Способ оценки морфофункциональных нарушений плаценты при мико- и уреаплазменных инфекциях Российский патент 2023 года по МПК G01N33/58 G01N1/30 C12Q1/686 

Изобретение относится к медицине, в частности к лабораторной диагностике, акушерству, неонатологии и педиатрии, может быть использовано для комплексной оценки морфофункциональных изменений в плаценте и ее инфицированности условно патогенной флорой (мико- и уреаплазменные агенты) с целью формирования групп риска по развитию внутриутробной инфекции плода, обоснования профилактики, этиологического лечения новорожденных и родильниц.

Несмотря на достигнутые успехи в акушерстве и перинатологии, серьезной причиной перинатальной и постнатальной заболеваемости и смертности [1], а также неблагоприятных отдаленных последствий для здоровья ребенка остаются внутриутробные инфекции (ВУИ). Сохраняющийся высокий уровень инфицированности урогенитального тракта и хронизации перинатально значимых инфекций у женщин репродуктивного возраста на современном этапе являются угрозой антенатальной или интранатальной передачи инфекционных возбудителей от матери к плоду и ребенку. Пути передачи различные, в том числе через плаценту. Изменения в плаценте носят на первых этапах адаптационный характер, в последующем приводят к нарушениям в системе мать-плацента-плод различной степени выраженности, к постнатальным осложнениям со стороны матери и ребенка.

Инфицированная плацента, например, ВПГ-1, ВПГ-2, ЦМВ, токсоплазмозом, приводит к формированию плацентарной недостаточности (ПН). Компенсированная ПН характеризуется устойчивостью регуляторных процессов, благоприятным течением беременности и состоянием новорожденного. При субкомпенсированном варианте появляются выраженные компенсаторно-приспособительные реакции в плаценте, что способствует удовлетворительному развитию плода и объясняет снижение его компенсаторных возможностей и ухудшенные перинатальные исходы. Декомпенсированная ПН проявляется слабыми компенсаторно-приспособительными изменениями и наличием патологических реакций, нарушением вариабельности сердечного ритма матери и плода, обусловленные тяжестью морфофункциональной дисфункции плаценты вследствие воспалительных изменений. В результате этого возможны неблагоприятные перинатальные исходы [2, 3].

Наряду с возбудителями «классических» инфекций, передаваемых половым путем, возрастает удельный вес заболеваний, вызванных условно-патогенными микроорганизмами, в том числе урогенитальными микоплазмами, которые могут присутствовать при физиологически протекающей беременности и плацентарной микробиоте с низкой биомассой [4]. Наибольшее клиническое значение имеют три вида микоплазм: Mycoplasma genitalium, Mycoplasma hominis и Ureaplasma urealyticum. Mycoplasma hominis и Ureaplasma species (Ureaplasma urealyticum + Ureaplasma parvum) могут являться причиной ряда заболеваний урогенитального тракта как у женщин на различном уровне от уретритов, вагинитов до эндометритов, так и у мужчин (уретриты, простатиты и др.). Mycoplasma hominis и Ureaplasma urealyticum могут являться этиологическим фактором невынашивания беременности, преждевременных родов, нарушения репродуктивной функции, случаев мертворождения [5, 6, 7, 8, 9, 10].

В связи с выше изложенным очевидна необходимость специального обследования родителей на этапах подготовки к беременности, на ранних сроках гестации, по показаниям в динамике для выявления случаев урогенитального микоплазмоза и последующей санации, а также исследование плаценты с целью наблюдения и улучшения качества жизни ребенка и женщины.

В литературе имеются отдельные данные по взаимосвязи перинатально значимых инфекций и изменений со стороны плаценты. Например, Луценко М.Т. и соавт. провели многочисленные исследования по воздействию различных инфекций на ворсинки плаценты (герпеса, RU 2370772 от 20.10.09; цитомегаловирусной инфекции, RU 2592244 от 20.07.16; RU 2597846 от 20.09.2016), их влияния на задержку формирования плаценты и развития эмбриона (RU 2657429 от 13.06.2018). Но работ подобного направления по оценке морфометрических показателей плаценты и ее инфицированности микоплазменными инфекциями недостаточно.

