смеси добавляют 450 мкл лизирующего буфера, 11 мкл внутреннего контроля и 22 мкл сорбента, время лизиса при 65°С - 8 мин. Последующие стадии отмывки проводят в соответствии с инструкцией к "ДНК сорб А".

Для ПЦР детекции Clamydia trachomatis, Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum, Cytomegalovirus, Herpes symplex I/II типов используют тест-системы серии "АмплиСенс" разработки и производства Центрального НИИ эпидемиологии МЗ РФ согласно инструкций или аналогичные системы других фирм.

Выявление продукта амплификации проводят методом электрофореза в агарозном геле [10]. Визуализацию электрофореграмм осуществляют с использованием системы для обработки изображений "Биотест".

Положительный эффект.

Одновременная ПЦР детекция Chlamydia trachomatis, Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum, Cytomegalovirus, Herpes symplex I/II позволяет выявлять большую часть всех атипичных возбудителей, встречающихся у новорожденных и детей первых лет жизни.

По результатам наших исследований частота выявления бактерий родов Микоплазма, Хламидия, вирусов группы герпеса у больных детей составила (совокупно): в крови - 1-5%; в слезном отделяемом - 8-10%; в моче - 20-25%; в слюне - 30-37%; в смеси субстратов - 48-50%. Использование для исследования смеси, а не одного из субстратов повышает эффективность выявления возбудителей НУГИ на 25-30%.

Предлагаемый алгоритм обследования позволяет значительно снизить затраты, это обусловлено тем, что на первом этапе исследуется смесь, а не субстраты по отдельности. Наличие у исследователя всех 4 субстратов позволяет при необходимости уточнить в каком материале присутствуют микроорганизмы, выявленные на первом этапе. Эффект экономии обусловлен тем, что на втором этапе отдельные субстраты исследуются уже не на 5 инфекционных агентов, а на те, которые выявлены в смеси субстратов (в смеси в 68% случаев выявляется моноинфекция, ассоциации из 2 возбудителей встречаются в 27% случаев и только 5% приходится на ассоциации из 3 и более возбудителей). Таким образом, при экономии средств информативность исследования не снижается.

При ПЦР-исследовании смесей субстратов от 554 детей (новорожденных, детей первого года жизни, детей с 1 года до 7 лет) одновременно на 5 видов возбудителей НУГИ было выявлено 279 (50,5%) инфицированных. У 190 (34,3%) из них выявлен 1 инфекционный агент, у 74 (13,4%) - ассоциации из 2 инфекционных агентов, у 11 (2,0%) - из 3, у 1 (0,2%) - из 4.

Для изучения смесей субстратов было проведено 554 пробоподготовки и 2770 ПЦР исследований. Уточнения какой из субстратов инфицирован не проводилось. При проведении этого этапа работ дополнительно потребовалось бы еще 1116 пробоподготовок и 1500 ПЦР-исследований. Для осуществления развернутого исследования 554 детей с применением технологии смесей необходимо 1670 пробоподготовок и 4270 ПЦР исследований. Для проведения аналогичной работы при исследовании 4 субстратов отдельно потребовалось бы 2216 пробоподготовок и 11080 ПЦР исследований.

Следовательно, при работе со смесью субстратов от 554 пациентов (развернутый анализ) проводиться на 546 пробоподготовок и 6810 ПЦР-реакций меньше, чем при исследовании такого же количества пациентов по традиционной схеме.

Наш опыт работы при проведении реальных практических анализов показал, что для уточнения диагноза и принятия решения о проведении соответствующей терапии врачу, как правило, достаточно результата исследования смеси субстратов. В ряде случаев, при тяжелой клинической картине, дополнительно исследуют кровь. При данном варианте детекции возбудителей НУГИ эффект экономии еще больше.

Литература

1. Nishihara H, Ito M, Matsumoto N, Nakano T, lhara T, Kamiya H, Sakurai M. Detection of human cytomegalovirus DNA in immunocompromised children by polymerase chain reaction.// Clin Diagn Virol. - 1995 - v.3 - № 1 - с.73-81.

2. Zou J, Liu S, Xiao W, Yang X. Evaluation of polymerase chain reaction for detection of Chlamydia trachomatis in eye swabs/.// Yan Ke Xue Bao - 2000, - v.16 - 124-126.

3. Гранитов В.Н. Хламидиозы. M.: Мед. книга. - 2000. - 192 С.

4. Гранитов В.Н. Герпесвирусная инфекция. М.: Мед. книга. - 2001. - 80 С.

5. Дмитриев Г.А. Современные методы диагностики наиболее распространенных инфекций, передаваемых половым путем. Consilium medicum. - Дерматология, венерология. - 2002. - № 4. - с.256-259.

6. Евсюкова И.И., Патрушева Е.Н., Савичева А.М. и др. Актуальные проблемы клиники, диагностики и лечения хламидийной инфекции у новорожденных детей.//Акушерство и гинекология. - 1995. - № 1. - с.25-36.

7. Козлова В.И., Пухнер А.Ф. Вирусные, хламидийные, микоплазменные заболевания гениталий. M. - 1995. - 261 С.

8. Коноплева Т.В., Лукушкина Е.Ф., Мазепа В.Н. и др. Использование полимеразной цепной реакции при диагностике микоплазменной инфекции у детей раннего возраста.// В сборнике науч.тр. "Здоровье населения Нижегородской области". Нижний Новгород. - 2002, - с.39-43.

9. Мавров И.И. Нарушение репродуктивной функции у больных урогенитальным хламидиозом и уреаплазмозом.//Вестник дерматологии. - 1992. - № 11, с.72-75.

10. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. - М.: - Мир, 1984. - 480 С.

11. Медицинские и лабораторные технологии. Справочник. Т.2. Ред. Карпищенко А.И. - Санкт Петербург. - Интермедика. - 1999. - 654 С.

12. Симакова М.Г. Внутриутробная инфекция.// Сборник науч. тр. - M., - 1994., - с.13-57.

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике негонококковых урогенитальных инфекций у детей. Сущность изобретения включает в определении у детей первых лет жизни возбудителей негонококковых урогенитальных инфекций Chlamydia trachomatis, Mycoplasma hominis Ureaplasma urealyticum, Cytomegalovirus, Herpes symplex I/II методом ПЦР одновременно в смеси 4-х субстратов: мочи, слюны, крови и слезного отделяемого от одного пациента. Преимущество изобретения заключается в повышении точности выявления возбудителей.

Способ обследования детей на наиболее значимые возбудители негонококковых урогенитальных инфекций с использованием метода ПЦР, отличающийся тем, что исследованию на выявление возбудителей (Chlamydia trachomatis, Mycoplasma hominis Ureaplasma urealyticum, Cytomegalovirus, Herpes symplex I/II) подвергают смесь четырех биологических субстратов - мочи, слюны, крови, слезного отделяемого от одного пациента.