В работе Петровой М.Б. и соавт. 2017 [11] дана характеристика морфологическим изменениям в плацентах женщин (гистологический метод с помощью системы оптического тринокулярного микроскопа Olimpus CX-41, цифровой фотокамеры Olimpus E-330 и персонального компьютера с предустановленным морфологическим программным обеспечением ImageScopeL и BioVisionпри) при фетоплацентарной недостаточности и урогенитальных инфекциях во время беременности. Нарушения заключались в уменьшении количества кровеносных сосудов в стволовых и терминальных ворсинах, фибриноидное перерождение эпителия ворсин, стромы и стенок сосудов, отложения фибриноида со стороны межворсинчатого пространства, коллагенизация стромы, редукция объема межворсинчатого пространства, инфаркты, увеличение симпластических почек с признаками дистрофии, морфологическая незрелость плаценты, доминирование промежуточных ворсин. Выявленные изменения в плаценте были неспецифическими, но степень их выраженности и частота встречаемости отличалась в наблюдаемых группах. Данные, полученные при морфологическом исследовании плацент, свидетельствовали о роли инфекционного фактора в возникновении структурных изменений, характерных для фетоплацентарной недостаточности, что подтверждает негативное влияние инфекционных агентов матери на развитие плаценты, плода и новорожденного.

Представлены морфологические исследования плацент при различных путях инфицирования урогенитальными патогенами в работе Т.А. Синюковой и соавт., 2018 [12]. Диагностику возбудителей урогенитальных инфекций проводили методами бактериологического исследования, ДНК диагностики и иммунноферментного анализа (ИФА) у беременных женщин в срок 10–12 недель и после родоразрешения. Для морфологического исследования последов использовали стандартную методику. Однако вирусологической верификации в группах не выполняли. Достаточно большая доля встречаемости отведена уреа-, микоплазменным инфекциям в этиологически значимом титре. Дана оценка макроскопическим и морфологическим признакам инфицированной плаценты. Морфологические изменения в плаценте выявлялись в группе без инфицирования околоплодной среды и во всех группах с внутриутробным инфицированием. При этом на ранних этапах патологии плацентации определялись компенсаторно-приспособительные реакции, признаки инволюционно-дистрофических изменений формировались при продолжительном влиянии инфекции на плацентарную ткань.

Недостатками прототипов являются:

- изменения в плаценте при микоплазменных инфекциях носят преимущественно описательный, гистологический характер;

- отсутствие комплексной оценки по изменениям терминальных ворсин плаценты при мико- и уреаплазменных инфекциях, вирусологической верификации и морфометрии;

- при анализе показателей плаценты не учитывается титр микоплазменных возбудителей, что особенно важно при условно патогенной флоре.

Целью изобретения является повышение объективности и точности диагностики инфицированности плаценты условно патогенной флорой и ее морфологической реализации.

Задача изобретения: определить способ диагностики нарушений плаценты на основе микроморфометрических данных терминальных ворсин при мико- и уреаплазменных инфекциях.

Технический результат – повышение объективности и точности диагностики морфофункциональных нарушений плаценты при мико- и уреаплазменных инфекциях, с целью раннего обоснования своевременной этиопатогенетической коррекции у новорожденного и его матери.

Способ осуществляется следующим образом: обследованию подлежат плаценты от срочных и преждевременных родов (срок гестации 32-36 недель).

На первом этапе в образцах нефиксированного последа брали по кусочку плацентарной ткани с хориальной и базальной пластины, методом ПЦР выявляли геном микоплазм: Mycoplasma hominis (M.hom.), Ureaplasma species (Ureaplasma urealyticum + Ureaplasma parvum). Для исключения влияния других инфекционных агентов определяли ДНК, в том числе Mycoplasma genitalium (M.gen.), Cytomegalovirus (CMV), Herpes simplex virus, Herpes human virus 4 type (HHV-4), Herpes human virus 6 type, Chlamydia trachomatis, Parvovirus B19, Listeria monocytogenes, Streptococcus spp, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Haemophilus influenzae, Candida albicans. При получении положительного ответа на наличие Mycoplasma hominis (M.hom.), Ureaplasma species в изучаемых пробах выполняли их количественное определение методом real-time PCR, позволяющим оценить концентрацию ДНК в клиническом материале в геномных эквивалентах на 1 мл клинического образца (ГЭ/мл). Работу осуществляли с помощью набора реагентов, разработанных в ФБУН «ЦНИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора и ООО «Лаборатория Изоген» (г.Москва). Real-time PCR проводили на аппарате CFX96 Touch (Bio-Rad, США).

После макроскопического изучения последов из плодовой зоны плаценты вырезают фрагменты ткани, которые фиксируют в 10% нейтральном формалине. По общепринятой методике готовят парафиновые срезы, окрашивают их гематоксилином и эозином. Далее проводится гистологическое исследование микропрепаратов последа с морфометрической диагностикой, используя систему анализа изображения с помощью микроскопа «Carl Zeiss» и программы «Axio Imager». На фотографиях микропрепаратов плацент рассматривали 5 полей зрения с терминальными ворсинами (4-13 в каждом поле). С помощью программного обеспечения производили подсчет их количества, площадь, периметр, горизонтальный и вертикальный размеры.

Для раскрытия сущности изобретения приведены результаты исследования плацент (n=26) на инфицированность микоплазменными агентами и оценки морфометрических характеристик терминальных ворсин (таблица).

Таблица

Морфометрические показателей терминальных ворсин плаценты

при мико- и уреаплазменных инфекциях

1 группа
n=258 2 группа
n=272 Площадь, мкм² (µml) 3835,5±337,8
3498-4173 1830,4±116,8***
1714-1947 Вертикальный размер, мкм (µm) 67,25±3,04
64,2-70,3 47,18±1,54***
45,6-48,7 Горизонтальный размер, мкм (µm) 68,36±3,07
65,3-71,4 52,46±1,72***
50,7-54,2 Периметр, мкм (µm) 237,93±12,32
225,6-250,3 167,04±5,46***
161,4-172,5

Примечание: *** - p < 0,001 – достоверность различий между группами с титрами микоплазменных инфекций < 10⁴ и ≥ 10⁴.

Обследованные плаценты были разделены на 2 группы. В первую группу включены плаценты, у которых выделены моноинфекции (мико-/уреаплазмы) с титром < 104 (n=14). Вторую группу составили образцы плацент с диагностически значимым титром (≥ 104) этих же инфекций (n=12). Проведенная предварительная статистическая обработка показателей терминальных ворсин по отдельным подгруппам мико- и уреаплазмы с одинаковым диагностическим титром выявила отсутствие достоверной разницы, что позволило их объединить в изучаемые группы. Число исследуемых образцов составило в 1 группе – 258, во второй – 272, что, в том числе, способствовало высокой статистической достоверности данных.

Полученные данные свидетельствуют, что при верификации в плаценте мико-/уреаплазм (Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum, Ureaplasma parvum) в виде моноинфекций с диагностически значимым титром (≥ 10⁴) с высокой долей достоверности имеют место морфометрические нарушения в данном органе (рис.1, 2) в виде снижения средних показателей площади терминальных ворсин до 1830,4±116,8 мкм², вертикального 47,18±1,54 мкм, горизонтального 52,46±1,72 мкм размеров и их периметра 167,04±5,46 мкм (p <0,001 для всех показателей) в сравнении с характеристиками результатов первой группы в 2,1 раза, 1,4 раза, 1,3 раза и 1,4 раза соответственно.

Преимущества предлагаемого способа:

1. высокая информативность за счет используемых методик диагностики;

2. выявление изменений микроморфометрии терминальных ворсин при условно патогенной флоре (мико- и уреаплазменные инфекции) в зависимости от титра возбудителей;

3. использование референтных значений терминальных ворсин плаценты для раннего формирования групп риска патологии новорожденных по внутриутробной инфекции;

4. учет вирусологических и морфометрических показателей характеристики плаценты и клинических проявлений при этиопатогенетическом обосновании лечебно-профилактических мероприятий у новорожденных и родильниц;

5. возможность использования комплексного метода оценки плаценты врачами общей практики.

Положительный эффект: улучшение качества медицинской помощи новорожденным и родильницам при выявлении мико-, уреаплазменных инфекций и морфометрических изменений в плаценте на ранних этапах обследования.

Пример №1. Пациентка Ф., 21 года. Беременность 1-я. Особенности течения беременности: угроза прерывания в 1-2-м триместрах, выявлена урогенитальная инфекция (Mycoplasma hominis), хроническая плацентарная недостаточность, декомпенсированная. Роды преждевременные, самопроизвольные, острое нарушение ПМК, раннее излитие околоплодных вод на сроке 30 недель. Характеристика плаценты: масса - 254 г, аномалия развития, выраженные явления хориоамнионита, децидуита, кровоизлияния, оболочки тусклые. Гистологическое обследование плаценты: нарушение созревания ворсин, псевдоинфаркты, наличие инфильтратов в оболочках, кровоизлияния, гипоплазия плаценты. Вирусологическое обследование плаценты методом ПЦР и real-time PCR: Mycoplasma hominis, в титре 1х10⁶ ГЭ/мл. Морфометрические показатели терминальных ворсин плаценты: площадь - 1643,5±102,8 мкм², вертикальный 44,51±1,54 мкм, горизонтальный 49,85±1,54 мкм размеры, периметр - 156,9±5,32 мкм.

Заключение. Выявлена инфицированность плаценты в виде моноинфекции M.hominis с диагностически значимым титром ≥ 10⁴ (1х10⁶ ГЭ/мл), морфометрические нарушения в плаценте в виде выраженного снижения средних показателей площади терминальных ворсин, вертикального, горизонтального размеров, периметра, что соответствовало значениям 2-й группы исследования. Исход беременности: родился ребенок с массой тела 1200 г, оценка по шкале Апгар 6-7 баллов через 1-5 мин., состояние ближе к тяжелому, пневмония, синдром задержки развития плода.

Пример №2. Пациентка Ш., 33 года. Беременность 2-я, 1 медицинский аборт. Особенности течения беременности: угроза прерывания во 2-м триместре, хроническая плацентарная недостаточность, субкомпенсированная. Роды преждевременные, самопроизвольные, раннее излитие околоплодных вод на сроке 36 недель. Характеристика плаценты: масса - 509 г, явления хориоамнионита, децидуита, оболочки тусклые. Гистологическое обследование плаценты: нарушение созревания ворсин, ветвления, наличие инфильтратов в оболочках. Вирусологическое обследование плаценты методом ПЦР и real-time PCR: Обследование плаценты на инфекцию методом ПЦР и real-time PCR: Ureaplasma urealyticum в титре 9х10³ ГЭ/мл. Морфометрические показатели терминальных ворсин плаценты: площадь - 3299,5±201,8 мкм², вертикальный 62,87±1,54 мкм, горизонтальный 63,85±1,54 мкм размеры, периметр - 212,98±12,32 мкм.

Заключение. Выявлена инфицированность плаценты в виде моноинфекции Ureaplasma urealyticum с титром <10⁴ (9х10³ ГЭ/мл), морфометрические изменения в терминальных ворсинках плаценты (площадь, вертикальный, горизонтальный размеры, периметр) соответствовали данным 1-й группы. Исход беременности: ребенок родился с массой тела 2520 г, оценка по шкале Апгар 8-9 баллов через 1-5 мин., синдром задержки развития плода.

Таким образом, приведенные примеры показали значимость комплексной оценки морфофункциональных изменений в плаценте с учетом ее инфицированности условно патогенными возбудителями (мико- и уреаплазменными инфекциями), что имеет значение для формирования групп риска по ВУИ у детей, своевременного обоснования методов лечения, профилактики детской и материнской постнатальной заболеваемости.

Список литературы:

1. Нисевич Л.Л., Талалаев А.Г., Каск Л.Н., Адиева А.А., Кущ А.А., Парсегова Т.С., Фомина В. Л., Коноплева Т. Н. Вирусная инфекция среди причин мертворождения по материалам аутопсии и вирусологических исследований // Детские инфекции. 2011. №2. С. 8-14.

2. Новикова О.Н., Мустафина Л.Р., Ушакова Г.А., Логвинов С.В. Перинатальные исходы при инфицированной плаценте // Мать и дитя в Кузбассе. 2015. №2. С. 14-18.

3. Синюкова Т.А., Коваленко Л.В., Каспарова А.Э., Мордовина И.И. Микробиологические и морфологические параллели при восходящем инфицировании последа // Вестник Смоленской государственной медицинской академии. 2020. №2. С. 97-105 DOI: 10.37903/vsgma.2020: 2.13.

4. Zakis D.R, Paulissen E., Kornete L., Kaan A.M.M., Nicu E.A., Zaura E. The evidence for placental microbiome and its composition in healthy pregnancies: A systematic review. // J Reprod Immunol. 2022 Vol.149. P.103455. doi:10.1016/j.jri.2021.103455

5. Мельникова Т.А., Падруль М.М., Горовиц Э.С., Работникова Г.И. Анализ течения беременности у женщин, инфицированных Ur. Urealyticum, в зависимости от степени колонизации генитального тракта // Пермский медицинский журнал. 2017. №2. С. 26-30.

6. Viscardi R.M. Ureaplasma species: role in neonatal morbidities and outcomes. // Arch Dis Child Fetal Neonatal Ed. 2014 Vol. 99(1). Р. 87-92. doi: 10.1136/archdischild-2012-303351. Epub 2013 Aug 19. PMID: 23960141; PMCID: PMC4239122.

7. Sweeney E.L., Dando S.J., Kallapur S.G., Knox C.L. The Human Ureaplasma Species as Causative Agents of Chorioamnionitis. // Clin Microbiol Rev. 2016. Vol.14; 30(1). Р. 349-379. doi: 10.1128/CMR.00091-16.

8. Sprong K.E., Mabenge M., Wright C.A., Govender S. Ureaplasma species and preterm birth: current perspectives. // Crit Rev Microbiol. 2020. Vol. 46(2). Р. 169-181. doi: 10.1080/1040841X.2020.1736986.

9. Noda-Nicolau N.M., Tantengco O.A.G., Polettini J., Silva M.C., Bento G.F.C., Cursino G.C., Marconi C., Lamont R.F., Taylor B.D., Silva M.G., Jupiter D., Menon R. Genital Mycoplasmas and Biomarkers of Inflammation and Their Association With Spontaneous Preterm Birth and Preterm Prelabor Rupture of Membranes. // A Systematic Review and Meta-Analysis. Front Microbiol. 2022. Vol. 30; 13. Р. 859732. doi: 10.3389/fmicb.2022.859732.

10. Ghanchi N.K., Ahmed I., Kim J., Harakuni Sh., Somannavar M.S., Zafar A., Tikmani Sh. S., Saleem S., Goudar S.S., Dhaded S.M., Guruprasad G., Yogeshkumar S., Hwang ., Aceituno A., Silver R.M., McClure E.M., Goldenberg R.L. Pathogens Identified by Minimally Invasive Tissue Sampling in India and Pakistan From Preterm Neonatal Deaths: The PURPOSE Study. // Clinical Infectious Diseases. 2022. ciac747. https://doi.org/10.1093/cid/ciac747

11. Петрова М.Б., Харитонова Е.А., Павлова Н.В., Костюк Н.В. Морфологические изменения плаценты женщин при фетоплацентарной недостаточности и урогенитальных инфекциях в анамнезе. // Современные проблемы науки и образования. 2017. № 3.

12. Синюкова Т.А., Каспарова А.Э., Стародумова В.А. Особенности морфологических изменений плацентарной ткани при восходящем, гематогенноми смешанном путях инфицирования. // Вестник СурГУ. Медицина. 2018. №1 (35). С. 69-74.

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике, акушерству, неонатологии и педиатрии, и может быть использовано для оценки морфофункциональных нарушений плаценты при мико- и уреаплазменных инфекциях. В образцах нефиксированного последа методом ПЦР определяют геном микоплазм Mycoplasma hominis и уреаплазм Ureaplasma urealyticum и Ureaplasma parvum с исключением других перинатально значимых инфекций в первые часы после рождения. Проводят морфометрию терминальных ворсин плаценты в 5 полях зрения с определением площади, вертикального, горизонтального размеров и периметра. При титре ≥ 10⁴ ГЭ/мл мико-/уреаплазменных инфекций и снижении показателей площади до 1830,4±116,8 мкм², вертикального 47,18±1,54 мкм, горизонтального 52,46±1,72 мкм размеров и периметра 167,04±5,46 мкм терминальных ворсин оценивают морфофункциональные нарушения плаценты. Способ обеспечивает повышение объективности и точности диагностики морфофункциональных нарушений плаценты при мико- и уреаплазменных инфекциях за счет комплексной оценки морфофункциональных изменений в плаценте с учетом ее инфицированности условно патогенными возбудителями. 2 ил., 1 табл., 2 пр.

Способ оценки морфофункциональных нарушений плаценты при мико- и уреаплазменных инфекциях, заключающийся в определении генома микоплазм Mycoplasma hominis и уреаплазм Ureaplasma urealyticum и Ureaplasma parvum в образцах нефиксированного последа методом ПЦР с исключением других перинатально значимых инфекций в первые часы после рождения, после чего количественно определяют концентрацию ДНК этих инфекций в геномных эквивалентах на 1 мл клинического образца (ГЭ/мл) методом real-time PCR, проводят морфометрию терминальных ворсин плаценты в 5 полях зрения с определением площади, вертикального, горизонтального размеров и периметра, и при титре ≥ 10⁴ ГЭ/мл мико-/уреаплазменных инфекций и снижении показателей площади до 1830,4±116,8 мкм², вертикального 47,18±1,54 мкм, горизонтального 52,46±1,72 мкм размеров и периметра 167,04±5,46 мкм терминальных ворсин оценивают морфофункциональные нарушения плаценты.